申请/专利权人：西南医科大学

申请日：2019-08-12

公开（公告）日：2021-02-05

公开（公告）号：CN110386983B

主分类号：C07K16/28(20060101)

分类号：C07K16/28(20060101);C12N15/85(20060101);C12N15/66(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.05#授权;2019.11.22#实质审查的生效;2019.10.29#公开

摘要：本发明公开了一种抗CD20单链抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。还公开了一种全人源抗CD20重组抗体，其包含前述的单链抗体和人抗体恒定区Fc段，该重组抗体的氨基酸序列如SEQIDNo:17所示。还公开了一种真核表达载体，由将前述的抗CD20单链抗体的序列插入通用表达载体sp‑FcpcDNA3.1中得到，通用表达载体的核酸序列如SEQIDNo:18所示。还公开了一种重组表达载体：以前述的真核表达载体为模板，采用扩增引物扩增片段sp‑scFv966‑Fc，将得到的扩增片段插入pMH3载体即得。

主权项：1.一种抗CD20单链抗体，其特征在于：所述单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。

全文数据：全人源抗CD20重组抗体技术领域本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种全人源抗CD20重组抗体。背景技术近年来，生物医药彻底改变了医药工业，为那些传统治疗失败或以前没有治疗选择的患者带来了新希望。单克隆抗体药物的发展经历了鼠源性单克隆抗体、嵌合型单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体的四个阶段。传统产生单克隆抗体依赖于实验室动物的免疫接种，随后筛选特异性杂交瘤细胞，这种方法获得抗体过程费时、费力，且成本高，其有效性取决于免疫系统对潜在抗原产生体液免疫的能力，受到诸多条件的限制。重组DNA技术的出现为该领域带来了新的方向，可以在体外再现抗体生产、筛选、克隆子分离的完整过程。虽然单克隆抗体具有纯度高、效价高、特异性强、结构均一、血清交叉反应少、制备成本低等多种优点，但以小鼠为细胞来源的抗体可使人体产生人抗鼠抗体反应HAMA，从而会削弱单克隆抗体的治疗作用，甚至导致机体的免疫病理损伤。因此，高亲和力、高特异性、毒副作用小的全人源基因工程抗体是当前重组抗体技术研发的趋势所在。人源化抗体是在嵌合抗体的基础上减少鼠源成分，保留鼠抗体CDR区，其余全部替换成人抗体相应部分，经过改型抗体，人源成分达90％即为所指的人源化抗体。在疾病治疗中，人源化抗体优于鼠源抗体，不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排斥反应，还在于人源化抗体中Fc段能够诱发机体的效应功能募集效应因子或效应细胞，后者对靶细胞具有杀伤作用。还有一个优点在于人源化抗体在体内的半衰期可达数天，而鼠源抗体的半衰期则不到20h。单链抗体singlechainantibodyfragment，scFv，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。重组抗体药物是生物医药领域的研发热点，代表了药物治疗领域的最新发展方向。高亲和力、高特异性、毒副作用小的全人源基因工程抗体是当前重组抗体技术研发的趋势所在。scFv抗体比完整抗体具有更好的细胞穿透性。然而，单价结合的单链抗体分子量小、亲和力较低，并且体内半衰期短。因此，科学家们用基因工程重组技术开发了不同形式的重组抗体。抗体的Fc段与Fc受体的相互作用可以延长含Fc蛋白的半衰期；此外，Fc还参与了抗体依赖的细胞毒ADCC和补体依赖的细胞毒CDC作用。Fc相关的生物学特性FcRn结合能力、ADCC和CDC可以通过对Fc残基的定点突变进行调整。因此，scFv-Fc抗体不仅可以作为诊断的工具，也可以作为治疗的手段。噬菌体展示技术在药用单克隆抗体研究上运用得最为成熟和高效。噬菌体展示技术是从脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。CD20membrane-spanning4-domain,groupA,member1[MS4A1]是一种非糖基化蛋白，是B细胞表面标志蛋白，分子量约33～36kd。CD20分子在正常或者淋巴瘤细胞表面均有表达。在正常细胞中，CD20分子于前B细胞阶段开始表达，最终发育到浆细胞时消失。与正常状态下相比，大多数的恶性B细胞表面稳定高表达CD20，因此，CD20可作为B细胞淋巴瘤靶标抗原。抗CD20抗体作用机制主要有抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC、补体依赖的细胞毒作用complement-dependentcytotoxicity，CDC和凋亡作用。靶向于CD20的抗体可通过三种机制清除和破坏B细胞淋巴瘤细胞。一种是CD20与抗体的Fab结合后，通过细胞FASFASL介导细胞凋亡，另外两种是通过CD20与抗体的Fab结合后，抗体的Fc段通过募集补体和效应细胞，引发补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀灭靶细胞。美国食品和药品管理局FoodandDrugAdministration,FDA批准应用的抗CD20抗体有Rituximab，Ocrelizumab，Veltuzumab，Obinutumab，Ofatumumab，国内仅有进口的抗CD20人鼠嵌合抗体Rituximab，商品名：美罗华销售，国内并无自主知识产权抗CD20抗体。批准上市的进口抗CD20抗体整体价格高，并且人鼠嵌合抗体在应用时存在免疫原性问题，临床约50％的患者出现复发耐药问题，B细胞淋巴瘤的治疗进入瓶颈期，所以研发具有自主知识产权、免疫原性更低、适用性更好的抗CD20抗体势在必行。CD20作为自身抗原，抗CD20抗体需要在其他宿主中进行免疫才能得到。然而，其他宿主产生的抗体，即便是进行人源化，也比全人源抗体更具有免疫原性。研发靶向于CD20的全人源抗体，可体外通过噬菌体展示技术获得。噬菌体展示技术为抗体的研发开辟了全新的道路，可不经免疫过程筛选抗体。噬菌体抗体库常见的有单链抗体和Fab片段。scFv，Fab抗体与CD20抗原结合之后，引发凋亡作用实现对机体的保护，但都不具备Fc段功能。