申请/专利权人：安徽强英鸭业集团有限公司;郝东敏

申请日：2017-12-05

公开（公告）日：2021-02-12

公开（公告）号：CN107982532B

主分类号：A61K39/42(20060101)

分类号：A61K39/42(20060101);A61K39/125(20060101);A61K47/46(20060101);A61P31/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.12#授权;2018.06.01#实质审查的生效;2018.05.04#公开

摘要：本发明公开了一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法，所述疫苗为3型鸭甲肝病毒抗原与鸭卵黄抗体按照体积比1：50混合反应后的抗原抗体复合物，与现有技术相比，本发明通过在3型鸭甲肝病毒抗原中添加硫酸镁、氯化钠和蜂胶，并用该抗原免疫产蛋鸭制备鸭卵黄抗原，最后通过卵黄抗体和3型鸭甲肝病毒抗原进行合理配比，制成3型鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗，经过多次试验表明，该方法制备获得的抗原抗体复合物结合效率该疫苗注射后2h内起效，无免疫空白期，且效价高，安全性好，保护率高，保护周期长。

主权项：1.一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗，其特征在于，包括体积比为1：50的3型鸭甲肝病毒抗原与鸭卵黄抗体组成的抗原抗体复合物，所述鸭卵黄抗体为经灭活的3型鸭甲肝病毒抗原免疫后的高免鸭蛋中提取获得的，所述3型鸭甲肝病毒为3型鸭甲肝病毒SD15株，生物保藏编号为CGMCCNo.14739。

