申请/专利权人：青岛大学

申请日：2017-12-07

公开（公告）日：2021-02-12

公开（公告）号：CN107828809B

主分类号：C12N15/60(20060101)

分类号：C12N15/60(20060101);C12N9/88(20060101);C12N1/21(20060101);C12N15/70(20060101);C12P19/02(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.11.18#未缴年费专利权终止;2018.04.17#实质审查的生效;2018.03.23#公开

摘要：本发明公开了一种外切型寡褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用。本发明从海洋细菌Cellulophagasp.SY116中克隆得到新的寡褐藻胶裂解酶基因OalC6，大小2,328bp，编码775个氨基酸，属于多糖裂解酶PL‑6家族。将该基因在大肠杆菌中进行表达和纯化，得到重组OalC6，分子量大小约为85.9kDa。该酶对褐藻酸钠和褐藻寡糖具有活性，对古洛糖醛酸片段（polyG）具有偏好性。本发明的寡褐藻胶裂解酶在生产生物乙醇开发新能源方面具有潜在的应用价值。

主权项：1.一种寡褐藻胶裂解酶OalC6，其特征在于根据与Cellulophagasp.SY116基因组中可能的寡褐藻胶裂解酶基因设计如下扩增引物：上游引物5’-CAAAAACATACATTATAC-3’和下游引物5’-CTAATTAATCCTAAATTTTT-3’,以提取的菌株基因组为模板，进行PCR扩增得到寡褐藻胶裂解酶OalC6基因全长序列,PCR条件为：94℃预变性5min，随后以94℃30s、54.8℃30s、72℃1min30s进行30个循环，最后在72℃延伸10min,经基因测序后，得到寡褐藻胶裂解酶OalC6基因的全核苷酸序列全长2,328bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；编码775个氨基酸，编码的寡褐藻胶裂解酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，蛋白理论分子量为85.9kDa,能用于生产生物乙醇。

