申请/专利权人：陕西师范大学

申请日：2017-03-24

公开（公告）日：2021-02-19

公开（公告）号：CN107245493B

主分类号：C12N15/63(20060101)

分类号：C12N15/63(20060101);C12N15/113(20100101);C12N9/22(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.19#授权;2017.11.10#实质审查的生效;2017.10.13#公开

摘要：本发明公开了一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，在表达的sgRNA‑AZ2.0骨架的四碱基环tetraloop以及茎环2stemloop2位置插入适体核酶P1‑F5；通过KpnⅠ与EcoRⅠ位点和EcoRⅠ与SpeⅠ位点分别将U6启动子、sgRNA‑AZ2.0骨架依次连入载体pUC19EKSHL中，获得载体pU6‑sgRNA‑AZ2.0；使用BsaⅠ酶切载体pU6‑sgRNA‑AZ2.0，并利用粘性末端设计并连入针对目标基因的sgRNA序列，获得pU6‑sgRNA‑AZ2.0‑targetsite。能有效介导Cas9蛋白的基因组编辑作用，并使其编辑活性受到茶碱调控；且能介导dCas9‑KRAB蛋白对目的基因的转录抑制，并使其抑制活性受到茶碱调控。

主权项：1.一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，在表达的sgRNA-AZ2.0骨架的四碱基环tetraloop以及茎环2stemloop2位置插入适体核酶P1-F5；通过KpnⅠ与EcoRⅠ位点和EcoRⅠ与SpeⅠ位点分别将U6启动子、sgRNA-AZ2.0骨架依次连入载体pUC19EKSHL中，获得载体pU6-sgRNA-AZ2.0；使用BsaⅠ酶切载体pU6-sgRNA-AZ2.0，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列，获得pU6-sgRNA-AZ2.0-targetsite。

