申请/专利权人：华南理工大学

申请日：2018-11-23

公开（公告）日：2021-02-12

公开（公告）号：CN109400746B

主分类号：C08B37/00(20060101)

分类号：C08B37/00(20060101);A61P37/02(20060101);A61P7/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.12#授权;2019.03.26#实质审查的生效;2019.03.01#公开

摘要：本发明公开了一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖及其制备方法。该方法如下：取东革阿里根为原料，通过水提醇沉，经DEAE‑Sepharose阴离子交换层析和SephadexG50凝胶渗透层析分离纯化出东革阿里多糖，该多糖的平均分子量为14.3ku，主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成。此外该多糖还具有一定的抗红细胞溶血功效。该多糖在达到2000μgmL时促进RAW264.7细胞分泌NO、IL‑6和TNF‑α的能力与空白对照比分别提高了13.27、7.8和9.0倍；在其浓度为2000μgmL时红细胞溶血率仅有9.15%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。

主权项：1.一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖的制备方法，其特征在于，取东革阿里根为原料，采用水提醇沉经透析、冷冻干燥后，用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和SephadexG50凝胶渗透层析分离纯化出具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖。

全文数据：一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖及其制备方法技术背景本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖及其制备方法。背景技术东革阿里Eurycomalongifolia为苦木科东革阿里属植物，主要分布于东南亚国家，与燕窝、锡器一起并称为马来西亚三大国宝，有“马来西亚人参”之称。作为东南亚地区著名的传统草药，全株均可入药但常以根为主要药用部分，具有催情、改善男性性功能障碍、抗疟疾等功效。由于其特殊的作用，近年来对东革阿里的研究，特别是对东革阿里中活性物质的结构和功能的研究日益增加。据报道，东革阿里根提取物主要用于治疗性功能勃起障碍，疟疾，还能提升人体机能、抗焦虑、抗骨质疏松、镇痛抗炎抗菌、抗寄生虫、及治疗糖尿病等，其还具有丰富的生物活性成分，如生物碱，苦木素二萜类和联二苯类等化合物。目前国内外研究认为，东革阿里的抗癌和催情功能的主要活性物质来源于宽缨酮。然而癌症，生殖健康和人体免疫调节是相互关联的，植物多糖被公认为是具有较强免疫调节活性的天然产物，因此多糖类组分也可能是东革阿里中发挥功效的生物活性成分之一。植物多糖是一类具有特殊生理活性的植物提取物，迄今为止，国内外对东革阿里多糖的系统研究鲜见于报道。从天然植物中提取的多糖由于具有较好的生物活性受到越来越多人的关注，尤其是免疫调节、抗氧化活性，具体的包括抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用，使天然植物多糖在食品和医药中得到广泛应用。本发明在此基础上提出一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖的制备方法。发明内容本发明目的是为了提供一种经济高效的具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖及其制备方法，所得东革阿里多糖具有纯度高、免疫活性高同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态的特点。本发明的目的通过以下技术方案实现。一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖的制备方法，取东革阿里根为原料，采用水提醇沉经透析、冷冻干燥后，用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和SephadexG50凝胶渗透层析分离纯化出具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖。优选的，该方法包括如下步骤：（1）东革阿里粗多糖提取：向过筛后的脱脂东革阿里粉碎物中加入水，在70~90℃下搅拌，离心，收集上清液浓缩后添加无水乙醇，静置，离心；获得的沉淀用sevage试剂收集下层清液，浓缩后透析并冷冻干燥，得到东革阿里粗多糖；（2）分离纯化：将步骤（1）中得到的东革阿里粗多糖用水溶解，然后加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中，用洗脱液进行梯度洗脱，苯酚硫酸法追踪在490nm波长下有吸收峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥，超纯水洗脱条件下得到组分呈现高而尖的吸收峰，因此用该组分继续分离纯化。