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【发明授权】防治癌症的阳离子聚合物纳米粒/hIL-22BP基因复合物及其制备方法和用途_四川大学_201910649942.5 

申请/专利权人:四川大学

申请日:2019-07-18

公开(公告)日:2021-02-09

公开(公告)号:CN110327299B

主分类号:A61K9/14(20060101)

分类号:A61K9/14(20060101);A61K48/00(20060101);A61K47/34(20170101);A61K47/18(20060101);A61P35/00(20060101);A61K38/17(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.02.09#授权;2019.11.08#实质审查的生效;2019.10.15#公开

摘要:本发明涉及防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL‑22BP基因复合物及其制备方法和用途,属于生物制药领域。本发明提供了防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL‑22BP基因复合物,它是阳离子聚合物纳米粒和含有hIL‑22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合得到的。本发明复合物可通过直接诱导肿瘤细胞凋亡、以及阻断IL‑22IL‑22R1跨膜信号进而弱化肿瘤细胞的生长增殖信号,实现对肿瘤细胞增殖的阻碍作用,达到治疗肿瘤的效果。动物实验证明,本发明复合物具有抑制肺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤生长的作用,平均肿瘤抑制率超过60%,是一种应用前景广阔的癌症治疗药物。

主权项:1.防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物,其特征是:它是阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合得到的,其中,阳离子聚合物纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体的质量比例为20~30:1,所述hIL-22BP编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述阳离子聚合物纳米粒是以阳离子脂质和聚合物材料为原料制备而成的;所述阳离子脂质为DOTAP、DC-Cholesterol或其混合物;所述聚合物材料选自mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA中一种或两种以上;所述复合的方法是将阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体分散于水溶液中,充分混合均匀,即得复合物,所述水溶液选自超纯水和或去离子水。

全文数据:防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物及其制备方法和用途技术领域本发明涉及防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物及其制备方法和用途,属于生物制药领域。背景技术基因治疗是肿瘤生物治疗的重要手段之一,多个基因治疗产品已在肿瘤的临床治疗中发挥作用。作为基因治疗药物的重要组成部分,用于肿瘤治疗的治疗性基因通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡以及调控抗肿瘤免疫等机制,实现抗肿瘤治疗效果。进一步寻找和开发具有良好治疗作用的基因是肿瘤基因治疗仍需解决的重要课题。白细胞介素是公认的固有免疫及适应免疫相关疾病最重要的调节因子之一。白细胞介素-22Interleukin-22,IL-22主要由适应性免疫细胞CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞等和固有免疫细胞LTi细胞、NK细胞等分泌,属于IL-10细胞因子家族成员。自从2000年IL-22被发现以来,已被证实在众多组织的内皮细胞中发挥包括抗炎和免疫调节在内的重要作用。IL-22一方面可促进组织的增殖和再生以及调节宿主的黏膜屏障防御,另一方面也可能引起组织病理性的炎症反应。作为肿瘤微环境中的炎性细胞因子之一,IL-22在包括结肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤恶性肿瘤等恶性肿瘤的发生、发展、增殖、凋亡以及侵袭转移中发挥着重要作用。例如,有研究发现,IL-22及其跨膜受体IL-22R1在结肠癌组织中高表达,且表达量与肿瘤体积大小呈正相关;IL-22IL-22R1可通过激活STAT3信号通路抑制肿瘤细胞的凋亡并促进肿瘤的生长和转移;此外,IL-22还能通过固有淋巴细胞的表达促进结肠癌的发生发展。因此,IL-22是肿瘤治疗的重要分子靶点之一。IL-22结合蛋白IL-22bindingprotein,IL-22BP是IL-22除IL-22R1外的另一受体IL-22R2。该受体以可溶性蛋白的方式存在于细胞外,能与IL-22R1竞争性结合游离的IL-22因子,并阻断IL-22的相关生物学活性,从而阻止细胞因子下游的信号传导,是IL-22的可溶性拮抗剂。由于IL-22BP与IL-22的结合有高特异性和高亲和性,故IL-22BP在体内可以有效调节IL-22的生物活性。此外,IL-22BP在体内的表达与IL-22IL-22R1功能呈高度相关性,当后者功能失衡时会大量表达,以起到控制和平衡作用。因此,IL-22BP在调节IL-22诱导的炎症和免疫反应方面具有重要作用。由于IL-22IL-22R1可通过激活STAT3信号通路等方式抑制肿瘤细胞的凋亡并促进肿瘤的发生、生长和转移,促进恶性肿瘤的发生和发展。