申请/专利权人：上海大学

申请日：2017-12-06

公开（公告）日：2021-01-12

公开（公告）号：CN108034743B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.12#授权;2018.06.08#实质审查的生效;2018.05.15#公开

摘要：本发明涉及一种用于检测玉米Dek6基因的特异性引物及其应用。该特异性引物扩增dek6基因DNA片段的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：TGGCATACATCCCACTACAGAGCA；反向引物从5′端至3′端为：ATGATCTGAGCACAACGATCTCCGA。利用这个与Dek6基因完全连锁的分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中Dek6基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用Dek6基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

主权项：1.一种用于检测玉米Dek6基因的特异性引物在检测和区分籽粒缺陷的玉米Dek6纯合突变体与野生型自交系Mo17、9801、综3、黄早4和郑58以及它们杂交子代的籽粒类型中的应用，其特征在于，用于检测玉米Dek6基因的特异性引物的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：TGGCATACATCCCACTACAGAGCA；反向引物从5′端至3′端为：ATGATCTGAGCACAACGATCTCCGA。

全文数据：用于检测玉米Dek6基因的特异性引物及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种用于检测玉米Dek6基因的特异性引物及其应用。技术背景[0002]玉米ZeamaysL.属于禾本科蜀黍属玉米种，为一年生草本植物，起源于中美洲地区，是世界上最主要的粮食作物之一，同时也是重要的工业原料和能源作物。在我国的栽培历史大约有470多年。随着世界经济的发展，作为食品、饲料和燃料的重要来源，玉米的需求量不断在增加，同时也是我国今后一个时期消费需求增长最快的农作物。近年来，玉米深加工业能迅速发展，对畜牧业和养殖业的发展展现出了举足轻重的作用，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。[0003]籽粒是玉米主要营养物质合成和储藏的器官，且籽粒大小和饱满程度与玉米的产量息息相关。因此，开展控制籽粒大小及胚乳发育相关基因突变体的研究具有重要理论和应用价值。玉米籽粒含有丰富的淀粉、蛋白和油脂等营养物质，分别占其干重的70-75%、8_10%和4-5%。淀粉和蛋白成分主要存储于胚乳中，因此胚乳是玉米籽粒的重要结构，直接决定玉米的经济价值。在影响籽粒大小和形状的突变体中，常见的表型为籽粒缺陷的defectivekerneldek突变体、轩粒塌陷的collapsedkernel突变体、轩粒皱缩的shrunkenkernel突变体以及小籽粒的smallkernel突变体。目前，研究者们已经成功克隆并解析了多个上述表型的玉米籽粒突变体。Miniaturel，负责编码细胞壁果糖苷酶，该基因突变后形成小籽粒;Emptypericarp2Emp2编码一个热激应答的负调控蛋白，产生皱缩、塌陷及扁平的籽粒；CRINKLY4CR4，编码一种受体激酶影响糊粉层细胞的发育命运；DefectivekernelDekl编码一个f丐离子基因超家族的膜蛋白，通过影响玉米糊粉层的发育而导致缺陷型籽粒的形成;SmallkernelIsmkl则通过阻断线粒体基因nad7的编辑影响线粒体正常组装与功能，进而对胚的发育产生影响；而拟南芥SLOWGR0WTH3SL03也通过调控线粒体nad7内含子2的剪接削弱线粒体功能，并最终影响植株与种子的生长发育；SupernumeraryaleuronelayersSail编码一个E类型液泡分选蛋白负调控玉米糊粉层的发育从而形成缺陷型籽粒。[0004]为了提高玉米品质，国内外科研人员利用生物学的方法对玉米的品质进行大量的试验摸索和改造尝试。其基本原理是，以玉米中一些籽粒的突变体为材料，运用分子生物学和遗传学方法对其进行相关基因的克隆和研究，从而借助遗传学的手段提高其营养价值。[0005]Defectivekernel6简称dek6是一个典型的籽粒发育缺陷型的突变体。对dek6突变体的遗传学分析表明：dek6是单基因的隐性突变，能够引起玉米的皱缩、塌陷且不透明的小籽粒。籽粒储藏物质生化分析结果表明：与野生型相比，dek6的淀粉和醇溶蛋白积累均有显著变化特别是非醇溶蛋白含量显著增加可能直接决定了玉米籽粒的储藏物质积累及营养价值。储藏蛋白直接决定了玉米籽粒蛋白的含量，而醇溶蛋白是籽粒中最主要的储减蛋白。[0006]DNA分子标记辅助育种技术的关键是：（1获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本纯合Dek6类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代Fl代）的共显性标记；2获得的共显性分子标记与控制目标性状基因的连锁情况，连锁越紧密在其后代中错选的概率越低，如果该标记来源于控制目标性状基因，则利用该分子标记在其后代中错选的概率为零；（3该标记可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。但是，以往研究中并没有获得位于Dek6基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记，故无法对该基因所控制的目标性状进行DNA分子标记辅助选择。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对玉米品质相关基因Dek6进行DNA分子标记辅助育种的基础。发明内容[0007]本发明的目的之一在于提供一种用于检测玉米Dek6基因的特异性引物。[0008]本发明的目的之二在于提供该特异性引物在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。[0009]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：[0010]一种用于检测玉米Dek6基因的特异性引物，其特征在于该特异性引物的碱基序列为：[0011]正向引物从5'端至3'端为:TGGCATACATCCCACTACAGAGCA;[0012]反向引物从5'端至3'端为:ATGATCTGAGCACAACGATCTCCGA。