申请/专利权人：北京市农林科学院

申请日：2017-06-02

公开（公告）日：2021-01-19

公开（公告）号：CN107034177B

主分类号：C12N5/075(20100101)

分类号：C12N5/075(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.19#授权;2017.09.05#实质审查的生效;2017.08.11#公开

摘要：本发明提供了一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，其以牛卵泡膜细胞体外培养液为基质，在所述基质中含有褪黑激素。本发明通过采用添加有褪黑激素的体外培养液对牛卵泡膜细胞培养时，褪黑激素能够抑制牛卵泡膜细胞孕酮的合成，褪黑激素抑制LH+IGF1诱导的StAR和CASP3表达，但对CYP11A1和CYP17A1表达无影响。但褪黑激素能够促进牛卵泡膜细胞增殖，褪黑激素作为牛卵巢功能的内分泌调控因子，通过下调类固醇激素的合成抑制LH和IGF1的效应，进而延缓膜细胞分化。将褪黑激素应用在牛卵泡膜细胞的促进膜细胞增殖或抑制类固醇合成的制剂中具有良好的应用价值。

主权项：1.褪黑激素在促进牛卵泡膜细胞增殖的应用，其通过褪黑激素下调细胞凋亡相关基因CASP3的表达抑制细胞凋亡，进而刺激膜细胞增殖。

全文数据：一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂及其应用技术领域[0001]本发明涉及家畜配子胚胎工程技术领域，具体涉及一种牛卵泡膜细胞体外调节剂及其应用。背景技术[0002]卵泡膜细胞作为卵巢中组成卵泡的3种主要细胞之一，在卵巢的各项功能如甾体合成、卵泡发育和卵泡闭锁中都发挥了一定的作用。卵泡膜细胞起源于卵巢中类似成纤维细胞样的基质细胞，其可分泌雄激素，与卵泡刺激素FSH相互作用促进颗粒细胞增殖，促进卵泡的发育。[0003]褪黑激素，N-乙酰基-5甲氧基色胺Melat〇nine，MT，主要由松果体分泌，其生物学功能多样，包括调控生物周期节律、睡眠机能、繁殖和抗氧化应激功能等。有研宄表明，在哺乳动物，褪黑激素通过结合下丘脑-垂体-性腺轴系上的结合位点、活化其受体进而影响性发育和繁殖功能（Clemens等，LifeSciences，2001，69:27-35;Hu等，GeneralandComparativeEndocrinology，2017,242:101-107。在雄性动物，褪黑激素能通过调控GnRH、LH的分泌、睾酮的合成以及睾丸的成熟影响季节性和非季节性繁殖动物的繁殖功能Tian等，JournalofPinealResearch，2014,57:239_247。褪黑激素能够促进绵羊、猪、牛、小鼠和人卵母细胞和胚胎的发育Mayo等，CelluarandMolecularLifeSciences，2002,59:1706_1713;He等，AnimalReproductionScience，2016,172:164-172，另一方面，褪黑激素表现出极强的抗氧化和抗凋亡能力，可以添加在培养基中提高体外培养卵母细胞的受精率和胚胎早期发育率Ishizuka等，JournalofPinealResearch，2000,28:48_51;Voiculescu等，JournalofMedicineandLife，2014,7:488_492〇[0004]褪黑激素对卵巢细胞类固醇激素合成的影响研究较少，在大鼠颗粒细胞，褪黑激素能促进孕酮的合成Fiske等，Endocrinology，1984,114:407-410，也有研宄证明褪黑激素对孕酮合成无影响（Nakamura等，TheJournalofSteroidBiochemistryandMolecularBiology，2014,143:233-239。褪黑激素对膜细胞增殖的影响无文献报道。近期，褪黑激素被认为是人子宫内膜的一种生长因子（Arjmand等，MolecularBiotechnology，2〇16，58:684_694。目前，没有文献报道褪黑激素对牛卵泡膜细胞基因表达的影响，仅有报道表明褪黑激素抑制未成熟睾丸间质细胞LH刺激的雄激素的合成，原因是下调了CYP11A1和CYP17A1基因的表达（Qin等，ReproductiveBiomedicineOnline，2015,31:638-646。裡黑激素能够促进颗粒细胞类固醇激素合成Webley和Luck，JournalofReproductionandFertility，1986,78:711_717;Wang等，Theriogenology，2012,78:1517-1526。迄今为止，没有有关褪黑激素对牛卵泡膜细胞影响的报道。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂。[0006]本发明另一目的是提供一种促进牛卵泡膜细胞体外培养增殖的方法。[0007]本发明再一目的是提供褪黑激素在抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成的应用及褪黑激素在制备用于促进牛卵泡膜细胞体外膜细胞增殖抑制膜细胞类固醇激素合成药物中的应用。[0008]一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，以牛卵泡膜细胞体外培养液为基质，在所述基质中含有褪黑激素。[0009]如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述褪黑激素浓度为0.023Ugml-2.3ugmL，更优选，所述褪黑激素浓度为0.23ligml-2.3ugml。[0010]如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述基质为按体积比为1:1的混合HamsF-12和DMEM的培养基，其中，含有体积比为10%的胎牛血清，浓度为2.0圓〇1L的谷氨酰胺、〇.12mmolL的庆大霉素和38.5nmolL的碳酸氢钠，及含有30ngml的促黄体生成素LH。[0011]如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述基质为按体积比为1:1的混合HarnSF-12和DMEM的培养基，其中，含有体积比为10%的胎牛血清，浓度为2.0mmolL的谷氨酰胺、〇.12mmolL的庆大霉素和38.5mraolL的碳酸氢钠，及含有30ngml的促黄体生成素LH30ngml的类胰岛素一号增长因子（IGF1。