此外,IL-22BP在细胞中的表达还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增殖。因此,通过促使肿瘤细胞对可溶性IL-22BP受体的分泌表达,提高对胞外游离IL-22因子的中和作用,阻断或减少IL-22与肿瘤细胞膜上的IL-22R1跨膜受体结合,进而弱化肿瘤细胞受IL-22调控的生长增殖信号,且同时诱导肿瘤细胞凋亡杀伤,可实现对肿瘤细胞增殖的阻碍作用,达到治疗肿瘤的效果。发明内容本发明的目的在于提供防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物及其制备方法和用途。本发明提供了防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物,它是阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合得到的,其中,阳离子聚合物纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体的质量比例为3~30:1,所述hIL-22BP编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述阳离子聚合物纳米粒是以阳离子脂质和聚合物材料为原料制备而成的。进一步地,所述复合的方法是将阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体分散于水溶液中,充分混合均匀,即得复合物。优选地,混合后溶液静置5~30分钟。优选地,混合后溶液静置15分钟。优选地,于室温静置。进一步地,所述水溶液选自5%葡萄糖溶液、生理盐水、超纯水或去离子水中一种或两种以上。进一步地,所述阳离子聚合物纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体的质量比例为10:1或30:1。进一步地,所述阳离子聚合物纳米粒用薄膜水化法制备得到。优选地,所述阳离子聚合物纳米粒用下述方法制备得到:将阳离子脂质和聚合物材料共同溶解于溶剂中,除去溶剂后成膜,将膜取出溶解于水溶液中,充分震荡,即得。优选地,所述溶剂为二氯甲烷。优选地,通过旋转蒸发除去溶剂。优选地,所述水溶液选自5%葡萄糖溶液、生理盐水、超纯水或去离子水中一种或两种以上。进一步地,所述阳离子脂质为DOTAP、DC-Cholesteral或其混合物。优选地,所述阳离子脂质为DOTAP。进一步地,所述聚合物材料选自mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA中一种或两种以上。优选地,所述聚合物材料为mPEG-PCL。优选地,mPEG-PCL的分子量为4000~10000Da。优选地,mPEG-PCL的分子量为4000Da,其中mPEG片段为2000Da,PCL片段为2000Da。进一步地,所述阳离子聚合物纳米粒是以DOTAP和mPEG-PCL为原料制备而成的,其中DOTAP:mPEG-PCL的质量比例为1:1~20。优选地,DOTAP:mPEG-PCL的质量比例为1:9。进一步地,所述的载体为质粒载体。优选地,所述的载体为pVAX1。进一步地,所述含有hIL-22BP编码基因的重组载体,其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地,所述含有hIL-22BP编码基因的重组载体由下述方法制备得到:用HindIII和XbalI限制性内切酶酶切载体,回收载体片段,与用相同限制性内切酶酶切处理并回收的hIL-22BP编码基因片段进行连接反应,即得。本发明提供了所述复合物制备方法:将阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合,即得。本发明提供了所述复合物在制备抗癌药物中的用途。优选地,所述的药物是抗结肠癌、卵巢癌、肺癌和或肝癌的药物。本发明提供了抗癌的药物组合物,它是以所述复合物为活性成分,加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。进一步地,所述的制剂为注射制剂或口服制剂。进一步地,所述的制剂是抗结肠癌、卵巢癌、肺癌和或肝癌的制剂。本发明中,所述hIL-22BP编码基因所编码的蛋白质氨基酸序列SEQIDNo.5,263aa为:MMPKHCFLGFLISFFLTGVAGTQSTHESLKPQRVQFQSRNFHNILQWQPGRALTGNSSVYFVQYKIMFSCSMKSSHQKPSGCWQHISCNFPGCRTLAKYGQRQWKNKEDCWGTQELSCDLTSETSDIQEPYYGRVRAASAGSYSEWSMTPRFTPWWETKIDPPVMNITQVNGSLLVILHAPNLPYRYQKEKNVSIEDYYELLYRVFIINNSLEKEQKVYEGAHRAVEIEALTPHSSYCVVAEIYQPMLDRRSQRSEERCVEIP。本发明提供了一种新型的阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物,该复合物可通过直接诱导肿瘤细胞凋亡、以及阻断IL-22IL-22R1跨膜信号进而弱化肿瘤细胞的生长增殖信号,实现对肿瘤细胞增殖的阻碍作用,达到治疗肿瘤的效果。动物实验证明,本发明复合物具有抑制肺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤生长的作用,平均肿瘤抑制率超过60%,是一种应用前景广阔的癌症治疗药物。附图说明图1为实施例1中pVAX1质粒载体结构示意图;图2为实施例1中pVAX1-hIL-22BP质粒结构示意图;图3为实施例1中pVAX1-hIL-22BP质粒用HindIII和XbaI双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳谱图;图4为试验例1中结肠癌动物模型治疗效果图;图5为试验例2中卵巢癌动物模型治疗效果图;图6为试验例3中肺癌动物模型治疗效果图;图7为试验例4中肝癌动物模型治疗效果图。