向用超纯水洗脱得到的组分中加入水，加入装填了SephadexG50填料的层析柱中，用超纯水洗脱，在490nm波长下共有1个吸收峰，收集并冻干后，此组分为东革阿里多糖成品。采用红外吸收光谱检测多糖的典型结构，GPC分子量检测表征分子量范围，单糖组成分析推测所含单糖类型及比例，对其进行活性评价，得到具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多糖。进一步优选的，步骤（1）所述脱脂东革阿里粉碎物与水的质量体积比为1g:10ml~1g:30ml。进一步优选的，步骤（1）所述搅拌的时间为1~3h；所述离心是6000~10000rmin低温离心10~20min。进一步优选的，步骤（1）中，收集上清液浓缩后添加5~10倍体积的无水乙醇。进一步优选的，步骤（1）所述静置是在4~8℃下静置8~12h。进一步优选的，步骤（1）中，获得的沉淀用3~5倍体积sevage试剂收集下层清液，重复3~5次。进一步优选的，步骤（2）中，按5g:1ml~10g:1ml的比例用水溶解东革阿里粗多糖；所述梯度洗脱依次用超纯水、0.05、0.1、0.3和0.5MNaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速1.0~2mLmin，10min管。进一步优选的，步骤（2）中，将用超纯水洗脱得到的组分按5g:1ml~10g:1ml的比例加入水，加入装填了SephadexG50填料的层析柱，加样体积1~2mL，再用超纯水洗脱，洗脱流速0.5~1.0mLmin，5min管。上述方法中，步骤（2）所述该组分进行活性评价：包括免疫活性分析（巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子NO，IL-6，TNF-α的能力）及抗红细胞溶血的能力分析。上述方法中，步骤（2）所述活性评价表现为该多糖在达到2000μgmL时促进RAW264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了13.27、7.8和9.0倍；在其浓度为2000μgmL时红细胞溶血率仅有9.15%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。进一步优选的，上述方法中，除所提到的超纯水为指定水外，其它溶液配制所用的水可以是蒸馏水，也可以是超纯水。由以上所述的方法制备的一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖。经过红外光谱分析鉴定为典型的多糖结构，分子量测定发现该多糖的平均分子量为14.3ku，单糖组成分析结果表明其主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成，其摩尔比为：4.43:1.10:1:1.14。上述多糖同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。本发明以水提醇沉得到东革阿里粗多糖，并用DEAESepharoseFastFlow阴离子柱及SephadexG-50凝胶柱进一步分离纯化，制备工艺简单；纯化过程温和，较好的保持了东革阿里多糖的免疫活性。同时，东革阿里多糖的制备，扩大了东革阿里的应用范围，并提升了其药食两用价值。本发明制备的东革阿里多糖具有具有低分子量和良好的免疫活性，同时具有抗红细胞溶血活性，可以作为天然免疫调节剂，很好的用于食品及药品行业。相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：（1）本发明制备了东革阿里多糖，极大的丰富了东革阿里有效成分的研究范围，强化了其应用价值。（2）本发明提供了一种简便可行的东革阿里多糖的制备方法。（3）本发明制备的东革阿里多糖具有低分子量和良好的免疫活性，同时具有抗红细胞溶血活性。（4）本发明制备洗脱过程未涉及任何有机溶剂，操作条件温和，最大程度的保留了东革阿里多糖的相关活性，保证了产品的安全性。（5）本发明的制备过程操作简便，成本低，适合工业化生产。附图说明图1是本发明提供的工艺流程图。图2a是东革阿里多糖对刺激RAW264.7细胞分泌NO的影响图。图2b是东革阿里多糖对刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响图。图2c是东革阿里多糖对刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响图。图3是东革阿里多糖对AAPH诱导的红细胞溶血作用图。具体实施方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明工艺方法流程图见图1。实施例1一种具有免疫调节活性和抗红细胞溶血活性的多糖，包括如下步骤：（1）东革阿里多糖粗品制备：东革阿里树根洗净晒干，粉碎后过40目筛，得到东革阿里粉碎物，置于干燥处备用；将上述粉碎物用75%的乙醇冷凝回流，回流温度为70℃，回流时间为2h，除杂并基本除去色素，抽滤弃去上清液，滤渣自然晾干备用；滤渣以1：10（gml）的比例加入水，在70℃下搅拌1h，6000rmin，4℃下离心10min后，收集上清液浓缩后添加5倍体积的无水乙醇，在4℃下静置8h，6000rmin，4℃下离心10min；获得的沉淀用3倍体积sevage试剂收集下层清液，重复3次，浓缩后透析脱盐并冷冻干燥，得到东革阿里粗多糖，此条件下多糖的得率为4.3%；（2）东革阿里多糖的分离纯化及结构鉴定：将步骤（1）中东革阿里多糖粗品水溶解，配制5mgmL的溶液，并用0.22μm的滤膜过滤。