[0012]如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述基质为按体积比为1:1的混合HansF-12和DMEM的培养基，其中，含有体积比为10%的胎牛血清，浓度为2.0mmolL的谷氨酰胺、〇.12mmolL的庆大霉素和38.5nmolL的碳酸氢钠，及30ngml的类胰岛素一号增长因子（IGF1。[0013]一种促进牛卵泡膜细胞体外培养增殖的方法，其是将牛卵泡膜细胞在如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂中培养。[00M]优选地，所述牛卵泡膜细胞分离自8〜22_的大卵泡。[0015]进一步，本发明提供了褪黑激素在促进牛卵泡膜细胞增殖的应用。[0016]进一步，本发明提供了褪黑激素在抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成的应用。[0017]进一步，本发明提供了褪黑激素在制备用于促进牛卵泡膜细胞体外增殖合成药物中的应用。[0018]进一步，本发明提供了褪黑激素在制备用于抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成药物中的应用。[0019]进一步，所述类固醇激素为孕酮。[0020]本发明的有益效果为：[0021]本发明中，在牛卵泡膜细胞进行体外培养时，促黄体生成素LH诱导下褪黑激素对膜细胞孕酮的合成无影响，促黄体生成素LH单独的具有细胞增殖作用，在辅助有IGF1存在的情况下，褪黑激素能呈剂量依赖性刺激牛膜细胞增殖，IGF1能增加膜细胞对褪黑激素的敏感性。LH+类胰岛素一号增长因子（IGF1诱导下褪黑激素可呈剂量依赖性抑制膜细胞孕酮等类固醇激素的合成。褪黑激素抑制LH+IGF1诱导的StAR和CASP3表达，但对CYP11A1和CYP17A1表达无影响。但是，褪黑激素能够促进牛卵泡膜细胞增殖，褪黑激素作为牛卵巢功能的内分泌调控因子，通过下调类固醇激素的合成抑制LH和IGF1的效应，进而延缓膜细胞分化。[0022]将褪黑激素应用在牛卵泡膜细胞的促进膜细胞增殖或抑制类固醇合成的制剂中，具有良好的应用价值。褪黑激素可作为新型的牛卵泡膜细胞促进膜细胞增殖药物制剂在家畜胚胎工程上推广应用。附图说明[0023]图1为不同浓度的褪黑激素在加LH与加LH和IGF1处理时，膜细胞增殖情况的比较图。[0024]图2为不同浓度的褪黑激素在加LH与加LH和IGF1处理时，孕酮合成情况的比较图。[0025]图3为全部加有LH和IGF1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞StAR基因的表达结果图。[0026]图4为全部加有LH和IGF1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞CASP3基因的表达结果图。[0027]图5为全部加有LH和IGF1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞CYP11A1基因的表达结果图。[0028]图6为全部加有LH和IGF1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞CYP17A1基因的表达结果图。[0029]其中，图中不同小写字母表示存在差异P〇.〇5。[0046]实施例2褪黑激素对0丫?1“1、0¥?17八1、0八8?3和3纟41?11«熟表达的影响[0047]1•细胞培养[0048]按实施例1中细胞培养的获得膜细胞，在含10%FBS的培养基中培养24小时后，使用3个处理:对照、IGF130ngml和褪黑激素（2.3ygml+IGF130ngml，所有的处理均包括30ngmlLH。培养24小时结束后，吸取培养基，细胞裂解后用于RNA提取。实验设计3个不同的重复。每一个重复的膜细胞来源于4-6头牛卵巢上的5-7个大卵泡。[0049]2.RNA提取和RT-PCR定量测定表达量[0050]培养结束后，吸取每孔的培养基;在孔中加入0.5mlTRNzol试剂天根生化科技有限公司，北京），并提取RNA。每个处理包括2个RNA样品。RNA样品用NanoDropND-1000分光光度计NanoDropTechnologies，Inc.，Wilmington，DE测定260nm处的吸光度值，RNA样品用DEPC水稀释，保存与-80°C。[0051]CYP11A1、CYP17A1和StAR基因引物见已发表文献（Spicer等，BiologyofReproduction，2008，78:243_253Jaspase3CASP3基因引物序列为：上游引物：CTTCCACGAAAATACTGGCATG，下游引物：TGAATGTTTCCCTGAGGTTTGC，探针：TCGATCTGGTACAGACGTG。对所有RT-PCR而言，设置一个不加模板和一个没有反转录的对照，确保PCR反应无DNA或其他污染。PCR反应结束后用琼脂糖凝胶确定目的基因片段的大小。目的基因表达用持家基因18S核糖体RNA做标准化处理（Spicer等，BiologyofR印roduction，2〇08，78:243-253，相对表达量用2—^^7法计算。[0052]3.检测结果[0053]基因表达等用SPSS软件中的AN0VA分析，不同平均数用Tukey法比较，数据用平均数±标准误表示。[0054]结果如图3-6所示，其中，StAR基因编码类固醇激素急性调节蛋白，可作用于线粒体外膜，介导并促进类固醇的底物一一胆固醇经线粒体外膜转运至内膜，继而在胆固醇侧链裂解酶P45〇SCC等的作用下逐级合成类固醇激素。CYP11A1基因编码P450SCC，是催化雌激素合成过程中的第一步，即将胆固醇转化为孕烯雌酮，是雄激素、雌激素生物合成的关键限速酶。CYP17A1基因编码细胞色素酶P450cl7,可将孕烯雌酮和孕酮转化为17-羟孕烯雌酮和孕酮。5七六1?，0¥?11六1，0¥?1741均是孕酮合成过程中的限速酶^六3?3基因表达的03口363是细胞凋亡一个主要的下游效应器和颗粒细胞凋亡的标记。[0055]结果表明，LH和IGF1处理膜细胞，CYP11A1和CYP17A1基因表达不受褪黑激素影响。但是，2•3ygml褪黑激素可抑制StAR和CASP3基因表达P0•05。由此可见，褪黑激素能够调控牛卵巢膜细胞功能，通过下调类固醇合成相关酶基因（StAR的表达抑制类固醇激素的合成，并通过下调细胞凋亡相关基因（CASP3的表达抑制细胞凋亡，进而刺激膜细胞增殖。