具体实施方式本发明提供了防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物,它是阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合得到的,其中,阳离子聚合物纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体的质量比例为3~30:1,所述hIL-22BP编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述阳离子聚合物纳米粒是以阳离子脂质和聚合物材料为原料制备而成的。本发明是基于发明人的下列发现而完成的:基于IL-22BP能与IL-22R1竞争性结合游离的IL-22因子,从而阻断IL-22促进肿瘤生长的相关生物学活性,以及IL-22BP在细胞中的表达可以直接诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的特性,本发明尝试构建能够在肿瘤组织中高表达IL-22BP的基因药物用于癌症的治疗。为此,发明人选择阳离子聚合物纳米粒作为基因传递系统,其具有低毒、装载容量大、制备便捷等优势。制备阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物的难点在于提高其转导效率。而发明人通过反复考察发现,纳米粒和基因的投料比例对于hIL-22BP在肿瘤组织中的表达非常关键。具体而言,纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体质量比在3~30:1的范围内,所制得的复合物才能将hIL-22BP基因载体有效地导入细胞,才能获得理想的hIL-22BP基因转录水平,以确保表达出的人IL-22BP蛋白对肿瘤发挥明显的治疗效果。上述考察结果详述如下:表1纳米粒和基因投料比例对于转导效率的影响注:上表所涉及到的重组载体、纳米粒参照实施例1、2的方法制备,区别只在于投料比不同。基因导入效率的检测方法如下:用移液枪将转染后的细胞从孔内吹打下来,收集于流式管中;并用1mlPBS溶液重新清洗,将剩余的细胞也一并收集于流式管,以1500rpm离心3min,弃上清,加入1mlPBS重悬。重复洗涤两次,最后根据细胞沉淀的多少加入适量PBS重悬细胞沉淀后使用流式细胞仪检测转染效率。胞内IL-22BP的mRNA水平检测方法如下:转染48小时后,使用Trizol法提取细胞总RNA,并将所获RNA逆转录为cDNA。随后通过qPCR方法分析mRNA水平。本发明还可以具有下列附加技术特征:根据本发明的一些实施例,所述复合的方法是将阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体分散于水溶液中,充分混合均匀,即得复合物。其中,所述水溶液优选为5%葡萄糖溶液、生理盐水、超纯水或去离子水中一种或两种以上,最优选为超纯水或去离子水。相较于其它种类的溶剂环境,采用超纯水或去离子水制备得到的复合物稳定性最佳,对hIL-22BP基因载体的导入效率最优。上述考察结果详述如下:表2溶剂种类对复合物稳定性转导效率的影响注:上表所涉及到的重组载体、纳米粒参照实施例1、2的方法制备,区别只在于溶剂种类不同。基因导入效率的检测方法如下:用移液枪将转染后的细胞从孔内吹打下来,收集于流式管中;并用1mlPBS溶液重新清洗,将剩余的细胞也一并收集于流式管,以1500rpm离心3min,弃上清,加入1mlPBS重悬。重复洗涤两次,最后根据细胞沉淀的多少加入适量PBS重悬细胞沉淀后使用流式细胞仪检测转染效率。使用马尔文粒度仪分析复合物的粒径分散情况和PDI值。根据本发明的一些实施例,所述阳离子聚合物纳米粒是以DOTAP和mPEG-PCL为原料制备而成的。相较于DC-cholesterol、PEI等其它种类的阳离子脂质,或者其它聚合物材料如mPEG-PLA、mPEG-PLGA,优选的阳离子聚合物纳米粒具有稳定性高、粒径分布均匀以及粒径小、有利于基因递送导入的优势。根据本发明的一些实施例,DOTAP:mPEG-PCL的质量比例为1:1~20。由此制备得到稳定性好,并且毒性小的阳离子聚合物纳米粒。根据本发明的一些实施例,mPEG-PCL的分子量为4000~10000Da,最优选为4000Da,其中mPEG片段为2000Da,PCL片段为2000Da。由此制备得到的阳离子聚合物纳米粒粒径分布较小。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1hIL-22BP基因表达质粒的构建1.hIL-22BP基因的获得1依据美国国立生物技术信息中心NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation数据库中hIL-22BPGeneID:116379,NM_052962的编码序列合成含有全长hIL-22BP基因序列的cDNA质粒。hIL-22BP的编码序列SEQIDNO.1,792bp为:ATGATGCCTAAACATTGCTTTCTAGGCTTCCTCATCAGTTTCTTCCTTACTGGTGTAGCAGGAACTCAGTCAACGCATGAGTCTCTGAAGCCTCAGAGGGTACAATTTCAGTCCCGAAATTTTCACAACATTTTGCAATGGCAGCCTGGGAGGGCACTTACTGGCAACAGCAGTGTCTATTTTGTGCAGTACAAAATCATGTTCTCATGCAGCATGAAAAGCTCTCACCAGAAGCCAAGTGGATGCTGGCAGCACATTTCTTGTAACTTCCCAGGCTGCAGAACATTGGCTAAATATGGACAGAGACAATGGAAAAATAAAGAAGACTGTTGGGGTACTCAAGAACTCTCTTGTGACCTTACCAGTGAAACCTCAGACATACAGGAACCTTATTACGGGAGGGTGAGGGCGGCCTCGGCTGGGAGCTACTCAGAATGGAGCATGACGCCGCGGTTCACTCCCTGGTGGGAAACAAAAATAGATCCTCCAGTCATGAATATAACCCAAGTCAATGGCTCTTTGTTGGTAATTCTCCATGCTCCAAATTTACCATATAGATACCAAAAGGAAAAAAATGTATCTATAGAAGATTACTATGAACTACTATACCGAGTTTTTATAATTAACAATTCACTAGAAAAGGAGCAAAAGGTTTATGAAGGGGCTCACAGAGCGGTTGAAATTGAAGCTCTAACACCACACTCCAGCTACTGTGTAGTGGCTGAAATATATCAGCCCATGTTAGACAGAAGAAGTCAGAGAAGTGAAGAGAGATGTGTGGAAATTCCATGA。