取5mL滤液通过DEAESepharoseFastFlow阴离子柱，分别用超纯水、0.1、0.2、0.3、及0.5molL的NaCl溶液以1.0mLmin速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（10min管）。得到1个组分，将收集组分通过100u透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解。将上述组分用水配成浓度5mgmL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，取1mL加入到SephadexG-50凝胶柱中进行层析分离。流速0.5mLmin，5min管收集样品，490nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线。将过凝胶柱后的洗脱液收集并冻干后，用于GPC分子量检测、红外光谱及单糖组成分析，经过红外光谱分析鉴定为典型的多糖结构，分子量测定发现该多糖的平均分子量为14.3ku，单糖组成分析结果表明主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成，其摩尔比为：4.43:1.10:1:1.14；（3）东革阿里多糖活性评价：对本发明实施例制备纯化的东革阿里多糖进行免疫活性测定：将该多糖用DMEM培养基溶解后配成2mgmL的母液，并等梯度稀释成2000μgmL、1000μgmL、500μgmL、250μgmL和125μgmL五个剂量组；再解冻小鼠巨噬细胞RAW264.7，迅速将解冻细胞转移到15mL的无菌离心管，加入12mLDMEM培养基，混匀后低速离心（1000rpmmin，5min）。除去培养基，加入新鲜的培养基，将细胞悬浮后转移至细胞培养瓶中。置于CO2培养箱中培养（37℃，5vol%CO2），每隔两天换一次培养基，加入100µL不同浓度的东革阿里多糖溶液，阳性对照组加入100µL含脂多糖（50μgmL）的培养基，调零组和阴性对照组分别加入100µLDMEM培养基，每组设3个平行孔。将细胞放回CO2培养箱中培养24h，用一氧化氮检测试剂盒和Elisa试剂盒测定细胞上清液中各细胞因子（NO、TNF-α和IL-6）的表达量，结果如图2a-c所示，图中**代表不同浓度东革阿里多糖及脂多糖（LPS）与对照组具有极显著差异，p0.01。同时利用对0.2mL红细胞悬液、0.2mL不同浓度样品溶液（0.5、1、2.5、5、10、20mgmL，PBS稀释）、0.4mLAAPH溶液的体系进行该多糖抗红细胞溶血活性评价，结果如图3所示。该多糖在达到2000μgmL时促进RAW264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了13.27、7.8和9.0倍；在其浓度为2000μgmL时红细胞溶血率仅有9.15%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。综上，本发明实施例制备的东革阿里多糖具有较好的免疫调节活性，是一种具有较高应用价值的生物活性物质。实施例2一种具有免疫调节活性和抗红细胞溶血活性的多糖，包括如下步骤：（1）东革阿里多糖粗品制备：东革阿里树根洗净晒干，粉碎后过60目筛，得到东革阿里粉碎物，置于干燥处备用；将上述粉碎物用75%的乙醇冷凝回流，回流温度为70℃，回流时间为2h，除杂并基本除去色素，抽滤弃去上清液，滤渣自然晾干备用；滤渣以1：20（gml）的比例加入水，在80℃下搅拌2h，8000rmin，4℃下离心15min后，收集上清液浓缩后添加8倍体积的无水乙醇，在6℃下静置10h，8000rmin，4℃下离心15min；获得的沉淀用4倍体积sevage试剂收集下层清液，重复4次，浓缩后透析脱盐并冷冻干燥，得到东革阿里粗多糖，此条件下多糖的得率为6.8%；（2）东革阿里多糖的分离纯化及结构鉴定：将（1）中东革阿里多糖粗品水溶解，配制8mgmL的溶液，并用0.22μm的滤膜过滤。取8mL滤液通过DEAESepharoseFastFlow阴离子柱，分别用超纯水、0.1、0.2、0.3、及0.5molL的NaCl溶液以1.5mLmin速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（10min管）。得到1个组分，将收集组分通过100u透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解。将上述组分用水配成浓度8mgmL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，取2mL加入到SephadexG-50凝胶柱中进行层析分离。流速0.8mLmin，5min管收集样品，490nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线。将过凝胶柱后的洗脱液收集并冻干后，用于GPC分子量检测、红外光谱及单糖组成分析，经过红外光谱分析鉴定为典型的多糖结构，分子量测定发现该多糖的平均分子量为14.3ku，单糖组成分析结果表明主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成，其摩尔比为：4.43:1.10:1:1.14。