全人源scFv-Fc重组抗体具备全抗与CD20抗原结合特性，同时Fc段也可发挥ADCC，CDC等生物学效应，是一种理想的治疗性基因工程抗体。发明内容本发明的目的是针对上述问题提供一种抗CD20单链抗体、全人源抗CD20重组抗体及其真核表达载体和重组表达载体。本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种抗CD20单链抗体，所述单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。所述单链抗体的重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接，所述连接肽linker的氨基酸序列为Gly4Ser3。一种全人源抗CD20重组抗体，所述重组抗体包含上述的单链抗体和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列，该重组抗体的氨基酸序列如SEQIDNo:17所示。一种表达全人源抗CD20重组抗体的真核表达载体，所述真核表达载体由将上述的抗CD20单链抗体的序列插入通用表达载体sp-FcpcDNA3.1中得到，所述通用表达载体sp-FcpcDNA3.1的核酸序列如SEQIDNo:18所示。在上述技术方案中，所述真核表达载体为sp-scFv966-FcpcDNA3.1，其核酸序列如SEQIDNo:13所示。一种表达全人源抗CD20重组抗体的重组表达载体，所述重组载体是通过以下方法构建得到：以上述的真核表达载体为模板，采用PCR扩增引物扩增片段sp-scFv966-Fc，将得到的扩增片段插入pMH3载体即得重组载体sp-scFv966-FcpMH3。所述PCR扩增引物为SP-F、Fc-R，SP-F的序列如SEQIDNo:14所示，Fc-R的序列如SEQIDNo:15所示。所述扩增片段插入pMH3载体的方法为先将以前述的真核表达载体为模板扩增得到的sp-scFv966-Fc片段和pMH3载体采用EcoRI和NotI双酶切后进行连接。本发明的有益效果是：1从前期构建的全人源单链抗体文库中，采用噬菌体展示技术，筛选得到抗CD20全人源单链抗体，全人源单链抗体相对于鼠源、人源化抗体特异性更强，免疫原性更低。2通过构建真核表达载体sp-scFv-FcpcDNA3.1，scFv与人IgG1Fc融合形成scFv-Fc，表达载体适合真核表达，scFv-Fc抗体较scFv抗体更为稳定，可通过Fc段发挥抗体CDC和ADCC作用，本发明所用表达载体及表达方案适合表达多种可溶性蛋白。本发明所表达CD20重组抗体对CD20+Raji细胞具有一定的细胞毒性，本发明的重组抗体scFv-Fc后续可应用于治疗B细胞淋巴瘤和自身免疫性疾病。3将CD20蛋白真核表达载体瞬时转染HEK293T细胞，高效表达蛋白，相较于原核表达，蛋白结构最接近于天然蛋白，最大程度保留蛋白活性，表达条件可用于表达多种可溶性蛋白。scFv-Fc重组抗体中的scFv可与抗原CD20结合直接介导靶细胞凋亡作用，Fc段可与免疫细胞或者血清中的补体相互作用，发挥补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。附图说明图1为噬菌体ELISA检测序列正确的15株scFvs与抗原CD20的结合结果。图2为sp-scFv966-FcpcDNA3.1重组载体的验证结果和结构图，其中，A为PCR验证结果，B为其结构图。图3为sp-scFv966-FcpMH3重组载体的验证结果和结构图，其中，A为PCR验证结果，B为其结构图。图4为检测重组抗体scFv966-Fc的表达结果，其中，A是WesternBlot检测结果，B是ELISA检测结果。图5为ELISA检测CD20抗原与重组抗体scFv966-Fc的结合结果。图6为CCK-8检测重组抗体scFv966-Fc的对Raji细胞的直接抑制作用结果。图7为CCK-8检测重组抗体scFv966-Fc对Raji细胞的CDC作用结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。实施例一、CD20抗原的表达与鉴定构建CD20真核表达载体，在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白。方法：以人外周血单个核细胞PBMC总RNA为模板，反转录PCR扩增得到CD20基因，并插入真核表达载体pCMV3-C-His，PCR初步验证后，再测序验证。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达，ELISA、Westernblot法检测CD20蛋白表达，优化表达条件。本实施例具体实验步骤已经在该文献中公开：“石梅,年四季,高燕,邬于川,宋章永,王明雪,袁青.可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2018,3410:870-875”。结果：PCR与测序均显示成功插入CD20基因。转染HEK293T细胞72h后，Westernblot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白。HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关。本实施例成功构建了CD20真核表达载体，高效表达CD20可溶性蛋白。实施例二、抗CD20单链抗体筛选一、CD20蛋白生物素化取溶解于1×PBS中的50μgmlCD20蛋白购自中国SinoBiological公司约40μl待用；称取1mgbiotin生物素，加160μlddH2O溶解，取1μl加入到前述40μlCD20蛋白溶液中，冰育2h或室温25℃孵育1h。生物素化蛋白加入到脱盐柱中，1000g离心2min收集生物素化蛋白于-80℃保存。二、噬菌体文库筛选本实验室前期已构建了天然全人源噬菌体抗体文库，文库容量为2.5×108。取5×1011TUscFv抗体文库噬菌体，用封闭液6％BSA1×PBST室温封闭1h；加入生物素化的CD20蛋白，37℃孵育2h，形成CD20蛋白-特异性噬菌体抗体复合体；再于该混合液中加入链霉亲和素包被的磁珠，缓慢旋转振荡孵育30min。磁力架上洗涤磁珠5～10次；然后加入0.1molLGly-HClpH2.2解离特异性噬菌体，感染E.coliTG1并培养至OD600＝0.6，将菌液涂LBAGLB培养基中加入终浓度100μgml氨苄青霉素，终浓度2％葡萄糖固体平板，得到的菌落用于后续噬菌体文库扩增。