全文数据：一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及的是禽用疫苗的技术领域，尤其涉及的是一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法。背景技术[0002]鸭甲型病毒性肝炎是由小RNA病毒科的鸭甲型肝炎病毒引起的一种急性、高度致死性传染病，目前是危害雏鸭的最主要疫病之一。鸭甲型病毒性肝炎分为三个血清型，即：DHAV-I、DHAV-2和DHAV-3。近几年，3型鸭甲肝病毒在临床上的分离率接近90%，为目前我国流行的主要血清型。[0003]现有报道证实，鸭甲型病毒性肝炎可在2-39日龄鸭发病，目前该病主要采用疫苗或高免抗体进行预防。疫苗免疫预防存在免疫空白期，对较小日龄发病鸭群无法起到很好的保护，且保护率较低。高免抗体作用时间短，仅能持续7天左右，治疗时效果较好，但用其作为免疫预防的一种措施较为不妥。[0004]抗原抗体复合物疫苗又称免疫复合物疫苗，是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照恰当的比例与抗原混合而成，其优点在于安全性高和免疫效果好，可以突破母源抗体干扰，是目前为数不多的，可以在孵化期内接种的安全疫苗，因此在动物疫病防控中备受关注。抗原抗体复合物疫苗中的抗体主要作用是延缓病毒的释放，即当母源抗体水平降低到一定水平时，复合物中的抗体开始释放复制并产生免疫保护力，因此比普通疫苗的安全性和免疫效果更好。发明内容[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，以解决现有3型鸭甲型病毒性肝炎疫苗存在免疫空白期、保护周期短等技术问题。[0006]本发明是通过以下技术方案实现的：[0007]本发明提供了一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗，包括体积比为1:50的3型鸭甲肝病毒抗原与鸭卵黄抗体组成的抗原抗体复合物。[0008]进一步地，所述3型鸭甲肝病毒抗原中含有0.4-0.5%质量比硫酸镁、0.1-0.25%质量比氯化钠和0.2-0.5%质量比蜂胶，效价范围为106'QELD5Q0.2ml-10〃ELD5Q0.2ml，所述鸭卵黄抗体为经所述3型鸭甲肝病毒抗原免疫后的高免鸭蛋中提取获得的。[0009]本发明还提供了一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，包括以下步骤：[0010]1制备3型鸭甲肝病毒抗原[0011]利用3型鸭甲肝病毒免疫尿囊接种鸭胚，置于37°C下孵育，收集接种后24-96小时内死亡的鸭胚，置于-20°C冷冻处理0.5-lh，分别收取尿囊液和胚体;将胚体去掉头和四肢后，进行充分匀浆，离心取上清与尿囊液混合，经0.22微米滤膜进行过滤后，加入0.4-0.5%质量比硫酸镁、O.l-o.25%质量比氯化钠和0.2-0.5%质量比蜂胶，混匀，获得3型鸭甲肝病毒抗原；[0012]⑵制备卵黄抗体[0013]将步骤⑴制备的抗原灭活后免疫产蛋鸭，收集抗体效价为1:64以上的高免鸭蛋，在无菌条件下，取蛋黄与生理盐水按照1:5体积比混合，搅匀过滤后，向滤液中依次加入40%体积比的甲醛溶液、青霉素溶液、链霉素溶液，使其终体积浓度分别为0.1%vv、2000-3000IUmL、2000-3000IUmL，混匀，置于37°C下反应lh，获得卵黄抗体；[0014]⑶制备疫苗[0015]将步骤（1的抗原与步骤（2的卵黄抗体按照体积比1:50混合，置于37°C孵育1-2h，获得疫苗。[0016]进一步地，所述步骤（1中，制苗用的3型鸭甲肝病毒为3型鸭甲肝病毒SD15株，由安徽强英鸭业集团有限公司分离、鉴定、保管和供应，该毒株已于2017年11月09日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，生物保藏编号为CGMCCN0.14739;该病毒株是安徽强英鸭业集团有限公司于2016年从山东淄博某肉鸭场病死鸭肝脏中分离，其生物学特征为:小RNA病毒，大小20-40纳米，可耐受乙醚和氯仿，具有一定的热稳定性，其毒力在52°C加热Ih受影响，可在鸭胚、鸡胚中增殖，但在鸭胚中繁殖更佳;该毒株相比较其他常规3型鸭甲肝病毒作为制苗毒株，具有:①免疫原性优势:免疫原性好，免疫后抗体滴度高;②体外与抗体结合能力强，IC疫苗注射鸭体内后，毒株可有效释放发挥作用;③运输优势:4°C冷链运输、冷藏保存条件下，可保存1年效价不受影响，无需冷冻保存。37°C存放21天效价不受影响;④该毒株为当前流行的鸭肝炎3型毒株，与国内大部分分离株同源性较高，基因进化树显示，与大部分流行毒株在同一分支。[0017]进一步地，所述步骤⑴中，将去掉头和四肢的胚体充分匀浆后，经反复冻融3次后再离心。[0018]进一步地，所述步骤2中，抗原灭活的方法为:在抗原中加入终浓度为0.1%体积比的甲醛，37°C下处理40h以上。[0019]进一步地，所述步骤（2中，免疫产蛋鸭的方法为：采用颈部皮下注射方式，Iml只；1周后进行一次强化免疫，颈部皮下注射，1.5ml只；2周后，再进行一次强化免疫，颈部皮下注射，2ml只；之后每隔2月进行一次免疫，颈部皮下注射，Iml只。[0020]进一步地，所述步骤2中，蛋黄与生理盐水溶液混合，依次经50目、100目滤膜负压抽滤后，再与甲醛和抗生素溶液混合。