（3）东革阿里多糖活性评价：对本发明实施例制备纯化的东革阿里多糖进行免疫活性测定：将该多糖用DMEM培养基溶解后配成2mgmL的母液，并等梯度稀释成2000μgmL、1000μgmL、500μgmL、250μgmL和125μgmL五个剂量组；再解冻小鼠巨噬细胞RAW264.7，迅速将解冻细胞转移到15mL的无菌离心管，加入12mLDMEM培养基，混匀后低速离心（1000rpmmin，5min）。除去培养基，加入新鲜的培养基，将细胞悬浮后转移至细胞培养瓶中。置于CO2培养箱中培养（37℃，5%CO2），每隔两天换一次培养基，加入100µL不同浓度的东革阿里多糖溶液，阳性对照组加入100µL含脂多糖（50μgmL）的培养基，调零组和阴性对照组分别加入100µLDMEM培养基，每组设3个平行孔。将细胞放回CO2培养箱中培养24h，用一氧化氮检测试剂盒和Elisa试剂盒测定细胞上清液中各细胞因子（NO、TNF-α和IL-6）的表达量，结果如图2A-C所示；同时利用对0.2mL红细胞悬液、0.2mL不同浓度样品溶液（0.5、1、2.5、5、10、20mgmL，PBS稀释）、0.4mLAAPH溶液的体系进行该多糖抗红细胞溶血活性评价，结果如图3所示，注：采用Duncan'smultiplerangetest进行分析。同一组数据中，小写字母完全不同时，表示存在显著性差异（p0.05）。该多糖在达到2000μgmL时促进RAW264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了13.27、7.8和9.0倍；在其浓度为2000μgmL时红细胞溶血率仅有9.15%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。实施例3一种具有免疫调节活性和抗红细胞溶血活性的多糖，包括如下步骤：（1）东革阿里多糖粗品制备：东革阿里树根洗净晒干，粉碎后过80目筛，得到东革阿里粉碎物，置于干燥处备用；将上述粉碎物用75%的乙醇冷凝回流，回流温度为70℃，回流时间为2h，除杂并基本除去色素，抽滤弃去上清液，滤渣自然晾干备用；滤渣以1：30（gml）的比例加入水，在90℃下搅拌3h，10000rmin低温离心20min后，收集上清液浓缩后添加10倍体积的无水乙醇，在8℃下静置12h，10000rmin，4℃下离心20min；获得的沉淀用5倍体积sevage试剂收集下层清液，重复5次，浓缩后透析脱盐并冷冻干燥，得到东革阿里粗多糖，此条件下多糖的得率为6.1%；（2）东革阿里多糖的分离纯化及结构鉴定：将步骤（1）中东革阿里多糖粗品水溶解，配制10mgmL的溶液，并用0.22μm的滤膜过滤。取10mL滤液通过DEAESepharoseFastFlow阴离子柱，分别用超纯水、0.1、0.2、0.3、及0.5molL的NaCl溶液以2.0mLmin速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（10min管）。得到1个组分，将收集组分通过100u透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解。将上述组分用水配成浓度5mgmL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，取2mL加入到SephadexG-50凝胶柱中进行层析分离。流速1.0mLmin，5min管收集样品，490nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线。将过凝胶柱后的洗脱液收集并冻干后，用于GPC分子量检测、红外光谱及单糖组成分析，经过红外光谱分析鉴定为典型的多糖结构，分子量测定发现该多糖的平均分子量为14.3ku，单糖组成分析结果表明主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成，其摩尔比为：4.43:1.10:1:1.14。（3）东革阿里多糖活性评价：对本发明实施例制备纯化的东革阿里多糖进行免疫活性测定：将该多糖用DMEM培养基溶解后配成2mgmL的母液，并等梯度稀释成2000μgmL、1000μgmL、500μgmL、250μgmL和125μgmL五个剂量组；再解冻小鼠巨噬细胞RAW264.7，迅速将解冻细胞转移到15mL的无菌离心管，加入12mLDMEM培养基，混匀后低速离心（1000rpmmin，5min）。除去培养基，加入新鲜的培养基，将细胞悬浮后转移至细胞培养瓶中。置于CO2培养箱中培养（37℃，5%CO2），每隔两天换一次培养基，加入100µL不同浓度的东革阿里多糖溶液，阳性对照组加入100µL含脂多糖（50μgmL）的培养基，调零组和阴性对照组分别加入100µLDMEM培养基，每组设3个平行孔。将细胞放回CO2培养箱中培养24h，用一氧化氮检测试剂盒和Elisa试剂盒测定细胞上清液中各细胞因子（NO、TNF-α和IL-6）的表达量，结果如图2A-C所示；同时利用对0.2mL红细胞悬液、0.2mL不同浓度样品溶液（0.5、1、2.5、5、10、20mgmL，PBS稀释）、0.4mLAAPH溶液的体系进行该多糖抗红细胞溶血活性评价，结果如图3所示。该多糖在达到2000μgmL时促进RAW264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了13.27、7.8和9.0倍；在其浓度为2000μgmL时红细胞溶血率仅有9.15%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。