重复此噬菌体展示富集筛选4轮，后续每轮筛选逐步递减生物素化的CD20蛋白，增加洗涤次数，以进行压力筛选。三、噬菌体扩增收集的文库克隆子或经过4轮噬菌体展示后的单个克隆子菌液于LBAG液体培养基中37℃，200rpm培养至OD600＝0.2，离心后，以LBA液体培养基LB培养基中加入终浓度100μgml氨苄青霉素重悬，加入终浓度为3×109TU辅助噬菌体M13KO7，37℃静置感染15min后，37℃，200rpm培养2h。加入终浓度20μgml的卡那霉素，32℃，200rpm培养过夜。次日，离心收集上清，加入15倍体积的20％PEG，上下颠倒混匀，冰育1h，高速离心沉淀噬菌体，1×PBS重悬。四、噬菌体ELISA实施例一中表达、收集得到的CD20蛋白稀释于包被液中50mmolLNaHCO3Na2CO3，pH9.6于酶标板内4℃包被过夜。次日，封闭液5％脱脂奶粉1×PBST37℃封闭酶标孔1h，洗涤酶标板。将4轮噬菌体展示富集后的单个克隆子扩增的噬菌体抗体溶液加入等倍体积封闭液室温封闭30min，然后加入到酶标孔中37℃孵育1h。洗涤酶联板后，加入HRP标记抗M13单克隆抗体37℃孵育1h，加入TMB显色液避光显色30min，酶标仪读取450nm处的吸光度A450值。五、结果本实验室已构建的天然全人源scFv抗体文库用CD20作为抗原进行加压筛选4轮后，经噬菌体文库感染TG1，涂LBAG固体平板，随机挑选了1096个单克隆子，通过噬菌体ELISA筛选抗CD20单链抗体。结果显示：经过4轮文库富集，得到47个特异性较高的阳性克隆子。将筛选到的47个克隆子过夜培养16h，提取质粒，于上海生工生物工程有限公司测序。测序结果采用primer5软件进行序列分析，Multalin软件进行序列比对，Multalin序列比对结果显示：15个克隆子为开放阅读框，VH和VL以linkerGly4Ser3连接SEQIDNo:1，氨基酸序列有所差异，尤其CDR3区差异较大。将15个scFv克隆子传代后进行小量表达，噬菌体ELISA检测结果显示，15株scFvs都能与抗原CD20特异性结合图1，并且scFvs菌株多次传代后，稳定性良好。其中scFv966特异性最高，因此选择scFv966用于后续实验。scFv966的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。实施例三、抗CD20scFv966-Fc重组表达载体的构建与表达一、sp-scFv966-FcpcDNA3.1重组表达载体的构建1、PCR扩增scFv片段以scFv966-F含ClaⅠ酶切位点为上游引物，scFv966-R为下游引物含XhoⅠ酶切位点，以高保真PfuDNA聚合酶PCR扩增得到scFv966片段。上游引物scFv966-F的序列为：5′-CCCATCGATATGGGCCCAGGTGCAGCT-3′SEQIDNo:4，下游引物scFv966-R的序列为：5′-CCGCTCGAGACCTAGGACGGTCAGCTTGG-3′SEQIDNo:5。20μlPCR反应体系为：10×PfuPCRBuffer2μl、2.5mMdNTPs1.6μl终浓度为200μM、scFv966-F10μM1μl、scFv966-R10μΜ1μl、2.5UClonedPfuDNApolymerase0.4μl、scFv966DNA模板1μl50ngμl，加ddH2O至20μl。PCR扩增条件：94℃2min；98℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。2、构建通用表达载体sp-FcpcDNA3.1由于scFv分子量小，结构不够稳定，在体内半衰期短，并且不具有抗体Fc段功能，所以需构建结构稳定、体内半衰期长，具备抗体Fc段功能的IgGlikescFv-Fc抗体，Fc为IgG1Fc段的Hinge+CH2+CH3序列。本发明构建带了多克隆酶切位点的通用表达载体sp-FcpcDNA3.1，可以任意插入scFv，构建的sp-scFv-FcpcDNA3.1重组载体转染HEK293F细胞，可在细胞中正确折叠，表达具有功能的scFv-Fc抗体。前期发表文章的pcDNA3.1sp-Fc载体见“叶迎春等，全人源scFv-Fc真核表达载体的构建与鉴定[J]，中国免疫学杂志，2014，302：226-229为单一酶切位点，不能满足任意scFv的插入；在前期工作的基础上，构建了在sp-Fc之间插入了多个酶切位点，保证了任意scFv的插入，构建的sp-FcpcDNA3.1具备通用性。1合成信号肽SP序列：MDWTWRILFLVAAATGTHASEQIDNo:6，合成的序列包含起始密码子和真核表达元件Kozak序列的重链信号肽序列，以合成的SP为模板，采用SPF-HindIII和SPR-KpnI引物PCR扩增得到引入酶切位点HindIII和KpnI的SPDNA。PCR反应液的配制20μl体系TakaraExDNAPolymerase0.2μl，2.5mMdNTPMixture1.6μl终浓度为200μM，10×ExBuffer2μl，10μmFSPF-HindIII1μl，10μmRSPR-KpnI1μl，scFvDNA20ngμl1μl，加ddH2O至20μl。引物SPF-HindIII、SPR-KpnI的序列为：SPF-HindIII：5’CCCAAGCTTGCCGCCGCCGCCACCATGGACTGGACCCTGGAGAAT3’SEQIDNo:7，SPR-KpnI:5’GGGGTACCGGCGTGGGTGCCTGTAGCT3’SEQIDNo:8。PCR反应程序：94℃2min；98℃10sec、55℃15sec、68℃30min，30个循环；68℃10min。HindIII和KpnI双酶切pcDNA3.1该质粒购自Invitrogen公司和PCR扩增的带酶切位点的SPDNA，采用T4DNA连接酶插入SP序列，构建sp-pcDNA3.1重组载体。2从健康志愿者外周血中分离单个核细胞PBMC，提取PBMC总RNA，采用PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKitsTakara反转录cDNA，PCR对cDNA进行扩增引物对：pcDNA3.1-KpnI-Fc-F，pcDNA3.1-XbaI-Fc-R得到Fc扩增片段，在扩增Fc的上游引物引入了多个酶切位点KpnI+ClaI+AgeI+AscI+XhoI，以便于后期插入任意scFv序列。扩增的Fc段包括Hinge+CH2+CH3，保证了Fc段的功能区。