2设计并合成相应的引物上游引物:5’-GGGAAAGCTTATGATGCCTAAACATTGCTTTC-3’SEQIDNO.2,设计引入了HindIII酶切位点;下游引物5’-GGGATCTAGATCATGGAATTTCCACACATCTC-3’SEQIDNO.3,设计引入了XbalI酶切位点;通过PCR扩增得到hIL-22BP的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳回收该片段,得到hIL-22BP基因片段。2.pVAX1-hIL-22BP质粒的克隆构建1使用HindIII和XbalI限制性内切酶,在37°下双酶切真核表达载体pVAX1,琼脂糖凝胶电泳回收相应大小的线性化的pVAX1载体片段,与用相同条件酶切处理并通过琼脂糖凝胶电泳回收的hIL-22BP基因片段于37℃水浴进行连接反应2小时,连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆,置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜,次日提取pVAX1-hIL-22BP质粒重组质粒。pVAX1质粒载体的结构如图1所示,pVAX1-hIL-22BP质粒的结构如图2所示。2将pVAX1-hIL-22BP质粒分别用HindIII和XbalI限制性内切酶进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳图谱见图3,其中M表示DNAMarker,1表示pVAX1-hIL-22BP质粒,2表示pVAX1-hIL-22BP的双酶切结果。图3表明连接成功。所构建的pVAX1-hIL-22BP载体全长3717bp,全序列SEQIDNO.4,3717bp为:GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTATGATGCCTAAACATTGCTTTCTAGGCTTCCTCATCAGTTTCTTCCTTACTGGTGTAGCAGGAACTCAGTCAACGCATGAGTCTCTGAAGCCTCAGAGGGTACAATTTCAGTCCCGAAATTTTCACAACATTTTGCAATGGCAGCCTGGGAGGGCACTTACTGGCAACAGCAGTGTCTATTTTGTGCAGTACAAAATCATGTTCTCATGCAGCATGAAAAGCTCTCACCAGAAGCCAAGTGGATGCTGGCAGCACATTTCTTGTAACTTCCCAGGCTGCAGAACATTGGCTAAATATGGACAGAGACAATGGAAAAATAAAGAAGACTGTTGGGGTACTCAAGAACTCTCTTGTGACCTTACCAGTGAAACCTCAGACATACAGGAACCTTATTACGGGAGGGTGAGGGCGGCCTCGGCTGGGAGCTACTCAGAATGGAGCATGACGCCGCGGTTCACTCCCTGGTGGGAAACAAAAATAGATCCTCCAGTCATGAATATAACCCAAGTCAATGGCTCTTTGTTGGTAATTCTCCATGCTCCAAATTTACCATATAGATACCAAAAGGAAAAAAATGTATCTATAGAAGATTACTATGAACTACTATACCGAGTTTTTATAATTAACAATTCACTAGAAAAGGAGCAAAAGGTTTATGAAGGGGCTCACAGAGCGGTTGAAATTGAAGCTCTAACACCACACTCCAGCTACTGTGTAGTGGCTGAAATATATCAGCCCATGTTAGACAGAAGAAGTCAGAGAAGTGAAGAGAGATGTGTGGAAATTCCATGATCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT。实施例2本发明DMP阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物的制备1、DOTAP-mPEG-PCL聚合物纳米粒溶液的制备将阳离子脂质2,3-二油酰基-丙基-三甲胺1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP与甲基聚乙二醇-聚己内酯mPEG-PCL高分子聚合物分子量为4000Da,PEG-PCL=2000Da-2000Da按1:9的质量比进行混合,并将混合物用二氯甲烷进行溶解,并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸30min后成膜。所成的膜取出后溶解于去离子水中,然后在60℃水浴条件下震荡5min,得到特定浓度的DMP阳离子聚合物纳米粒溶液。2、制备hIL-22BP基因表达质粒将pVAX1-hIL-22BP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆,置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜,次日提取pVAX1-hIL-22BP质粒重组质粒。经过检测所纯化的质粒能够符合体内外实验的要求。3、DMP阳离子纳米粒hIL-22BP质粒DNA基因复合物的制备按DMP阳离子纳米粒:DNA以10:1ww的比例将纳米粒溶液分散于去离子水中,浓度为5mgmL加入到pVAX1-IL-22BP溶液分散于去离子水中,浓度为1mgmL中,之后立刻用移液枪吹打混匀,再在室温环境静置15分钟,即得DMP阳离子纳米粒质粒DNA复合物。