申请/专利权人：凯莱英医药集团(天津)股份有限公司;凯莱英生命科学技术(天津)有限公司;天津凯莱英制药有限公司;凯莱英医药化学(阜新)技术有限公司;吉林凯莱英医药化学有限公司

申请日：2016-10-11

公开（公告）日：2021-01-12

公开（公告）号：CN106497996B

主分类号：C12P17/10(20060101)

分类号：C12P17/10(20060101);C12P17/12(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.12#授权;2017.04.12#实质审查的生效;2017.03.15#公开

摘要：本发明公开了一种手性醇的酶催化制备方法，包括：将前手性酮化合物与本发明提供的酮还原酶、辅酶混合，控制体系pH和温度，进行还原反应。本发明提供的酮还原酶用于由前手性酮化合物不对称还原制备手性醇具有较高的转化率和立体选择性，产物的纯度高于95.0％，ee值可高于99％。本发明提供的手性醇的酶催化制备方法，反应步骤简单，缩短生产周期，节约生产成本；反应条件温和，收率高，工艺条件稳定，反应较安全，操作简单，具备规模化生产的能力；对环境友好，减少了有机溶剂对环境的污染。

主权项：1.一种手性醇的酶催化制备方法，所述方法包括：将前手性酮化合物与酮还原酶、辅酶混合，进行还原反应，得到手性醇；反应路线如下： 其中，R1为H；R2选自：H或氨基保护基团；n为1；m为1或2；所述的酮还原酶的序列是如SEQIDNO.：1或SEQIDNO.：2所示的氨基酸序列；其中，当所述酮还原酶为SEQIDNO.：1的氨基酸序列时，所述前手性酮化合物为N-苄氧羰基-3-吡咯烷酮或N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮；当所述酮还原酶为SEQIDNO.：2的氨基酸序列时，所述前手性酮化合物为N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮。