PCR扩增反应体系20μl为PrimeSTARGXLDNAPolymerase0.4μl，2.5mMdNTPMixture1.6μl终浓度为200μM，5×GXLBuffer4μl，10μmFpcDNA3.1-KpnI-Fc1μl，10μmRpcDNA3.1-XbaI-Fc-R1μl，cDNA2μl，加ddH2O至20μl。引物pcDNA3.1-KpnI-Fc-F的序列为：5’CGGGGTACCATCGATACCGGTGGCGCGCCTCTCGAGGAGCCCAAATCTTGTGAC3’SEQIDNo:9，引物pcDNA3.1-XbaI-Fc-R的序列为：5’CTAGTCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG3’SEQIDNo:10。PCR反应程序：94℃2min；98℃10sec、55℃15sec、68℃1min，30个循环；68℃10min。KpnI和XbaI双酶切Fc和sp-pcDNA3.1重组载体，T4DNA连接酶，构建在SP和Fc之间带有多个酶切位点的可以任意插入scFv的sp-FcpcDNA3.1的通用表达载体，sp-FcpcDNA3.1的核酸序列如SEQIDNo:18所示。3Fc扩增片段和sp-pcDNA3.1载体均进行KpnI、XbaI双酶切：FastDigestKpnI酶切反应体系：FastDigestenzyme1μl、10×FastDigestbuffer2μl、Fc扩增片段或sp-pcDNA3.1载体质粒≤1μg，加ddH2O至20μl。37℃温育2h，然后用乙醇沉淀法回收酶切后片段。XbaI酶切反应体系：XbaI1μl、10×Mbuffer2μl、0.1％BSA2μl、Fc扩增片段或sp-pcDNA3.1载体质粒≤1μg，加ddH2O至20μl。37℃水浴酶切2h；最后半小时，加1.5μlCIP在sp-pcDNA3.1载体酶切反应体系中；酶切完成后，Fc片段用QIAquickPCRpurificationKit试剂盒直接回收，sp-pcDNA3.1载体酶切后产物直接上样0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带的凝胶使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收产物sp-pcDNA3.1片段，测定浓度，保存于-20℃。4Fc和sp-pcDNA3.1片段的连接转化及验证Fc和sp-pcDNA3.1双酶切后的片段经T4连接酶连接转化入感受态TOP10，克隆得到sp-FcpcDNA3.1通用载体；使用载体引物T7-F和BGH-R经PCR验证sp-FcpcDNA3.1通用载体构建结果；将PCR验证正确的菌株用LBA液体培养基扩大培养，提取质粒后送测序验证。引物T7-F序列为：5’TAATACGACTCACTATAGGG3’SEQIDNo:11，引物BGH-R序列为：5’TAGAAGGCACAGTCGAGG3’SEQIDNo:12。3、scFv966和sp-FcpcDNA3.1载体双酶切FastDigestXhoI酶切反应体系：FastDigestenzyme1μl、10×FastDigestBuffer2μl、scFv966扩增片段或sp-FcpcDNA3.1通用载体DNA≤1μg、加ddH2O至20μl，37℃水浴酶切2h。乙醇沉淀纯化后加入10μlddH2O溶解沉淀。QuickCutTMClaI酶切反应体系：QuickCutClaI1μl、10×QuickCutBuffer2μl、scFv966扩增片段或sp-FcpcDNA3.1通用载体DNA≤1μg、加ddH2O至20μl。30℃温育2h，双酶切后的sp-FcpcDNA3.1通用载体加入牛小肠碱性磷酸酶calfintestinalphosphatase，CIP，37℃温育30min。scFv966片段用QIAquickPCRpurificationKit试剂盒直接回收，sp-FcpcDNA3.1载体酶切后产物直接上样0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带的凝胶使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收产物sp-FcpcDNA3.1片段，测定浓度，保存于-20℃。4、scFv966和sp-FcpcDNA3.1载体的连接转化将经XhoI、ClaI双酶切后的目的片段scFv966与sp-FcpcDNA3.1载体按照下列酶切体系于16℃连接16h后，转化感受态E.coliTOPO10。T4连接酶连接体系为：酶切后的载体质粒50ng、酶切后的scFv966片段需符合摩尔比质粒：抗体＝1:3的量、10×T4Ligasebuffer1μl、T4DNALigase0.5μl，加ddH2O至10μl，16℃连接反应16h。转化感受态E.coliTOPO10：连接产物10μl与制备的感受态50μl轻柔混合，冰上放置30min；42℃水浴热击90sec，快速放置于冰上静置2min；每管加入900μlLB液体培养基，混匀后于37℃，180rmin震荡培养1h；5000rpm离心5min，移去大部分上清，重悬后涂布于LBA固体培养基，于37℃培养过夜。5、PCR初步验证挑取转化后的单个克隆子，重悬于10μlddH2O，取1μl菌液作为PCR模板，以scFv966-F为上游引物，scFv966-R为下游引物进行PCR验证。20μlPCR反应体系如下：2×EmeraldAMPPCRMasterMix酶Takara公司10ul、scFv966-F10μM1μl、scFv966-R10μM1μl、DNA模板1μl，加ddH2O至20μl，。PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR结果图2A显示泳道10、17、24得到大小约750bp的目的scFv条带，其它为空载体，将泳道10、17、24相应克隆子送测序，结果显示序列正确，成功构建了sp-scFv966-FcpcDNA3.1重组表达载体，其结构示意图见图2B；sp-scFv966-FcpcDNA3.1重组表达载体的核酸序列如SEQIDNo:13所示。二、sp-scFv966-FcpMH3重组表达载体的构建1、PCR扩增sp-scFv966-Fc片段以SP-F含EcoRI酶切位点为上游引物序列为：5’-CCGGAATTCGCCGCCGCCGCCACCATG-3’，SEQIDNo:14，Fc-R含NotⅠ酶切位点为下游引物序列为：5’-CTAGTCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’，SEQIDNo:15，以sp-scFv966-FcpcDNA3.1重组质粒为模板，用高保真酶PCR扩增得到sp-scFv966-Fc的DNA片段。