[0021]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明提供了一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，该方法通过先制备3型鸭甲肝病毒抗原，再以该抗原免疫产蛋鸭制备高免抗体，通过将卵黄抗体和3型鸭甲肝病毒抗原进行合理配比，制成3型鸭甲肝病毒抗原抗体复合物（IC疫苗，经过多次试验表明，该方法制备获得的抗原抗体复合物结合效率该疫苗注射后2h内起效，无免疫空白期，且效价高，安全性好，保护率高，保护周期长。具体实施方式[0022]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。[0023]实施例1[0024]1、材料[0025]本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。[0026]2、方'法[0027]2.13型鸭甲肝病毒抗原免疫原的制备[0028]1生产用种毒：制苗用3型鸭甲肝病毒SD15株），由安徽强英鸭业集团有限公司分离、鉴定、保管和供应，生物保藏编号:CGMCCNo.14739。[0029]2SD15株毒液制备:将生产用种毒SD15株用生理盐水作200倍稀释VV，尿囊腔接种11日龄鸭胚，每胚0.2ml，37°C孵育，每4h照胚检查一次。收集接种后24〜96小时内死亡的鸭胚，置_20°C放置0.5小时后，分别收取尿囊液及胚体，胚体去掉头和四肢。将去掉头和四肢的胚体进行充分勾楽，反复冻融3次，5000rmin离心30min，取上清与之前收取的尿囊液混合，经0.22微米滤膜进行过滤后，加入0.4%质量比硫酸镁、0.1%质量比氯化钠和0.2%质量比蜂胶，混勾，获得SDl5株病毒液，即为3型鸭甲肝病毒抗原，将SDl5株病毒液并分装于无菌玻璃瓶中，转入4-8°C冷库保存备用。[0030]3SD15株毒液效价测定：将SD15株病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10'1〇-7、1〇-84个稀释度，分别尿囊腔接种11-12日龄SPF鸭胚5枚，每胚0·2ml。同时设生理盐水对照，每胚0.2ml。接种后置37°C孵育，每4h照胚检查一次，连续观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚、胚体病变判为感染，计算eld5Q。毒液效价应在IO6^ELD500·2ml〜IO7·qELD5Q0·2ml之间，本实施例测得的效价为IO6·3ELD5Q0·2ml。[0031]4SD15株毒液无菌检验:取SD15株病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行细菌和支原体检验，应符合药典规定。[0032]2.2卵黄抗体的制备[0033]1将上述制备获得的SD15株病毒液中加入0.1%体积比）的甲醛，37°C下灭活40h后免疫产蛋鸭，采用颈部皮下注射方式，lml只；1周后进行一次强化免疫，颈部皮下注射，1.5ml只；2周后，再进行一次强化免疫，颈部皮下注射，2ml只；之后每隔2月进行一次免疫，颈部皮下注射，lml只。3次免疫后10天起，每隔3天收集一次鸭蛋进行抗体效价检测，蛋黄与灭菌生理盐水（121°C，高压蒸汽灭菌20分钟）按1:5体积比例进行稀释，稀释后溶液琼脂扩散效价在1:64以上时，收集获得高免鸭蛋，用作制备3型鸭甲肝肝炎卵黄抗体。[0034]2高免鸭蛋消毒：将收集的高免鸭蛋用自来水将表面杂质清洗干净，然后用0.15%的百毒杀溶液浸泡3-5分钟，晾干；[0035]3分离蛋黄:在无菌条件下打开蛋壳，充分去除蛋清、系带和胎盘，收集蛋黄；[0036]4稀释、搅拌:在无菌条件下，蛋黄与灭菌生理盐水按1:5VV的比例进行稀释，3000-4000rmin搅拌10分钟；[0037]5过滤:在无菌条件下，将步骤4中所述蛋黄与灭菌生理盐水溶液依次经50目、100目滤膜负压抽滤;抽滤完成后，向滤液中依次加入40%体积比的甲醛溶液、青霉素溶液、链霉素溶液，使其终体积浓度分别为:.1%vv、2000IUmL、2000IUmL，全部添加完成后，再进行充分搅拌。[0038]6反应:将步骤5中添加完甲醛和抗生素的抗体半成品置37°C反应lh，获得卵黄抗体，将卵黄抗体转入于4-8°C冷库保存备用。[0039]2.33型鸭甲肝病毒抗原抗体复合物（IC疫苗的制备[0040]1将SD15株病毒液与卵黄抗体分别按照1:30、1:40、1:50、1:60的体积比在无菌容器内进行混合。[0041]2搅拌:混合后，2000rmin，搅拌10分钟，使两者充分混匀。[0042]3孵育:将搅拌过后的疫苗置于37°C孵育1〜2小时，使抗体和抗原充分反应，获得所述抗原抗体复合物疫苗。[0043]4无菌检验:取配制好的疫苗，按现行《中国兽药典》附录进行细菌和支原体检验，应符合药典规定。[0044]5分装、保存:在无菌条件下将制作好的疫苗分装于经灭菌（121°C，高压蒸汽灭菌20分钟）的玻璃瓶中，盖上胶塞，加封铝盖，贴上标签，4°C保存。[0045]2.4免疫效果验证[0046]2.4.1抗原抗体结合检验[0047]孵育好的疫苗与生理盐水按1:1vv的比例进行稀释，接种11-12日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，每4h照胚检查一次，连续观察168h。