权利要求：1.一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，其特征在于，以牛卵泡膜细胞体外培养液为基质，在所述基质中含有褪黑激素。2.如权利要求1所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，其特征在于，所述褪黑激素浓度为0•023]igml〜2•3ygmL。3.如权利要求1或2所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，其特征在于，所述褪黑激素浓度为〇•23ygml〜2•3ygml。4.如权利要求1或2所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，其特征在于，所述基质为按体积比为1:1混合的HamSF-12和DMEM的培养基，其中，含有体积比为10%的胎牛血清，浓度为2•OmmolL的谷氨酰胺、0•12mmolL的庆大霉素和38.5mmolL的碳酸氢钠，及30ngml的促黄体生成素，和或30ngml的类胰岛素一号增长因子。5.—种促进牛卵泡膜细胞体外培养增殖的方法，其特征在于，其是将牛卵泡膜细胞在权利要求1-4任一项所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂中培养。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵泡膜细胞分离自8〜22mm的大卵泡。7.褪黑激素在促进牛卵泡膜细胞增殖的应用。8.褪黑激素在抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成的应用。9.褪黑激素在制备用于促进牛卵泡膜细胞体外增殖合成药物中的应用。10.褪黑激素在制备用于抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成药物中的应用。

百度查询： 北京市农林科学院 一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂及其应用

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