20μlPCR反应体系：PrimeSTARGXLDNAPolymerase购自Takara公司0.4μl、5×PCRBufferMg2+4μl、2.5mMdNTPMixture1.6μl终浓度为200μM、sp-scFv966-FcpcDNA3.1质粒DNA20ng、SP-F10μm1μl、Fc-R10μm1μl、ddH2O补充至20μl。PCR扩增程序：94℃2min；98℃10sec，60℃15sec，68℃2min，30个循环；68℃10min。2、sp-scFv966-Fc和pMH3载体双酶切sp-scFv966-FcPCR产物与pMH3购自杭州安普生物科技有限公司载体用限制性内切酶EcoRI酶切和NotI进行双酶切。EcoRI酶切反应体系：FastDigestenzyme1μl、10×FastDigestBuffer2μl、sp-scFv966-Fc扩增片段或pMH3载体DNA≤1μg、加ddH2O至20μl。37℃水浴酶切2h；然后用乙醇沉淀法回收酶切后片段。NotI酶切反应体系：NotI1μl、10×Hbuffer2μl、0.1％BSA2μl、0.1％Tritonx-1002μl、sp-scFv966-Fc扩增片段或pMH3载体DNA≤1μg，加ddH2O至20μl。37℃水浴酶切2h。双酶切后的pMH3载体加入牛小肠碱性磷酸酶calfintestinalphosphatase，CIP，37℃温育30min。sp-scFv966-Fc片段用QIAquickPCRpurificationKit试剂盒直接回收，pMH3载体酶切后产物直接上样0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带的凝胶使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收产物sp-FcpcDNA3.1片段，测定浓度，保存于-20℃。3、sp-scFv966-Fc和pMH3载体的连接转化将经EcoRI、NotI双酶切后的目的片段sp-scFv966-Fc与pMH3载体按照下列酶切体系于16℃连接16h后，转化感受态E.coliTOPO10。T4连接酶连接体系为：酶切后的载体质粒50ng、酶切后的sp-scFv966-Fc片段需符合摩尔比质粒：抗体＝1:3的量、10×T4Ligasebuffer1μl、T4DNALigase0.5μl，加ddH2O至10μl，16℃连接反应16h。转化感受态E.coliTOPO10：连接产物10μl与制备的感受态菌50μl轻柔混合，冰上放置30min；42℃水浴热击90sec，快速放置于冰上静置2min；每管加入900μlLB液体培养基，混匀后于37℃，180rmin震荡培养1h；5000rpm离心5min，移去大部分上清，重悬后涂布于LBA固体培养基，于37℃培养过夜。4、PCR初步验证挑取转化后的单克隆子，重悬于10μlddH2O，取1μl菌液作为PCR模板，以scFv966-F为上游引物，scFv966-R为下游引物进行PCR验证。20μlPCR反应体系如下：2×EmeraldAMPPCRMasterMix酶Takara公司10ul、scFv966-F10μM1μl、scFv966-R10μM1μl、DNA模板1μl，加ddH2O至20μl，。PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR验证阳性的克隆子送上海生工生物工程有限公司测序验证。PCR结果图3A显示泳道1、2、3、7、9、10、11得到大小约750bp的目的scFv条带，与预测相符，其它为空载体，将泳道1、2、3、7、9、10、11相应克隆子送测序，测序结果显示序列正确，成功构建sp-scFv966-FcpMH3重组表达载体，其结构示意图见图3B；sp-scFv966-FcpMH3重组表达载体的部分核酸序列如SEQIDNo:16所示，该序列包含了sp-scFv966-Fc片段序列和载体pMH3的部分序列。三、scFv966-Fc重组抗体的表达1、HEK293F细胞培养:以FreeStyle293expressionmedium无血清培养基Gibco，于37℃、8％CO2的培养摇床中120rpm培养至细胞汇合度达到80％时进行传代。2、重组抗体表达载体瞬时转染HEK293F细胞将HEK293F细胞接种于细胞培养瓶，调整细胞密度为1.0×106个ml进行转染。sp-scFv966-FcpcDNA3.1或sp-scFv966-FcpMH3重组质粒与PEI聚乙烯亚胺比例为1:3.2，分别溶于无血清培养基中，然后将PEI溶液加入重组质粒溶液中，混匀后室温孵育20min，形成DNA-PEI复合物。补充无血清培养基至10ml，再次混匀，放入CO2培养摇床中进行培养。3、HEK293F细胞收取并裂解收取转染后24h、48h、72h、96h、120h、144h细胞悬液，1000rpm离心3min，分别收取细胞和细胞培养上清液；细胞以1×PBS清洗两遍，以1×PBS与PMSF100mgmL，1:100混合液重悬，超声裂解后，4℃，12000rpm离心10min，去掉细胞碎片，取上清4℃保存备用。4、WesternBlot检测scFv966-Fc重组抗体的表达收取转染sp-scFv966-FcpcDNA3.1或sp-scFv966-FcpMH3重组质粒和空载体的HEK293F细胞和细胞培养上清液，超声裂解细胞，离心取上清。将细胞培养上清液或细胞裂解上清分别进行SDS-PAGE分离。电转法转移到NC膜上。1×PBST洗膜3次，每次5min；用封闭液5％脱脂奶粉1×PBST室温封闭1h后，用1×PBST洗膜3次，每次5min；然后将膜加入到用1×PBST稀释的山羊抗人IgG-HRP1∶5000中4℃孵育过夜。次日，1×PBST洗膜，加入BCL化学发光液，避光显色。结果显示：sp-scFv966-FcpcDNA3.1或sp-scFv966-FcpMH3两种表达载体均成功表达重组蛋白scFv966-Fc图4A，其氨基酸序列如SEQIDNo:17所示。5、ELISA检测表达的scFv966-Fc重组抗体收取转染后72h的sp-scFv966-FcpcDNA3.1或sp-scFv966-FcpMH3组和空载体的对照组的HEK293F细胞和细胞培养上清液，超声裂解细胞，离心取上清。