全文数据：寡褐藻胶裂解酶OaIC6的制备方法与应用技术领域[0001]本发明属于生物工程领域，涉及一种寡褐藻胶裂解酶0alC6的制备方法及应用。具体地，本发明涉及一种利用重组大肠杆菌制备寡褐藻胶裂解酶Oaice的方法及其应用。背景技术[0002]我国褐藻胶产量位居全球第一。褐藻胶是多种海藻的细胞壁成分，其基本组成单元为单糖，是由互为差向异构体的甘露糖醛酸M和古洛糖醛酸G通过1，4糖苷键连接而成的线性多糖。根据其结构特点，褐藻胶多糖可分为三种片段，由多聚甘露糖醛酸构成的PolyM片段、多聚古洛糖醛酸构成的PolyG片段和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸交替排列而成的PoIyMG片段。[0003]褐藻胶是一种重要的海洋多糖类物质，为多种微生物提供能源物质。绝大多数的海洋细菌通过以下途径进行褐藻胶的利用：首先，细菌分泌至胞外的内切的褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶降解为小分子褐藻胶寡糖;褐藻胶寡糖通过细菌的细胞膜进入细菌体内，在外切的寡褐藻胶裂解酶作用下降解为单糖;单糖经非酶催化作用形成酮酸，然后进入EDEntner-Doudoroff途径或类似ED途径进一步利用，生成乙醇等。[0004]褐藻胶裂解酶根据其一级序列及三维结构的不同，在碳水化合物多糖裂解酶家族中被划分为7个不同的家族：PL-5、6、7、14、15、17和18TanGetal.NucleicAcidsRes，2005，33:el22。目前发现的褐藻胶裂解酶大多数为PL-5和PL-7家族。本发明的寡褐藻胶裂解酶0alC6属于PL-6家族，为本家族中第三个寡褐藻胶裂解酶，且其生物活性最高。目前报道的寡褐藻胶裂解酶的降解方式均为外切。[0005]褐藻胶单糖指饱和的和不饱和的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸，可用于发酵生产生化试剂或生物燃料。随着人口、经济发展的双重压力，地球生态环境遭到极大的破坏，地球能源日渐枯竭。生物能源作为一种重要的替代能源，世界各国空前关注。目前生物能源原料多为陆生农作物，我国人口众多，粮食需求压力长期存在，不可能大量利用粮食生产生物燃料。而利用褐藻胶作为新能源生产生物乙醇已经成为一种全新的尝试。利用褐藻胶为原料生产生物乙醇过程中将褐藻胶转化为单糖是其中必须的一步。Wargacki等将褐藻胶降解相关基因转化入大肠杆菌和酵母菌中，利用大肠杆菌和酿酒酵母以褐藻胶为能源产生生物乙醇WargackiAJetal.Science,2012，335:308-313。我国在此领域还属起步阶段，本发明的寡褐藻胶裂解酶生物活性高，具有良好的应用前景。发明内容[0006]本发明的第一个目的是提供一种新型寡褐藻胶裂解酶0alC6。[0007]本发明的第二个目的是提供包含上述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌及其构建方法。[0008]本发明的另一个目的是提供上述寡褐藻胶裂解酶的应用。[0009]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种寡褐藻胶裂解酶基因〇aiC6,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0010]上述寡褐藻胶裂解酶基因〇aJC6编码的寡褐藻胶裂解酶0alC6,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0011]包含上述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌，该菌株中导入了寡褐藻胶裂解酶〇alC6的编码基因，所述的寡褐藻胶裂解酶基因〇alC6的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0012]上述产寡褐藻胶裂解酶0alC6的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1将寡褐藻胶裂解酶Oaice的编码基因克隆到质粒中，得到重组载体；2将重组载体转化宿主菌，得到产寡褐藻胶裂解酶0alC6的基因工程菌。[0013]步骤⑴中，所述的质粒为pET28a+。[0014]步骤⑵中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21DE3。[0015]上述寡褐藻胶裂解酶0alC6在裂解褐藻酸钠和褐藻胶寡糖中的应用在本发明的保护范围之内。[0016]有益效果：本发明所述的寡褐藻胶裂解酶〇alC6来源于海洋细菌Ceiiuiophagasp.SYl16，通过设计同源引物，获得编码寡褐藻胶裂解酶0alC6的DNA序列，该基因编码区长2,328bp，编码775个氨基酸，理论分子量为85.9kDa，属于多糖裂解酶PL-6家族。大肠杆菌重组表达获得的0alC6,对古洛糖醛酸片段polyG具有偏好性，40°C、pH7.0条件下，在polyG底物中测得的酶活为76.8Umg。本发明的褐藻胶裂解酶在生产生物乙醇开发新能源方面具有潜在的应用价值。[0017]附图说明[0018]图1:寡褐藻胶裂解酶〇alC6的多重氨基酸序列比对图。[0019]图2:重组寡褐藻胶裂解酶0alC6表达纯化的聚丙烯酰氨凝胶电泳图（SDS-PAGE。[0020]图3:温度、pH对于寡褐藻胶裂解酶0alC6的活性及稳定性影响曲线A，不同反应温度对酶活力影响;B，酶的温度稳定性;C，不同反应pH对酶活力影响;D，酶的pH稳定性）。[0021]图4:寡褐藻胶裂解酶降解褐藻胶所得产物的电喷雾质谱ESI-MS分析图A，酶解褐藻胶产物;B，酶解褐藻胶二糖;C，ESI-MS分析酶解产物）。[0022]具体实施方式[0023]下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明，但本发明所保护范围不限于此。[0024]实施例1:寡褐藻胶裂解酶0alC6编码基因的克隆与鉴定根据与SY116基因组中可能的寡褐藻胶裂解酶基因设计如下扩增引物:上游引物5’-CAAAAACATACATTATAC-3’）和下游引物（5’-CTAATTAATCCTAAATTTTT-3’）。以提取的菌株基因组为模板，进行PCR扩增得到寡褐藻胶裂解酶0alC6基因全长序列。PCR条件为:94°C预变性5min，随后以94°C30s、54.8°C30s、72°CImin30s进行30个循环，最后在72°C延伸10min。[0025]经基因测序后，得到寡褐藻胶裂解酶0alC6基因的全核苷酸序列全长2，328bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;编码775个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，蛋白理论分子量为85.9kDa。获得的基因oalC6的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0026]将上述所得PCR产生进行胶回收后，连接至pMD18-T载体上，转化至£.CoiiDH5a感受态细胞中，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，提取质粒后PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆进行序列测定，将序列提交至NCBI。