全文数据：一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种载体，具体涉及一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型SgRNA的载体及其应用。背景技术[0002]适体核酶Aptazyme适体核酶型核糖开关是近年出现的一种人工基因调控开关。最常见的适体核酶由锤头状核酶和适体组成，结构清晰，易于设计。作为一种顺式作用元件，适体核酶型核糖开关在特异性配体的作用下，无需蛋白分子辅助，即可通过调节自身剪切反应，调控mRNA的翻译，可应用于多种细胞的基因调控。一个已经报道的适体核酶Pl-F5AusUindenetal·，2010;Ketzer，etal·，2014在与茶碱结合后可以发生自身剪切，从而造成mRNA的切割和降解，从而起到调控基因表达的作用。[0003]ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPRCRISPR-aSS〇CiatedCaS9系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶zincfingerendonuclease，ZFN和类转录激活因子效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。Cas9核酸酶可以在sgRNA指导下结合任何含有PAM序列的DNA，sgRNA中20个核酸序列通过碱基互补配对革巴向特定DNA，稳定Cas9与目的DNA的结合。可以通过改变sgRNA序列，使之结合到任意位点，sgRNA与目标DNA互补配对确保Cas9作用位点特异性。但是，后续研究发现根据碱基错配数目、位置以及碱基特性差异，Cas9容许gRNA20nt序列与靶DNA之间存在不同数目的错配。引起的脱靶问题，限制Cas9编辑技术在临床中的应用。已有的研究指出通过控制CRISPR-Cas9系统的作用时间，既在达到切割编辑目的后关闭CRISPR-Cas9系统，可以避免过度切割的脱靶效应。[0004]经过改造的CRISPRCas9也可以用于对靶基因的表达进行激活或者抑制，将Cas9蛋白进行突变后得到的没有切割活性的突变体dCas9具有在sgRNA序列引导下结合目标基因的但不切割的特性，研究人员将dCas9与转录激活结构域VP64融合后构建的dCas9-VP64分子成为可以革G向特定基因的转录激活因子。同理将转录抑制结构域KRAB融合在dCas9的3’末端，获得的dCas9-KRAB分子则成为了可以靶向特定基因的转录抑制因子。但在基因治疗和功能研究中，对特定基因的表达调控往往需要更精准的时间控制。所以对于dCas9-VP64或dCas9-KRAB介导的基因表达也需要有效的控制手段。[0005]对CRISPRCas9系统介导的基因组编辑以及dCas9_VP64或dCas9_KRAB介导的基因表达激活和抑制的主要调控段是通过对Cas9类蛋白的转录，转录后，翻译后等水平进行调节。如Davis等人对Cas9蛋白进行了改造，使其在药物4-羟基他莫昔芬（4-Hydroxytamoxifen存在时发生翻译后的蛋白编辑，产生活性的Cas9蛋白，从而启动CRISPRCas9系统进行基因编辑。也有研究者使用四环素调控系统调控Cas9蛋白或者sgRNA表达来调控CRISPRCas9活性，但这样的调控系统会需要引入额外的顺式调控元件和反式调节因子。[0006]通过不引入额外的顺式调控元件和反式调节因子的途径调控sgRNA进而控制CRISPRCas9活性的方法为一新的策略。申请人研究发现，通过构建一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，在进行基因编辑和转录调控时，通过在培养基中加入适体核酶Pl-F5的配体茶碱，引起该适体核酶自我剪切从而造成SgRNA的断裂，使SgRNA引导的CRISPRCas9系统失活。这样的调控方法避免了额外的顺式调控元件和反式调节因子的引入，该载体质粒上所占体积小，同时具有受配体药物调控的特征。发明内容[0007]本发明的目的在于，提供一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体。[0008]为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：[0009]一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，在表达的SgRNA-AZ2.0骨架的四碱基环（tetraloop以及莖环2stemloop2位置插入适体核酶P1-F5;通过KpnI与EcoRI位点和EcoRI与SpeI位点，分别将U6启动子、SgRNA-AZ2.0骨架依次连入载体PUC19EKSHL中，获得载体pU6-sgRNA-AZ2·0;使用BsaI酶切载体pU6-sgRNA-AZ2·0，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列，获得pU6-sgRNA-AZ2·0-targetsite〇[0010]根据本发明，所述插入的适体核酶是P1-F5的序列为：[0011][0018]根据本发明，所述粘性末端连入针对目标基因编辑靶点的长度为19或20个核苷酸，退火构成其sgRNA片段的引物序列如下：[0022]所述的针对目标基因的sgRNA序列是针对目标基因编辑靶点，它们是针对GLRX3基因，VEGFA基因或者PGRN基因启动子中的任意一种。但并不只限于这三种。[0023]根据申请人的研究表明，采用本发明构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6_sgRNA_AZ2.0-targetsite与载体hCas9共转染HEK293细胞，进行了对目标基因的编辑实验，实验结果表明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6-sgRNA-AZ2.0-targetsite与hCas9载体共转染细胞后，对目的基因可以进行有效编辑，并且其编辑活性受到茶碱的有效调控;采用本发明构建方法构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6_sgRNA_AZ2.0-targetsite与载体pHAGEEFladCas9_KRAB以及载体PGL3-PGRNPro-Luc共转HEK293细胞进行基因转录抑制的调控实验，实验结果表明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6_sgRNA_AZ2·〇-targetsite与载体pHAGEEFladCas9-KRAB以及载体pGL3-PGRNPro-Luc共转染细胞后，可以对人PGRN启动子启动的荧光素酶的表达起到抑制作用，并且其抑制活性受到茶碱的有效调控。[0024]本发明所构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，能有效介导Cas9蛋白的基因组编辑作用，并使其编辑活性受到茶碱调控;且能介导dCas9-KRAB蛋白对目的基因的转录抑制，其抑制活性受到茶碱调控。附图说明[0025]图1是SgRNA-AZ2.0骨架的结构图。[0026]图2是pU6-sgRNA-AZ2.0载体结构图。[0027]图3是pU6_sgRNA_AZ2.0-targetsite载体结构图。