全文数据：手性醇的酶催化制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物催化技术领域，具体涉及一种手性醇的酶催化制备方法，特别是一种环状手性醇的酶催化制备方法。背景技术[0002]手性醇是一类手性碳上连有羟基的旋光性化合物，广泛用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。手性醇的合成方法主要包括物理分离法、拆分法及不对称还原法。其中，化学拆分常用酒石酸等拆分剂进行多次拆分，所得产物化学纯度可达到99%以上，但其缺点就是拆分收率极低，只有不到10%;另外，手性拆分剂价格较高，大大地增加了生产成本;操作较为复杂，且后处理不利用环境保护。利用酮类化合物的不对称还原合成手性醇的方法是目前生产手性醇的一种重要方法，其理论产率可高达100%，包括化学不对称还原法和生物不对称还原法。其中，化学不对称还原法主要是利用手性金属配合物作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已部分用于工业生产，但是该反应过程需要高压加氢、手性金属配合物合成复杂并且价格昂贵，产物中存在重金属的残留导致产物分离困难，环境污染较大，应用受到一定的限制;而生物催化不对称还原法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，避免了产物中的重金属残留，对环境友好，弥补了化学方法的不足，是一种绿色高效经济的方法。用于不对称还原的生物催化剂主要包括微生物全细胞和氧化还原酶，如专利申请CN201510026759.1公开了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌BurkholderiagladioliZJB-12126的羰基还原酶，并以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，用于不对称还原前手性羰基化合物之类手性醇；如专利CN201010599376·0公开了一种来源于天蓝色链霉菌（StreptomycescoelicolorA3[2]NRRLB-16638的氧化还原酶作为羰基还原酶催化剂用于不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇;酶法还原具有比全细胞催化产物选择性更高、反应易处理等优点。发明内容[0003]为克服现有技术的不足，本发明提供一种手性醇的酶催化制备方法，所述方法包括:将前手性酮化合物与酮还原酶、辅酶混合，进行还原反应，得到手性醇；[0004]反应路线如下：[0006]其中，Ri选自：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或心与其所连接的杂环形成稠环体系；[0007]R2选自：Η或氨基保护基团；[0008]η为0-3的整数；[0009]m为0-5的整数，且η不等于m+1;[0010]优选的，Ri选自：H、C1-C8的取代或未取代的直链烷基、C5-C10的取代或未取代的环烷基、C6-C12的取代或未取代的芳基、C5-C12的取代或未取代的杂环基，或心与所连接的杂环形成稠环体系;更优选的，R:选自：H、C1-C3的取代或未取代的直链烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基，或与所连接的杂环形成稠环体系；[0011]优选的，所述的氨基保护基团优选自：Ms、Ts、甲酰基、乙酰基、卤代乙酰基如Tfa、苯甲酰基、13〇：、^2、厶11〇3、?]\03、1311、1'1'1:、〇11113;更优选自：13〇3、^2、1311、乙酰基、苯甲酰基；[0012]优选的，η为0-2的整数，更优选为0、1、2;[0013]优选的，m为0-3的整数，更优选为0、1、2、3;[0014]在本发明的一个优选实施例中，所述的办为!1，η为1，m为1或2。[0015]在本发明的一个实施例中，所述心为!1，所述的制备方法还包括氨基上保护的步骤。[0016]优选的，所述的酮还原酶具有：[0017]a如SEQIDN0.:l或SEQIDN0.:2所示的氨基酸序列；或，[0018]b与SEQIDN0.:l或SEQIDN0.:2所示的氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少98%的同一性且具有酮还原酶活性的氨基酸序列；[0019]更优选的，b所述的氨基酸系列可为a所述的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后获得的氨基酸序列或其突变体。[0020]优选的，所述的酮还原酶用量为〇.05-1.Ogg前手性酮;更优选为0.10-0.60gg前手性酬；[0021]优选的，所述的辅酶的用量为0.001-0.030gg前手性酮;更优选为0.001-0.020gg前手性酮；[0022]优选的，所述的还原反应的pH为6.0-8.0;更优选为7.0;[0023]优选的，所述的还原反应的温度为20-50°C;更优选为20-40°C;进一步优选为25-35。。