实施例3本发明DCMP阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物的制备1、DC-Cholesterol-mPEG-PCL聚合物纳米粒溶液的制备将阳离子脂质3β-[N-N',N'-二甲基胺乙基胺基甲酰基]胆固醇3β-[N-N,N-dimethylaminoethane-carbamoyl]cholesterolhydrochloride,DC-Cholesteral与甲基聚乙二醇-聚己内酯mPEG-PCL高分子聚合物分子量为4000Da,PEG-PCL=2000Da-2000Da按1:9的质量比进行混合,并将混合物用二氯甲烷进行溶解,并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸30min后成膜。所成的膜取出后溶解于去离子水溶液中,然后在60℃水浴条件下震荡5min,得到特定浓度的DCMP阳离子聚合物纳米粒溶液。2、制备hIL-22BP基因表达质粒将pVAX1-hIL-22BP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆,置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜,次日提取pVAX1-hIL-22BP质粒重组质粒。经过检测所纯化的质粒能够符合体内外实验的要求。3、DCMP阳离子纳米粒hIL-22BP质粒DNA基因复合物的制备按DCMP阳离子纳米粒:DNA以10:1ww的比例将纳米粒溶液分散于去离子水中,浓度为5mgmL加入到pVAX1-hIL-22BP溶液分散于去离子水中,浓度为1mgmL中,之后立刻用移液枪吹打混匀,再在室温环境静置15分钟,即得本发明DCMP阳离子纳米粒质粒DNA复合物。实施例4本发明DPA阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物的制备1、DOTAP-mPEG-PLA聚合物纳米粒溶液的制备将阳离子脂质2,3-二油酰基-丙基-三甲胺1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP与α-甲基聚氧乙烯-聚D,L-丙交酯mPEG-PLA高分子聚合物分子量为4000Da,PEG-PLA=2000Da-2000Da按1:9的质量比进行混合,并将混合物用二氯甲烷进行溶解,并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸30min后成膜。所成的膜取出后溶解于去离子水溶液中,然后在60℃水浴条件下震荡5min,得到特定浓度的DPA阳离子聚合物纳米粒溶液。2、制备hIL-22BP基因表达质粒将pVAX1-hIL-22BP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆,置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜,次日提取pVAX1-hIL-22BP质粒重组质粒。经过检测所纯化的质粒能够符合体内外实验的要求。3、DPA阳离子纳米粒hIL-22BP质粒DNA基因复合物的制备按DPA阳离子纳米粒:DNA以10:1ww的比例将纳米粒溶液分散于去离子水中,浓度为5mgmL加入到pVAX1-hIL-22BP溶液分散于去离子水中,浓度为1mgmL中,之后立刻用移液枪吹打混匀,再在室温环境静置15分钟,即得本发明DPA阳离子纳米粒质粒DNA复合物。实施例5本发明DPGA阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物的制备1、DOTAP-mPEG-PLGA聚合物纳米粒溶液的制备将阳离子脂质2,3-二油酰基-丙基-三甲胺1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP与甲氧基聚乙二醇-聚乙丙交酯mPEG-PLGA高分子聚合物分子量为4000Da,PEG-PLGA=2000Da-2000Da按1:9的质量比进行混合,并将混合物用二氯甲烷进行溶解,并置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸30min后成膜。所成的膜取出后溶解于去离子水溶液中,然后在60℃水浴条件下震荡5min,得到特定浓度的DPGA阳离子聚合物纳米粒溶液。2、制备hIL-22BP基因表达质粒将pVAX1-hIL-22BP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。24小时后挑提取克隆,置于3mL含有卡那霉素的LB培养基中摇菌培养过夜,次日提取pVAX1-hIL-22BP质粒重组质粒。经过检测所纯化的质粒能够符合体内外实验的要求。3、DPGA阳离子纳米粒hIL-22BP质粒DNA基因复合物的制备按DPGA阳离子纳米粒:DNA以10:1ww的比例将纳米粒溶液分散于去离子水中,浓度为5mgmL加入到pVAX1-hIL-22BP溶液分散于去离子水中,浓度为1mgmL中,之后立刻用移液枪吹打混匀,再在室温环境静置15分钟,即得本发明DPGA阳离子纳米粒质粒DNA复合物。以下通过试验例证明本发明的有益效果。试验例1本发明阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物抗结肠癌试验为了研究阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物在体内的抗肿瘤效应,在BalBc-nu小鼠6-8周龄,雌性皮下建立了人结肠癌异位移植瘤模型。将体外培养的HCT116人结肠癌细胞用胰蛋白酶消化,并定容在无血清、无抗生素的1640培养基中,在每只小鼠的皮下接种1×107个细胞,细胞接种7天后,开始按以下进行随机分组治疗每组5只:A空白对照组:5%的葡萄糖溶液;B空载质粒对照组:阳离子纳米粒pVAX基因复合物置于5%的葡萄糖溶液中;CIL-22BP治疗组:DMP阳离子纳米粒hIL-22BP基因复合物置于5%的葡萄糖溶液中。