权利要求：1.一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖的制备方法，其特征在于，取东革阿里根为原料，采用水提醇沉经透析、冷冻干燥后，用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和SephadexG50凝胶渗透层析分离纯化出具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）东革阿里粗多糖提取：向过筛后的脱脂东革阿里粉碎物中加入水，在70~90℃下搅拌，离心，收集上清液浓缩后添加无水乙醇，静置，离心；获得的沉淀用sevage试剂收集下层清液，浓缩后透析并冷冻干燥，得到东革阿里粗多糖；（2）分离纯化：将步骤（1）中得到的东革阿里粗多糖用水溶解，然后加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中，用洗脱液进行梯度洗脱，苯酚硫酸法追踪在490nm波长下有吸收峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥，向用超纯水洗脱得到的组分中加入水，加入装填了SephadexG50填料的层析柱中，用超纯水洗脱，在490nm波长下共有1个吸收峰，收集并冻干后，此组分为东革阿里多糖成品。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述脱脂东革阿里粉碎物与水的质量体积比为1g:10ml~1g:30ml。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述搅拌的时间为1~3h；所述离心是6000~10000rmin低温离心10~20min。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，收集上清液浓缩后添加5~10倍体积的无水乙醇。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述静置是在4~8℃下静置8~12h。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，获得的沉淀用3~5倍体积sevage试剂收集下层清液，重复3~5次。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，按5g:1ml~10g:1ml的比例用水溶解东革阿里粗多糖；所述梯度洗脱依次用超纯水、0.05、0.1、0.3和0.5MNaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速1.0~2mLmin，10min管。9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，将用超纯水洗脱得到的组分按5g:1ml~10g:1ml的比例加入水，加入装填了SephadexG50填料的层析柱，加样体积1~2mL，再用超纯水洗脱，洗脱流速0.5~1.0mLmin，5min管。10.由权利要求1-9任一项所述的方法制备的一种具有免疫调节和抗红细胞溶血活性东革阿里多糖。

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