将细胞培养上清液或细胞裂解上清分别用包被液0.1molLNaHCO3Na2CO3溶液稀释后，4℃包被酶标板过夜。次日，1×PBST洗板3次，每次5min，用封闭液5％脱脂奶粉1×PBST37℃封闭酶标孔1h。1×PBST洗板3次，每次5min；加入1×PBST稀释的HRP标记的山羊抗人IgG-HRP1∶5000，37℃孵育1h；再次洗涤后，加入TMB底物缓冲液避光显色15～30min。硫酸终止反应后酶标仪读取450nm处的吸光度A450值。scFv966-Fc重组蛋白于sp-scFv966-FcpMH3表达载体中的表达量高于sp-scFv966-FcpcDNA3.1，细胞裂解中的重组蛋白表达量高于细胞培养上清液图4B。实施例四、抗CD20scFv-Fc重组抗体功能初步鉴定一、Raji细胞培养：以含10％胎牛血清的RPMImedium1640solarbio完全培养基，于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，当细胞汇合度达到80％时进行传代。二、ELISA检测重组蛋白与CD20抗原的结合能力将CD20抗原用包被液0.1molLNaHCO3Na2CO3溶液稀释后加入酶标孔，4℃包被过夜。次日1×PBST洗涤后，用封闭液5％脱脂奶粉1×PBST37℃封闭1h；1×PBST洗涤后，加入sp-scFv966-FcpMH3重组载体表达的scFv966-Fc以及空载体的对照组，37℃孵育1h；1×PBST洗涤后，加入1×PBST稀释的HRP标记的山羊抗人IgG-HRP1∶5000，37℃孵育1h；再次洗涤后，加入TMB底物缓冲液避光显色15～30min；加入硫酸终止反应，酶标仪读取450nm处的吸光度A450值。结果如图5所示，重组抗体scFv966-Fc能够与CD20抗原的结合，且其结合能力具有一定的浓度依赖性。三、细胞增殖-抑制实验检测抗CD20重组抗体对Raji细胞的抑制功能Raji细胞以3×104个孔接种于96孔板，加入sp-scFv966-FcpMH3重组载体表达的抗CD20scFv966-Fc重组抗体，转染空载体的细胞裂解液作为对照组，于37℃共孵育24h，加入CCK-8溶液，10μl孔，37℃孵育后于酶标仪读取A450。抑制率＝[Ac-As][Ac-Ab]×100％Ac：对照孔含有细胞的培养基、CCK-8，不含表达抗体As：实验孔含有细胞的培养基、CCK-8，表达的抗体Ab：空白孔不含有细胞的培养基、CCK-8，不含表达抗体结果如图6所示，scFv966-Fc对Raji细胞的抑制率约为29％，对照组空载体pMH3组对Raji细胞的抑制率约为10％，单样本t检验统计分析，差异有统计学意义p西南医科大学全人源抗CD20重组抗体18115PRT人工序列连接肽1GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510152126PRT人工序列scFv966的重链可变区2MetGlyProGlyAlaAlaAlaGlyValGlyGlyAspValValGlnPro151015GlyArgSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheSerPheThr202530SerTyrGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu354045TrpValAlaValIlePheSerAspGlyThrIleIleTyrTyrAlaAsp505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnLeuLysAsnThr65707580ValSerLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr859095TyrCysAlaArgAspGlyCysSerGlyIleSerCysSerIleTyrTrp100105110TyrPheAspLeuTrpGlyArgGlyThrLeuValThrValSer1151201253112PRT人工序列scFv966的轻链可变区3SerTyrValLeuThrGlnProProSerAlaSerGlyProProGlyGln151015ArgValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlySerAsn202530ThrValAspTrpTyrGlnGlnHisProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IlePheGlyAspAsnGlnArgProSerGlyValProAspArgPheSer505560SerGlySerArgSerGlyThrSerAlaSerLeuAlaIleSerGlyLeu65707580HisSerGluAspGluThrAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSer859095LeuLeuGlyProValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105110427DNA人工序列scFv966-F4cccatcgatatgggcccaggtgcagct27529DNA人工序列scFv966-R5ccgctcgagacctaggacggtcagcttgg29619PRT人工序列信号肽SP6MetAspTrpThrTrpArgIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrGly151015ThrHisAla745DNA人工序列SPF-HindIII7cccaagcttgccgccgccgccaccatggactggaccctggagaat45827DNA人工序列SPR-KpnI8ggggtaccggcgtgggtgcctgtagct27954DNA人工序列pcDNA3.1-KpnI-Fc-F9cggggtaccatcgataccggtggcgcgcctctcgaggagcccaaatcttgtgac541040DNA人工序列pcDNA3.1-XbaI-Fc-R10ctagtctagagcggccgctcatttacccggagacagggag401120DNA人工序列T7-F11taatacgactcactataggg201218DNA人工序列BGH-R12tagaaggcacagtcgagg18136910DNA人工序列载体sp-scFv966-FcpcDNA3.113gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg60ccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcg120cgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgc180ttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacatt240gattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatata300tggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacc360cccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcc420attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgt480atcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcatt540atgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtca600tcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg660actcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcacc720aaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcg780gtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaaccca840ctgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagc900gtttaaacttaagcttgccgccgccgccaccatggactggacctggagaatcctcttctt960ggtggcagcagctacaggcacccacgccggtaccatcgatatgggcccaggtgcagctgc1020aggagtcgggggagacgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtc1080tggattcagcttcactagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggct1140ggagtgggtggcagttatcttttctgatggcactattatatactatgcagactctgtgaa1200gggccgattcaccatctccagagacaacctcaagaacacggtgtctctgcaaatgaacag1260cctgagagccgaggacacggctgtgtattattgtgcgagagatggttgtagtggtatcag1320ctgctccatctactggtatttcgatctctggggccgtggcaccctggtcaccgtctcctc1380aggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatcctcctatgtgctgac1440tcagccaccctcagcgtctgggccccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaag1500cagctccaacatcggaagtaatactgtagattggtaccagcagcacccaggaacggcccc1560caaactcctcatctttggtgataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctgg1620ctccaggtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccattctgaggatgagac1680tgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgctcggtccggtattcggcggagggac1740caagctgaccgtcctaggtctcgaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgccc1800accgtgcctagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc1860caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgag1920ccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc1980caagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtccgcac2040cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagc2100cctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca2160ggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctg2220cctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc2280ggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcta2340cagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgt2400gatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa2460atgagcggccgctctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttct2520agttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgcc2580actcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgt2640cattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaat2700agcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctgg2760ggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtg2820gttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttc2880ttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctc2940cctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggt3000gatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggag3060tccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcg3120gtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgag3180ctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtg3240gaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcag3300caaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatc3360tcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgc3420ccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccg3480aggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctag3540gcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacag3600gatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgctt3660gggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccg3720ccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccg3780gtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcg3840ttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgg3900gcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatcca3960tcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgacc4020accaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatc4080aggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctca4140aggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccga4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权利要求：1.一种抗CD20单链抗体，其特征在于：所述单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。2.如权利要求1所述的抗CD20单链抗体，其特征在于：所述单链抗体的重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接，所述连接肽linker的氨基酸序列为Gly4Ser3。3.一种全人源抗CD20重组抗体，其特征在于：所述重组抗体包含权利要求2所述的单链抗体和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列，该重组抗体的氨基酸序列如SEQIDNo:17所示。4.一种表达全人源抗CD20重组抗体的真核表达载体，其特征在于：所述真核表达载体由将权利要求2所述的抗CD20单链抗体的序列插入通用表达载体sp-FcpcDNA3.1中得到，所述通用表达载体sp-FcpcDNA3.1的核酸序列如SEQIDNo:18所示。5.如权利要求4所述的表达全人源抗CD20重组抗体的真核表达载体，其特征在于：所述真核表达载体为sp-scFv966-FcpcDNA3.1，其核酸序列如SEQIDNo:13所示。6.一种表达全人源抗CD20重组抗体的重组表达载体，其特征在于：所述重组载体是通过以下方法构建得到：以权利要求5所述的真核表达载体为模板，采用PCR扩增引物扩增片段sp-scFv966-Fc，将得到的扩增片段插入pMH3载体即得重组载体sp-scFv966-FcpMH3。7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述PCR扩增引物为SP-F、Fc-R，SP-F的序列如SEQIDNo:14所示，Fc-R的序列如SEQIDNo:15所示。8.如权利要求6或7所述的重组表达载体，其特征在于：所述扩增片段插入pMH3载体的方法为先将以权利要求5所述的真核表达载体为模板扩增得到的sp-scFv966-Fc片段和pMH3载体采用EcoRI和NotI双酶切后进行连接。

百度查询： 西南医科大学 全人源抗CD20重组抗体

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