接种后24〜168h观察鸭胚死亡情况，观察期结束后，观察没有死亡的鸭胚胚体有无病变，结果如下表所示：[0048]表1:不同配比下抗原抗体结合效果验证[0049][0050]2.4.2安全性检验[0051]用1〜5日龄白羽肉鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，每只颈部皮下注射灭菌生理盐水2.0ml。在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况，观察是否有疫苗引起的任何局部和全身不良反应，如下表2所示：[0052]表2:抗原抗体复合物安全性检验结果「00531[0054]2.4.3免疫原性检验[0055]用1〜5日龄白羽肉鸭5只每组，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml只，另取5只同日龄鸭不免疫作对照，免疫后7日，对所有鸭采血并分离血清，琼扩法测定3型鸭甲肝抗体效价，采血后每只鸭颈部皮下注射效价不低于106iELD5Q0.2ml的鸭甲肝病毒3型SD15株株病毒0.5ml只，连续观察7天，记录鸭群死亡及精神状态。[0056]表3:免疫鸭琼扩抗体检测结果[0057][0058]表4:供毒保护试验结果[0059][0060]2.4.4结果[0061]从上述试验结果可以看出，抗原抗体复合物的制备过程中，抗原抗体的比例直接影响了疫苗的免疫效果，抗原与抗体应精确匹配，若抗原过多，活病毒效力过高，会对免疫对象造成伤害，若抗体过多，结合形成的抗原抗体复合物浓度较低，复合物中游离的抗体过多，导致免疫作用时间缩短。[0062]实施例2[0063]本实施例提供了一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，步骤包括：[0064]1利用3型鸭甲肝病毒免疫尿囊接种鸭胚，置于37°C下孵育，收集接种后24-96小时内死亡的鸭胚，置于-20°C冷冻处理lh，分别收取尿囊液和胚体;将胚体去掉头和四肢后，进行充分匀浆，离心取上清与尿囊液混合，经0.22微米滤膜进行过滤后，加入0.5%质量比硫酸镁、0.25%质量比氯化钠和0.5%质量比蜂胶，混匀，获得3型鸭甲肝病毒抗原，其他步骤同实施例1。同时，设置对照组A不加硫酸镁、氯化钠和蜂胶，获得对照组A抗原。[0065]2制备卵黄抗体：用步骤（1的抗原经甲醛灭活后免疫产蛋鸭，收集抗体效价为1:64以上的高免鸭蛋，在无菌条件下，取蛋黄与生理盐水按照1:5体积比混合，搅匀过滤后，向滤液中依次加入40%体积比的甲醛溶液、青霉素溶液、链霉素溶液，使其终体积浓度分别为0.1%vv、3000IUmL、3000IUmL，混匀，置于37°C下反应Ih，获得卵黄抗体，其他步骤同实施例1。同时，设置对照组B，用制苗用3型鸭甲肝病毒SD15株免疫产蛋鸭，制备获得对照组B卵黄抗体；[0066]3制备疫苗:将步骤⑴的抗原和步骤2的抗体按照体积比1:50混合，2000rmin，搅拌10分钟，置于37°C孵育2小时，获得疫苗。将疫苗按现行《中国兽药典》附录进行细菌和支原体检验，应符合药典规定。[0067]⑷抗原抗体结合检验和安全性检验[0068]抗原抗体结合检验:将疫苗与生理盐水按I:Ivv的比例进行稀释，接种11-12日龄易感鸭胚，每胚〇.2ml，每4h照胚检查一次，连续观察168h。接种后24〜168h观察鸭胚死亡情况，观察期结束后，观察没有死亡的鸭胚胚体有无病变。[0069]安全性检验：用1〜5日龄白羽肉鸭5只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，每只颈部皮下注射灭菌生理盐水2.0ml。在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况，观察是否有疫苗引起的任何局部和全身不良反应[0070]结果除了用制苗用3型鸭甲肝病毒SD15株免疫的对照组B中出现1例鸭胚胚体病变情况外，其他一切正常，说明本实施例和对照组1、2制备的疫苗安全性能符合要求，但用3型鸭甲肝病毒SD15株免疫获得的高免抗体与直接用制备的抗原进行免疫获得的高免抗体，后者与抗原的结合效果更好，更安全。[0071]5免疫原性检验[0072]用1〜5日龄白羽肉鸭5只每组，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml只，另取5只同日龄鸭不免疫作对照，免疫后7日，对所有鸭采血并分离血清，琼扩法测定3型鸭甲肝抗体效价，采血后每只鸭颈部皮下注射效价不低于106iELD5Q0.2ml的鸭甲肝病毒3型SD15株株病毒0.5ml只，连续观察7天，第7天记录鸭群死亡及精神状态，7天后再次注射，第14天记录鸭群死亡及精神状态，结果如下表所示：[0073]表3:免疫鸭琼扩抗体检测结果[0074][0075]表4:供毒保护试验结果[0076][0077]结果可以看出，本实施例的疫苗与对照组A、B免疫3型鸭甲肝病毒琼扩法抗体效价均不低于1:64,但相比较对照组A、B，本实施例的抗体效价可达到1:256。攻毒试验结果表明，本实施例的疫苗14天的免疫保护率为100%，而对照组A、B在第二次攻毒时均出现肉鸭死亡情况，说明本实施例的疫苗具有更长的免疫保护作用。空白对照组肉鸭全部死亡，保护率为0%。[0078]以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