；[0024]优选的，所述的反应时间为10_50h;更优选为15_40h;[0025]优选的，所述前手性酮化合物均匀分散于缓冲液中；所述的缓冲液的pH优选为6.0-8.0，更优选为7.0;更优选的，所述的缓冲液用量为10-100mLg前手性酮;在本发明的一个实施例中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液；[0026]优选的，所述的反应混合物中还包括辅酶再生体系；[0027]本领域技术人员可知，所述的辅酶再生体系用于把辅酶从氧化态再生为还原态，或从还原态再生为氧化态，从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平，其主要包括化学、光化学、酶学和电化学等再生体系，其中酶法再生较为常用，如底物耦联法、酶耦联法。本发明的手性醇的制备反应为其中，当采用底物耦联法时，辅酶再生体系包括辅助底物，所述的酶π为上述酮还原酶，即所述酮还原酶可同时催化目标底物和辅助底物的同时转化，实现辅酶的再生;采用酶耦联法时，辅酶再生体系包括酶Π和辅助底物，所述的酶Π与上述酮还原酶不同，酶Π催化辅助底物转化的同时实现辅酶再生。[0028]优选的，所述的辅酶再生体系包括酶Π和辅助底物，所述的酶Π与上述酮还原酶相同或不同；[0029]在本发明的一个实施方式中，所述的酶Π与上述酮还原酶不同，选自：甲酸脱氢酶ΠΗ、葡萄糖脱氢酶GDH、醇脱氢酶ADH;更优选为ΠΗ或GDH;更优选的，上述的辅酶再生体系选自：FDH和甲酸、FDH和甲酸铵、GDH和葡萄糖;优选的，所述的酶Π的用量为0.001-0.05gg前手性酮，和或，所述的辅助底物的用量为l-5molmol前手性酮，更优选为l-3molmol前手性酬；[0030]在本发明的一个优选实施例中，所述的辅酶再生体系包括葡萄糖、GDH。[0031]在本发明的另一个实施方式中，所述的酶Π与上述酮还原酶相同，即所述的酶Π为上述酮还原酶，其也可催化辅助底物反应，实现辅酶再生，所述辅助底物为醇，优选自：异丙醇、异丁醇;更优选为异丙醇。[0032]反应所需辅酶为还原型辅酶，优选为NADH或NADPH;更优选为NADH;[0033]但还原型辅酶如NADH，其稳定性差，且价格贵，在本发明的一个实施例中，所述的反应中添加氧化型辅酶如NAD+，通过辅酶再生体系如葡萄糖+葡萄糖脱氢酶循环氧化型辅酶如NAD+生成相应的还原型辅酶如NADH，供上述手性醇的制备反应使用。[0034]优选的，所述的方法还包括分离纯化步骤:反应完毕后体系用硅藻土过滤，有机溶剂萃取，有机相干燥，过滤，浓缩，纯化得到手性醇产品；[0035]优选的，所述的硅藻土的用量为5-50gg前手性酮；[0036]优选的，所述的有机溶剂为本领域萃取常用的有机溶剂，本发明对其种类不作限定，所述有机溶剂的用量为10_80mLg前手性酮；[0037]优选的，所述的纯化采用柱层析纯化，更优选的，所述的，所述的柱层析纯化中硅胶的用量为5_20gg前手性酮，洗脱液优选为乙酸乙酯石油醚=1:20，洗脱液用量优选为10-80mLg前手性酮。[0038]本发明还提供一种上述制备方法在化学合成中的应用。[0039]本发明提供的酮还原酶是在200多种酮还原酶及乙醇脱氢酶中筛选出来的，用于由前手性酮化合物不对称还原制备手性醇具有较高的转化率和立体选择性，产物的纯度高于95.0%，ee值可高于99%。本发明提供的手性醇的酶催化制备方法，反应步骤简单，一步得到单一构型的环状手性醇化合物，提高了整体收率，缩短生产周期，节约生产成本，反应条件温和，收率高，工艺条件稳定，反应较安全，操作简单，具备规模化生产的能力，对环境友好，减少了有机溶剂对环境的污染。具体实施方式[0040]术语解释[0041]在本发明中，Ms为甲磺酰基Ts是对甲苯磺酰基[0042]术语"任选任意"或"任选地任意地"是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，根据下文的定义，"任选取代的烷基"是指"未取代的烷基"（未被取代基取代的烷基或"取代的烷基"（被取代基取代的烷基）。[0043]本文所用Cl-Cn包括：142、：1-〇3、：1-〇1。举例而言，所述"：1-〇4"基团是指该部分中具有1-4个碳原子，即基团包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子或4个碳原子。[0044]本文单独或组合使用的术语"烷基"是指任选取代的直链或任选取代的支链的脂肪族烃类。本文的"烷基"优选可具有1-20个碳原子，例如具有1-10个碳原子，具有1-8个碳原子，或1-6个碳原子，或1-4个碳原子或1-3个碳原子。本文单独或组合使用的术语"烷氧基"是指烷基醚基〇-烷基），烷氧基的非限定性实施例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。