[0013]一种上述的用于检测玉米Dek6基因的特异性引物在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。[0014]一种上述的用于检测玉米Dek6基因的特异性引物在检测和区分野生型自交系M〇17、9801、综3、黄早4和郑58类型以及它们杂交子代类型中的应用。[0015]本发明利用籽粒缺陷的玉米Dek6Dek6Dek6与其他具优良性状的玉米杂交获得Fl代，Fl代自交后筛选具有目的性状的籽粒缺陷的玉米F2，F2代多次自交，最终获得稳定的纯合体。[0016]本发明提供1个位于Dek6基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记，以及利用这个共显性DNA分子标记对Dek6基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中Dek6基因的存在与否以及杂合或纯合状态。利用这个分子标记能区分突变体与国内10种主要育种亲本，能够在任何育种背景群体中准确检测到Dek6基因的存在。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用Dek6基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。附图说明[0017]图1是dek6突变体和野生型籽粒的淀粉含量变化图；[0018]图2是玉米籽粒野生型++;[0019]图3是玉米籽粒纯合突变体外形图（dek6dek6;[0020]图4是用于dek6基因克隆的F2群体构建路线；[0021]图5是标记dCAPS在W22背景F2群体中的分离情况，其中1一3为++纯合体;4一6为dek6+杂合体;7—9为dek6dek6纯合体；[0022]图6是本发明中分子标记在玉米三号染色体长臂上的示意位置；[0023]图7是标记dCAPS在7种国内不同育种自交系间的多态情况;+_是杂合型对照，-_为dek6dek6是突变体对照；具体实施方式[0024]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.或植物分子生物学一实验手册（PlantMolecularBiology—ALaboratoryManual,MelodyS.Clark编，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0025]实施例一:利用dek6突变体dek6dek6培育高储藏蛋白玉米[0026]与野生型相比，dek6突变体的总淀粉含量下降了约36.30%deke基因的突变能够显著影响籽粒淀粉和储藏蛋白的积累（表1，图1。把dek6突变纯合体与其它具有优良生产性状的玉米杂交，然后Fl代自交，在F2代中分离出高储藏蛋白玉米籽粒的隐性纯合体。该隐性纯合体经多代自交，轮回选择，逐代选择籽粒发育好，储藏蛋白含量高的种子，最终获得稳定的隐性纯合体，高储藏蛋白自交系或群体，即获得高储藏蛋白商品玉米。[0027]表Idek6突变体及其对应野生型淀粉含量分析。[0029]实施例二:共显性分子标记的获得及与dek6基因连锁关系的确定[0030]图2和图3为玉米籽粒野生型++与玉米籽粒纯合突变体dek6dek6外形图。通过纯合突变体dek6dek6与纯合野生型（++杂交获得Fldek6+，然后以Fl为母本，纯合突变体为父本进行回交构建回交BC群体，参见图LBC群体中出现了基因型分离，包含dek6+与dek6dek6两种基因型，参见图5，具有dek6+基因型的与++基因型的籽粒均为非dek的野生型类型籽粒，具有dek6dek6基因型的籽粒为dek的突变体类型。[0031]本发明通过经典的遗传定位获知dek6基因定位在玉米第3号染色体的短臂上。通过在dek6位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的回交群体BC，提取纯合突变体、野生型以及BC群体各单株的基因组DNA，利用图位克隆的方法克隆了该基因，获得了该基因的DNA序列。本研究依据突变基因dek6与野生型基因dek6的差别序列设计特异性引物，即共显性分子标记dCAPS，通过扩增dek6基因的特异片段，根据扩增条带的大小区分出纯合野生型和突变体以及杂合子的基因型。[0032]正向引物从5'端至3'端为:TGGCATACATCCCACTACAGAGCA;[0033]反向引物从5'端至3'端为:ATGATCTGAGCACAACGATCTCCGA;[0034]所得到共显性分子标记dCAPS能够区分育种过程中杂交亲本纯合dek6类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代Fl代）的。[0035]由于该标记位于dek6基因上，故该分子标记与该基因完全连锁，参见图6。使用这个分子标记进行辅助选择准确度很高，在任何背景下，标记dCAPS与dek6基因的交换率为0，使用这个标记确定dek6基因的错选率为O。[0036]实施例三:分子标记在不同亲本间的多态性鉴定[0037]提取dek6突变体纯合，野生型杂合子和M〇17、9801、综3、黄早4和郑58类型等7种育种中广泛使用的自交系的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记dCAPS对dek6与M〇17、9801、综3、黄早4和郑58类型等7种育种亲本DNA进行PCR扩增和凝胶电泳分析表明，dCAPS在dek6与M〇17、9801、综3、黄早4和郑58类型等7种育种亲本都具有多态性，参见图7。此结果证明，分子标记dCAPS能够在任何育种背景群体中准确检测到dek6基因的存在，可用于与这些育种材料培育高储藏蛋白玉米时dek6基因的辅助选择且错选率为0。

权利要求：1.一种用于检测玉米Dek6基因的特异性引物，其特征在于该特异性引物的碱基序列为：正向引物从5端至3端为:TGGCATACATCCCACTACAGAGCA;反向引物从5端至3端为:ATGATCTGAGCACAACGATCTCCGA。2.—种根据权利要求1所述的用于检测玉米Dek6基因的特异性引物在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。3.—种根据权利要求1所述的用于检测玉米Dek6基因的特异性引物在检测和区分野生型自交系M〇17、9801、综3、黄早4和郑58类型以及它们杂交子代类型中的应用。

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