权利要求：1.一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗，其特征在于，包括体积比为1:50的3型鸭甲肝病毒抗原与鸭卵黄抗体组成的抗原抗体复合物。2.根据权利要求1所述的一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗，其特征在于，所述3型鸭甲肝病毒抗原中含有〇.4-0.5%质量比硫酸镁、0.1-0.25%质量比氯化钠和0.2-0.5%质量比蜂胶，效价范围为IO6·QELD5Q0.2ml-107·QELD5Q0.2ml，所述鸭卵黄抗体为经所述3型鸭甲肝病毒抗原免疫后的高免鸭蛋中提取获得的。3.—种如权利要求1-2所述的鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1制备3型鸭甲肝病毒抗原利用3型鸭甲肝病毒免疫尿囊接种鸭胚，置于37°C下孵育，收集接种后24-96小时内死亡的鸭胚，置于_20°C冷冻处理0.5-lh，分别收取尿囊液和胚体;将胚体去掉头和四肢后，进行充分匀浆，离心取上清与尿囊液混合，经〇.22微米滤膜进行过滤后，加入0.4-0.5%质量比硫酸镁、0.1-0.25%质量比氯化钠和0.2-0.5%质量比蜂胶，混匀，获得3型鸭甲肝病毒抗原；⑵制备卵黄抗体将步骤1制备的抗原灭活后免疫产蛋鸭，收集抗体效价为1:64以上的高免鸭蛋，在无菌条件下，取蛋黄与生理盐水按照1:5体积比混合，搅匀过滤后，向滤液中依次加入40%体积比的甲醛溶液、青霉素溶液、链霉素溶液，使其终体积浓度分别为0.1%vv、2000-3000IUmL、2000-3000IUmL，混匀，置于37°C下反应lh，获得卵黄抗体；⑶制备疫苗将步骤（1的抗原与步骤2的卵黄抗体按照体积比1:50混合，置于37°C孵育l_2h，获得疫苗。4.根据权利要求3所述的一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（1中，3型鸭甲肝病毒为3型鸭甲肝病毒SD15株，生物保藏编号为CGMCCNo.14739。5.根据权利要求3所述的一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤⑴中，将去掉头和四肢的胚体充分匀浆后，经反复冻融3次后再离心。6.根据权利要求3所述的一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤⑵中，抗原灭活的方法为:在抗原中加入终浓度为〇.1%体积比的甲醛，37°C下处理40h以上。7.根据权利要求3所述的一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤⑵中，免疫产蛋鸭的方法为:采用颈部皮下注射方式，Iml只；1周后进行一次强化免疫，颈部皮下注射，1.5ml只；2周后，再进行一次强化免疫，颈部皮下注射，2ml只；之后每隔2月进行一次免疫，颈部皮下注射，Iml只。8.根据权利要求3所述的一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤⑵中，蛋黄与生理盐水溶液混合，依次经50目、100目滤膜负压抽滤后，再与甲醛和抗生素溶液混合。

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