利用软件对0alC6与已经报道的寡藻胶裂解酶序列进行比对，并利用MEGA7.1软件构建进化树。如图1所示，寡和藻胶裂解酶归属于多糖降解酶第6家族。[0027]实施例2:寡褐藻胶裂解酶0alC6重组表达载体的构建根据寡褐藻胶裂解酶基因全序列设计上游引物5’_CAAAAACATACATTATAC-3’）和下游引物5’-CTAATTAATCCTAAATTTTT-3’）。进行PCR扩增得到褐藻胶裂解酶0alC6基因全长序列。PCR条件为:94°C预变性5min，随后以98°C30s、58°C30s、68°C2min进行30个循环，最后在68°C延伸10miruPCR产物和大肠杆菌表达载体pET28a⑴进行酶切，连接后转化至^coiiDHSa感受态细胞，挑取单克隆在含有抗性的LB液体中培养，提取质粒并酶切鉴定阳性克隆。将此重组质粒命名为pET28a-oalC6。将阳性质粒转化进入表达宿主Kcoh_BL21感受态细胞中。[0028]实施例3:寡褐藻胶裂解酶0alC6基因在大肠杆菌中的重组表达与纯化制备将重组表达质粒pET28a-〇alC6转化进入表达宿主£.coiiBL21感受态细胞中。将重组RC〇JiBL21细菌挑取单克隆至相同抗性的LB液体中，37°C振荡培养至㈤600约0.6时加入IPTG进行诱导（终浓度为0.5mM，25°C下进行诱导表达20h。利用Ni亲和层析对目的蛋白进行分离纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测寡褐藻胶裂解酶0alC6的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的0alC6在电泳胶上呈现单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。[0029]实施例4:寡褐藻胶裂解酶0alC6的酶学性质研究1、SDS、EDTA、金属离子对重组酶活性的影响在酶活力检测体系中分别加入终浓度为ImM的金属离子以及去污剂SDS、金属离子螯合剂EDTA，在该体系下检测各组的酶活力，以未添加任何离子的酶活力检测组为空白对照组（100%。结果见表1。实验结果表明，除了Ca2+，其他二价和三价金属离子会明显抑制该酶活性;EDTA、SDS严重抑制该酶的活性;而Na+则会显著促进酶活。[0030]表1不同金属离子及去污剂对酶活力的影响_2、重组酶的最适反应温度及温度对重组酶稳定性的影响将1%褐藻酸钠底物分别置于不同温度下（10°C-70°C孵育10min，然后将适当稀释的寡褐藻胶裂解酶0alC6在该温度下反应10min，利用DNS法检测酶活力，根据酶活力的大小计算酶的反应最适温度。结果显示0alC6在40°C时达到最大活力，表明0alC6的最适反应温度为40°C如图3-A。[0031]适当浓度的寡褐藻胶裂解酶0alC6放置到不同温度下（10°C_70°C孵育Ih，迅速将其冷却至4°C。在酶的最适反应温度40°C下检测酶的活力。以放置之前的酶活力为100%，检测酶在不同温度下的稳定性。结果表明0alC6在低于40°C的温度下具有较好的热稳定性如图3-B。[0032]3、重组酶的最适反应pH及pH对重组酶稳定性的影响将寡褐藻胶裂解酶0alC6溶解于20mMpH7.0的磷酸盐缓冲液稀释后加入到缓冲液体系为50mMNa2HPOf柠檬酸（pH4.6〜7.0，50mM的Na2HPOfNaH2PO4pH6.6〜7.6，50mM的Tris-HClpH7.6〜8.6，50mM的甘氨酸-NaOHpH8.6〜10.6，测定0alC6在不同反应体系，不同pH条件下的酶活力。结果显示0alC6在pH7·8时达到最大活力，表明0alC6的最适反应pH为7.8如图3-C。[0033]将寡褐藻胶裂解酶0alC6放置在以上pH值下4°C保温24h，然后按照酶活力测定方法对上述酶进行酶活力测定，以此来检测0alC6在以上pH值下的稳定性。以放置之前的活力为100%。结果显示在pH5.0〜9.0的范围内，0alC6酶活仍保持60%以上，表明0alC6对pH值耐受范围较广如图3-D。[0034]实施例5:寡褐藻胶裂解酶0alC6的降解产物分析将18Umg的寡褐藻胶裂解酶加入到Iml的0.3%藻酸钠溶解在20mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液中）。将上述体系在40°C下反应过夜，充分降解。将样品至TLC薄层层析TLC板中，展开剂为（正丁醇:冰乙酸：水=2:1:1，130°C烘烤5min显色，显色剂为苯胺二苯胺试剂。分析其降解终产物。结果显示，〇alC6对polyG有很强的偏好性，降解终产物为单糖如图4-A〇[0035]将30Uml寡褐藻胶裂解酶0alC6加入到Iml的0.1%褐藻胶二糖溶解在20mMpH7.0的磷酸盐缓冲液中）。将上述体系在40°C下反应过夜，充分降解。将样品至TLC薄层层析TLC板中，分析其对和藻胶寡糖降解产物。结果显示，0alC6对能够降解褐藻胶二糖为单糖如图4-B。[0036]用18Uml的酶0alC6降解polyG底物（0.5gpolyG，0.2MNaCl溶于20mMpH7.0的磷酸盐缓冲液），通过HPLC方法进行纯化制备，将制备的主产物组分用旋蒸仪蒸干，取少量溶于溶剂（水：乙腈=1:1中离心取上清进行MS阴离子高分辨分析，将剩下的样品（约20mg重新溶解于重水中，离心后取上清打NMR谱（1H，d印tQ，H-Hcosy进行结构鉴定如图4-0。

权利要求：1.一种寡褐藻胶裂解酶基因〇aiC6,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述寡褐藻胶裂解酶基因oa]C6编码的寡褐藻胶裂解酶0alC6,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含权利要求2所述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌，其特征在于，该菌株中导入了寡褐藻胶裂解酶基因〇aJC6,所述的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.权利要求3所述的产寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1将寡褐藻胶裂解酶基因〇aJC6克隆到质粒中，得到重组载体；⑵将重组载体转化宿主菌株，得到产寡褐藻胶裂解酶0alC6的基因工程菌。5.根据权利要求4所述产褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1中，所述的质粒为pET28a+。6.根据权利要求4所述产褐藻胶裂解酶0alC6的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤⑵中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21DE3。7.权利要求2所述寡褐藻胶裂解酶0alC6和或权利要求1所述寡褐藻胶裂解酶基因oaJC6在裂解褐藻酸钠和褐藻寡糖中的应用。

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