[0045]本文单独或组合使用的术语"卤代"或"卤素取代"是指任选被取代的基团（如烷基、烯基和炔基的其中一个或多个氢原子被替换成氟、氯、溴、碘原子或其组合。[0046]本文单独或组合使用的术语"芳香基芳基"是指任选取代的芳香烃基，其具有6至20个，如6-12个或6-10个成环碳原子。其可以是稠合芳环或非稠合芳环。[0047]本文单独或组合使用的术语"杂芳基"是指任意取代的一价杂芳基，其包含5至20个，如5至12个或5至10个骨架成环原子，其中一个或多个如1-4个、1-3个、1-2个成环原子为杂原子，所述杂原子独立地选自氧、氮、硫、磷、硅、硒和锡中的杂原子，但不限于此。所述基团的环不包含两个相邻的〇或S原子。杂芳基包括单环杂芳基或多环杂芳基例如双环杂芳基、三环杂芳基等）。[0048]本文单独或组合使用的术语"杂环"或"杂环基"是指非芳香杂环，包括杂环烷基和杂环烯基。其中一个或者多个如1-4个、1-3个、1-2个成环的原子是杂原子，如氧、氮或硫原子。杂环基可以包括单环杂环基（杂环基具有一个环）或多环杂环基（例如，双环杂环基杂环基具有两个环）、三环杂环基等）。[0049]本文单独或组合使用的术语"碳环基"是指非芳香族的碳环，包括环烷基和环烯基。环烷基可以是单环环烷基或多环环烷基例如，有2、3或4个环；如双环环烷基），其可以是螺环或桥环。碳环基可以具有3至20碳原子，例如具有3-15个成环碳原子或3-10个成环碳原子或3-6个成环碳原子，并可以具有0、1、2或3个双键和或0、1或2个三键。例如具有3-8个或3-6个成环碳原子的环烷基。[0050]"卤素"是指氟、氯、溴、碘，优选氟、氯和溴。氰基是指"-CN"；羟基是指"-OH"；疏基是指"-SH"；氨基是指"-懸"。[0051]术语"被取代的"意思是在一个特定的原子上一个或更多的氢被指定的基团所替代，如果指定的原子的正常化合价在现有的情况下没有超出，那么取代后结果是一个稳定的化合物。[0052]通过利用本发明的上述具有高度立体选择性的酮还原酶得到的其修饰物、功能等同物、功能片段或变体且可以用于不对称还原合成手性纯度较高的醇类化合物的，也在本发明的保护范围内。[0053]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0054]实施例1[0056]1投料：向5L反应釜中，加入125g主原料Ν-苄氧羰基-3-吡咯烷酮，2.25L磷酸盐缓冲液100mmolL，pH=7.0，N-苄氧羰基-3-吡咯烷酮均匀分散于磷酸盐缓冲液中；[0057]2加酮还原酶：向5L反应釜中，加入2g辅酶NAD+，290g葡萄糖，25g酮还原酶主酶GcKR和Ο·125g葡萄糖脱氢酶⑶H，体系pH=7·Ο;[0058]⑶反应:体系于25°C反应，搅拌反应36h;[0059]4后处理:体系用lkg硅藻土过滤，2L乙酸乙酯萃取，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，经柱层析纯化，用500g硅胶，2L洗脱液乙酸乙酯：石油醚=1:20淋洗，纯化得到106.16g纯度较高的产品，纯度95.37%，收率81%，ee值99.2%，MSM+H+=222.10。[0060]实施例2[0062]1投料：向500mL锥形瓶中，加入12.5g主原料N-苄氧羰基-3-吡咯烷酮，225mL磷酸盐缓冲液100mm〇lL，pH=7.0，N-苄氧羰基-3-吡咯烷酮均匀分散于磷酸盐缓冲液中；[0063]2加酮还原酶：向500mL锥形瓶中，加入0.2g辅酶NAD+，29g葡萄糖，2.5g酮还原酶主酶KRED来源如下表所示和12.5mg葡萄糖脱氢酶⑶H，体系pH=7.0;[0064]⑶反应:体系于30°C反应，搅拌反应36h;[0065]⑷后处理:体系用100g硅藻土过滤，200mL乙酸乙酯萃取，静置分液，经气相检测。[0066]检测结果如表1所示，使用上述酮还原酶的反应体系中剩余大量原料，没有产品生成，转化率均为〇，可见并非所有酮还原酶均适用于本发明的手性醇制备反应。[0067]表1酮还原酶的来源及转化率结果[0069]实施例3[0071]1投料：向200L反应釜中，加入2kg主原料N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，120L磷酸盐缓冲液100mM，pH=7.0，N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮均匀分散于磷酸盐缓冲液中；[0072]2加酮还原酶：向200L反应釜中，加入15.0g的辅酶NAD+，2.2kg的葡萄糖，lkg酮还原酶主酶ZrKRs和0.02kg葡萄糖脱氢酶⑶H，体系pH=7.0;[0073]3反应:体系于30°C反应，搅拌反应24h;[0074]4后处理：体系用60kg硅藻土过滤，120L乙酸乙酯萃取，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，经柱层析纯化，用20kg硅胶，100L洗脱液乙酸乙酯:石油醚=1:20淋洗，纯化得到1.726kg纯度较高的产品，纯度95.0%，收率82%，ee值99.5%，MSM+H+=201.14。[0075]实施例4[0077]1投料：向250ml锥形瓶中，加入2g主原料N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和6ml的异丙醇，40ml磷酸盐缓冲液50mmolL，pH=7.0，使底物均匀分散于缓冲液中；[0078]2加酮还原酶:继续向锥形瓶中加入0.0lg的辅酶NAD+，0.3g酮还原酶GcKR，体系pH=7.0；[0079]3反应:体系于200rpm摇床中反应，并于30±3°C保温20h;[0080]⑷后处理:体系用40g硅藻土过滤，60ml二氯甲烷萃取，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，再经柱层析纯化得到1.82g纯度较高的产品（S-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，纯度93·26%，收率84·86%，ee值99%，MSM+H+=201·14〇[0081]由此可见，本发明中公开的酮还原酶可将酮类化合物还原，得到较高ee值的手性醇产品，ee值可达95%-99.5%，收率高于80%，合成方法采用的工艺条件稳定，反应条件温和，整个生产过程中操作简单、污染较低，为不对称还原酮类化合物获得环状手性醇提供了一种新的思路和方法。[0082]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种手性醇的酶催化制备方法，所述方法包括:将前手性酮化合物与酮还原酶、辅酶混合，进行还原反应，得到手性醇；反应路线如下：其中，Ri选自：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或心与其所连接的杂环形成稠环体系；R2选自：Η或氨基保护基团；η为0-3的整数；m为0-5的整数，且η不等于m+1。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，Ri选自：Η、Cl-C3的取代或未取代的直链烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基，或R:与所连接的杂环形成稠环体系；和或，所述的氨基保护基团优选自：Ms、Ts、甲酰基、乙酰基、卤代乙酰基如Tfa、苯甲酰基、Boc、Cbz、Alloc、PMB、Bn、Trt、Dmb;和或，η为0-2的整数；m为0-3的整数。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的办为!1，11为l，m为1或2。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述办为!1，所述的制备方法还包括氨基上保护的步骤。5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的酮还原酶具有：a如SEQIDΝΟ.:1或SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列；或，b与SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少98%的同一性且具有酮还原酶活性的氨基酸序列。6.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的酮还原酶用量为0.05-l.〇gg前手性酮;和或，所述的辅酶的用量为〇.001-0.030gg前手性酮;和或，所述的还原反应的pH为6.0-8.0;和或，所述的还原反应的温度为20-50°C;和或，所述的反应时间为10_50h;和或，所述前手性酮化合物均匀分散于缓冲液中；和或，所述的反应混合物中还包括辅酶再生体系。7.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶再生体系包括酶Π和辅助底物，所述的酶π与所述酮还原酶相同或不同。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的酶Π与上述酮还原酶不同，选自：甲酸脱氢酶FDH、葡萄糖脱氢酶GDH、醇脱氢酶ADH;和或，所述的酶Π的用量为0.001-0.05gg前手性酮;和或，所述的辅助底物的用量为l-5molmol前手性酮;或，所述的酶Π为所述酮还原酶，所述辅助底物为醇。9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶再生体系包括葡萄糖和⑶H，或，异丙醇。10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述辅酶为还原型辅酶;或，所述的反应中添加氧化型辅酶，通过辅酶再生体系循环氧化型辅酶生成还原型辅酶。

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