采取瘤内注射方式进行治疗,DMP阳离子纳米粒DNA复合物按实施例1、2的方法制备,其配比如下:质粒DNA:阳离子纳米粒=1:10WW,将阳离子纳米粒DNA复合物稀释在葡萄糖溶液中,并调整使得葡萄糖终浓度为5%。每次每只小鼠的注射体积为100μL,其中含质粒5μg以及阳离子纳米粒50μg。每天给药1次,共治疗7次。治疗开始后每天测量肿瘤体积大小。治疗结束后第9天将动物处死并解剖,分离皮下肿瘤组织并进行称重。肿瘤生长抑制用方差分析,P四川大学防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物及其制备方法和用途A190607K5SIPOSequenceListing1.01792DNA人工序列ArtificialSequence1atgatgcctaaacattgctttctaggcttcctcatcagtttcttccttactggtgtagca60ggaactcagtcaacgcatgagtctctgaagcctcagagggtacaatttcagtcccgaaat120tttcacaacattttgcaatggcagcctgggagggcacttactggcaacagcagtgtctat180tttgtgcagtacaaaatcatgttctcatgcagcatgaaaagctctcaccagaagccaagt240ggatgctggcagcacatttcttgtaacttcccaggctgcagaacattggctaaatatgga300cagagacaatggaaaaataaagaagactgttggggtactcaagaactctcttgtgacctt360accagtgaaacctcagacatacaggaaccttattacgggagggtgagggcggcctcggct420gggagctactcagaatggagcatgacgccgcggttcactccctggtgggaaacaaaaata480gatcctccagtcatgaatataacccaagtcaatggctctttgttggtaattctccatgct540ccaaatttaccatatagataccaaaaggaaaaaaatgtatctatagaagattactatgaa600ctactataccgagtttttataattaacaattcactagaaaaggagcaaaaggtttatgaa660ggggctcacagagcggttgaaattgaagctctaacaccacactccagctactgtgtagtg720gctgaaatatatcagcccatgttagacagaagaagtcagagaagtgaagagagatgtgtg780gaaattccatga792232DNA人工序列ArtificialSequence2gggaaagcttatgatgcctaaacattgctttc32332DNA人工序列ArtificialSequence3gggatctagatcatggaatttccacacatctc3243717DNA人工序列ArtificialSequence4gactcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttatta60atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata120acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat180aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga240ctatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc300ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt360atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat420gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag480tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc540aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga600ggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcga660aattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttatg720atgcctaaacattgctttctaggcttcctcatcagtttcttccttactggtgtagcagga780actcagtcaacgcatgagtctctgaagcctcagagggtacaatttcagtcccgaaatttt840cacaacattttgcaatggcagcctgggagggcacttactggcaacagcagtgtctatttt900gtgcagtacaaaatcatgttctcatgcagcatgaaaagctctcaccagaagccaagtgga960tgctggcagcacatttcttgtaacttcccaggctgcagaacattggctaaatatggacag1020agacaatggaaaaataaagaagactgttggggtactcaagaactctcttgtgaccttacc1080agtgaaacctcagacatacaggaaccttattacgggagggtgagggcggcctcggctggg1140agctactcagaatggagcatgacgccgcggttcactccctggtgggaaacaaaaatagat1200cctccagtcatgaatataacccaagtcaatggctctttgttggtaattctccatgctcca1260aatttaccatatagataccaaaaggaaaaaaatgtatctatagaagattactatgaacta1320ctataccgagtttttataattaacaattcactagaaaaggagcaaaaggtttatgaaggg1380gctcacagagcggttgaaattgaagctctaacaccacactccagctactgtgtagtggct1440gaaatatatcagcccatgttagacagaagaagtcagagaagtgaagagagatgtgtggaa1500attccatgatctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagt1560tgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccact1620cccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcat1680tctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagc1740aggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagcaa1800gcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaa1860actggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaag1920agacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccgg1980ccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctg2040atgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacc2100tgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacga2160cgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgc2220tattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaag2280tatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccat2340tcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttg2400tcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgcca2460ggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgct2520tgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgg2580gtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttg2640gcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagc2700gcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcc2760tgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacaggtggcac2820ttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatat2880gtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacgtgctaaaact2940tcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaat3000cccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatc3060ttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgct3120accagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactgg3180cttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccacca3240cttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggc3300tgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccgga3360taaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaac3420gacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccga3480agggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgag3540ggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg3600acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccag3660caacgcggcctttttacggttcctgggcttttgctggccttttgctcacatgttctt37175263PRT人工序列ArtificialSequence5MetMetProLysHisCysPheLeuGlyPheLeuIleSerPhePheLeu151015ThrGlyValAlaGlyThrGlnSerThrHisGluSerLeuLysProGln202530ArgValGlnPheGlnSerArgAsnPheHisAsnIleLeuGlnTrpGln354045ProGlyArgAlaLeuThrGlyAsnSerSerValTyrPheValGlnTyr505560LysIleMetPheSerCysSerMetLysSerSerHisGlnLysProSer65707580GlyCysTrpGlnHisIleSerCysAsnPheProGlyCysArgThrLeu859095AlaLysTyrGlyGlnArgGlnTrpLysAsnLysGluAspCysTrpGly100105110ThrGlnGluLeuSerCysAspLeuThrSerGluThrSerAspIleGln115120125GluProTyrTyrGlyArgValArgAlaAlaSerAlaGlySerTyrSer130135140GluTrpSerMetThrProArgPheThrProTrpTrpGluThrLysIle145150155160AspProProValMetAsnIleThrGlnValAsnGlySerLeuLeuVal165170175IleLeuHisAlaProAsnLeuProTyrArgTyrGlnLysGluLysAsn180185190ValSerIleGluAspTyrTyrGluLeuLeuTyrArgValPheIleIle195200205AsnAsnSerLeuGluLysGluGlnLysValTyrGluGlyAlaHisArg210215220AlaValGluIleGluAlaLeuThrProHisSerSerTyrCysValVal225230235240AlaGluIleTyrGlnProMetLeuAspArgArgSerGlnArgSerGlu245250255GluArgCysValGluIlePro260

权利要求:1.防治癌症的阳离子聚合物纳米粒hIL-22BP基因复合物,其特征是:它是阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合得到的,其中,阳离子聚合物纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体的质量比例为3~30:1,所述hIL-22BP编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述阳离子聚合物纳米粒是以阳离子脂质和聚合物材料为原料制备而成的。2.如权利要求1所述的复合物,其特征是:所述复合的方法是将阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体分散于水溶液中,充分混合均匀,即得复合物;优选地,混合后溶液静置5~30分钟;优选地,混合后溶液静置15分钟;优选地,于室温静置。3.如权利要求2所述的复合物,其特征是:所述水溶液选自5%葡萄糖溶液、生理盐水、超纯水或去离子水中一种或两种以上。4.如权利要求1所述的复合物,其特征是:所述阳离子聚合物纳米粒:含有hIL-22BP编码基因的重组载体的质量比例为10:1或30:1。5.如权利要求1所述的复合物,其特征是:所述阳离子聚合物纳米粒用薄膜水化法制备得到;优选地,所述阳离子聚合物纳米粒用下述方法制备得到:将阳离子脂质和聚合物材料共同溶解于溶剂中,除去溶剂后成膜,将膜取出溶解于水溶液中,充分震荡,即得;优选地,所述溶剂为二氯甲烷;优选地,通过旋转蒸发除去溶剂;优选地,所述水溶液选自5%葡萄糖溶液、生理盐水、超纯水或去离子水中一种或两种以上。6.如权利要求1或5所述的复合物,其特征是:所述阳离子脂质为DOTAP、DC-Cholesteral或其混合物;优选地,所述阳离子脂质为DOTAP。7.如权利要求1或5所述的复合物,其特征是:所述聚合物材料选自mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA中一种或两种以上;优选地,所述聚合物材料为mPEG-PCL;优选地,mPEG-PCL的分子量为4000~10000Da;优选地,mPEG-PCL的分子量为4000Da,其中mPEG片段为2000Da,PCL片段为2000Da。8.如权利要求1、5~7任意一项所述的复合物,其特征是:所述阳离子聚合物纳米粒是以DOTAP和mPEG-PCL为原料制备而成的,其中DOTAP:mPEG-PCL的质量比例为1:1~20;优选地,DOTAP:mPEG-PCL的质量比例为1:9。9.如权利要求1所述的复合物,其特征是:所述的载体为质粒载体;优选地,所述的载体为pVAX1。10.如权利要求1或9所述的复合物,其特征是:所述含有hIL-22BP编码基因的重组载体,其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。11.如权利要求1或9所述的复合物,其特征是:所述含有hIL-22BP编码基因的重组载体由下述方法制备得到:用HindIII和XbalI限制性内切酶酶切载体,回收载体片段,与用相同限制性内切酶酶切处理并回收的hIL-22BP编码基因片段进行连接反应,即得。12.权利要求1~11任意一项所述复合物制备方法,其特征是:将阳离子聚合物纳米粒和含有hIL-22BP编码基因的重组载体通过电荷吸附作用复合,即得。13.权利要求1~11任意一项所述复合物在制备抗癌药物中的用途;优选地,所述的药物是抗结肠癌、卵巢癌、肺癌和或肝癌的药物。14.抗癌的药物组合物,其特征是:它是以权利要求1~11任意一项所述复合物为活性成分,加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。15.如权利要求14所述的药物组合物,其特征是:所述的制剂为注射制剂或口服制剂。16.如权利要求14或15所述的药物组合物,其特征是:所述的制剂是抗结肠癌、卵巢癌、肺癌和或肝癌的制剂。

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