[0028]图4是实施例1构建的pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3载体介导的目标基因编辑效率检测图。[0029]图5是实施例2构建的pU6-SgRNA-AZ2.0-VEGFA载体介导的目标基因编辑效率检测图。[0030]图6是PGL3-PGRNPro-Luc载体结构图。[0031]图7是实施例3构建的pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro载体介导的目标基因转录抑制活性检测图。[0032]下面结合附图和实施例来对本发明做进一步详细说明。具体实施方式[0033]本发明的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，在表达的sgRNA-AZ2.0骨架的四碱基环^61:瓜1〇^以及莖环28七61111〇^2位置插入适体核酶？1-?5;通过KpnI与EcoRI位点和EcoRI与SpeI位点分别将U6启动子、sgRNA-AZ2.0骨架依次连入载体PUC19EKSHL中，获得载体pU6-sgRNA-AZ2·0;使用BsaI酶切载体pU6-sgRNA-AZ2·0，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列，获得载体pU6-sgRNA-AZ2.0-targetsite图3〇[0034]构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，具体步骤为：[0035]1合成在四碱基环tetraloop以及莖环2stemloop2位置插入适体核酶Pl-F5的sgRNA-AZ2.0骨架；[0036]根据已知序列和发明人设计，合成5’末端带有EcoRI位点，3’末端带有SpeI位点的sgRNA-AZ2.0的骨架，这个骨架中适体核酶Pl-F5分别插入在原始骨架四碱基环0^1:瓜1〇〇口）以及莖环28七61111〇〇口2的位置。[0037]⑵合成U6启动子[0038]根据已知序列合成5’末端带有KpnI，3’末端带有EcoRI位点的U6启动子；[0039]3构建pU6-sgRNA-AZ2·0载体[0040]将U6启动子片段经过KpnI与EcoRI酶切，sgRNA-AZ2.0的片段经过EcoRI与SpeI酶切，使用1%的琼脂糖凝胶电泳后回收两片段，载体PUC19EKSHLXiao，etal.，2016通过KpnI与SpeI酶切后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体;使用T4连接酶将片段U6启动子，sgRNA-AZ2.0与载体pUC19EKSHL连接，产物转化入大肠杆菌DH5a，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA-AZ2.0。[0041]⑷构建靶向人GLRX3基因的pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3载体[0042]设计的靶向人GLRX3基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下下划线表示粘性末端序列）：[0043]正向引物序列为:ACCGTGAGGATAGGTAGGCCAAC；[0044]反向引物序列为:AAACGTTGGCCTACCTATCCTCA。[0045]两条引物用超纯水稀释成浓度为20μΜ的溶液，各取20yL混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人GLRX3基因的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA-AZ2.0经BsaI酶切后，经质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人GLRX3基因的sgRNA片段与经BsaI酶切的载体pU6-sgRNA-AZ2.0连接，产物转化入大肠杆菌DH5a，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3。[0046]5构建靶向人VEGFA基因的pU6-sgRNA-AZ2·0-VEGFA载体[0047]靶向人VEGFA基因的sgRNA片段由引物退火形成Fu，etal.，2013，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下下划线表示粘性末端序列）：[0048]正向引物序列为:ACCGGGTGAGTGAGTGTGTGCGTG；[0049]反向引物序列为:AAACCACGCACACACTCACTCACC。[0050]两条引物用超纯水稀释成浓度为20μΜ的溶液，各取20yL混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人VEGFA基因的SgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA-AZ2.0经BsaI酶切后，经质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人VEGFA基因的SgRNA片段与经BsaI酶切的载体pU6-sgRNA-AZ2.0连接，产物转化入大肠杆菌DH5a，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA-AZ2.0-VEGFA。[0051]⑶构建靶向人PGRN基因启动子的pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro载体[0052]靶向人PGRN基因启动子的sgRNA片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下下划线表示粘性末端序列）：[0053]正向引物序列为:ACCGCGTCGGGACAGCCTCAGCA；[0054]反向引物序列为:AAACTGCTGAGGCTGTCCCGACG〇[0055]两条引物用超纯水稀释成浓度为20μΜ的溶液，各取20yL混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人PGRN基因启动子的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA-AZ2.0经BsaI酶切后，经质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人PGRN基因启动子的sgRNA片段与经BsaI酶切的载体pU6-sgRNA-AZ2.0连接，产物转化入大肠杆菌DH5a，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro。[0056]以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，以下的实施例是较佳的例子，本发明并不限于这些实施例[0057]实施例1:[0058]本实施例构建的表达靶向人GLRX3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体如下：[0059]表达的sgRNA-AZ2.0骨架骨架结构图如图1所示）中，在四碱基环tetraloop以及茎环2stemloop2位置插入适体核酶P1-F5,其中适体核酶P1-F5序列如下：[0060][0067]在两个BsaI中插入的靶向人GLRX3基因的sgRNA序列如下：[0068]TGAGGATAGGTAGGCCAAC〇[0069]上述的表达靶向人GLRX3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体构建方法步骤如下：[0070]1、合成在四碱基环（tetraloop以及莖环2stemloop2位置插入适体核酶Pl-F5的SgRNA-AZ2.0骨架；[0071]根据已知序列和发明人设计，由江苏金唯智公司合成5’末端带有EcoRI位点，3’末端带有SpeI位点的SgRNA-AZ2.0的骨架，在SgRNA-AZ2.0骨架中，适体核酶P1-F5分别插入在原始骨架四碱基环0^1:瓜1〇^及莖环28七61111〇^2的位置。[0072]2、合成U6启动子[0073]由江苏金唯智公司合成5’末端带有KpnI，3’末端带有EcoRI位点的U6启动子。[0074]3、构建pU6-sgRNA_AZ2·0载体[0075]将U6启动子片段经过KpnI与EcoRI酶切，SgRNA-AZ2.0的片段经过EcoRI与SpeI酶切，使用1%的琼脂糖凝胶电泳后回收两片段，载体PUC19EKSHLXiao，etal.，2016通过KpnI与SpeI酶切后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体;使用T4连接酶将片段U6启动子，SgRNA-AZ2.0与载体pUC19EKSHL连接，连接条件为:pUC19EKSHL载体0.5yL，片U6启动子段2yL，sgRNA-AZ2.0片段2yL，2XT4DNA快速连接酶缓冲液5yL，T4DNA快速连接酶0.5yL，25°C反应1个小时后转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有l〇〇ygml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有lOOygml的氨苄青霉素的LB培养液中，14〜16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pU6-sgRNA-AZ2.0载体，该pU6-sgRNA-AZ2.0载体结构图如图2所示。[0076]4、构建靶向人GLRX3基因的pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3载体[0077]设计的靶向人GLRX3基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下下划线表示粘性末端序列）：[0078]pi:ACCGTGAGGATAGGTAGGCCAAC；[0079]P2：AAACGTTGGCCTACCTATCCTCA。[0080]两条引物用超纯水稀释成浓度为20μΜ的溶液，各取20yL混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人GLRX3基因的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA-AZ2.O经BsaI酶切后，经质量浓度为I%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人61^«3基因的881?熟片段与经881酶切的载体?1]6-881?财-422.0连接，连接条件为：？1]6-sgRNA-AZ2.0载体0.5yL，靶向人GLRX3基因的SgRNA片段2yL，2XT4DNA快速连接酶缓冲液5yL，T4DNA快速连接酶0.5yL，去离子水2yL，25°C反应1个小时后转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有lOOygml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100ygml的氨苄青霉素的LB培养液中，14小时〜16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3。[0081]实施例2:[0082]本实施例构建的表达靶向人VEGFA基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体如下：[0083]实施例1中靶向人GLRX3基因的sgRNA序列由靶向人VEGFA基因的sgRNA序列替换。在两个BsaI中插入的靶向人VEGFA基因的SgRNA序列如下：[0084]GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG。[0085]载体的其它结构与实施例1相同。[0086]其构建方法步骤4中，构建靶向人VEGFA基因的pU6-sgRNA-AZ2.0-VEGFA载体的方法是：[0087]靶向人VEGFA基因的SgRNA片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下下划线表示粘性末端序列）：[0088]P3：ACCGGGTGAGTGAGTGTGTGCGTG；[0089]P4：AAACCACGCACACACTCACTCACC〇[0090]其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人VEGFA基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6-sgRNA-AZ2·0-VEGFA。[0091]实施例3:[0092]本实施例构建的表达靶向人PGRN基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体如下：[0093]实施例1中靶向人GLRX3基因的sgRNA序列由靶向人PGRN基因启动子的sgRNA序列替换。在两个BsaI中插入的靶向人PGRN基因启动子的sgRNA序列如下：[0094]CGTCGGGACAGCCTCAGCA。[0095]载体其它结构与实施例1相同。[0096]其构建方法步骤4中，构建靶向人PGRN基因启动子的pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro载体的方法是：[0097]靶向人PGRN基因启动子的sgRNA片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下下划线表示粘性末端序列）：[0098]P5：ACCGCGTCGGGACAGCCTCAGCA；[0099]P6：AAACTGCTGAGGCTGTCCCGACG〇[0100]其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人PGRN基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro。[0101]为了验证构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体的有益效果，发明人采用实施例1构建的表达靶向人GLRX3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3，实施例2构建的表达靶向人VEGFA基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型SgRNA的载体pU6-sgRNA-AZ2.0-VEGFA，实施例3构建的表达靶向人PGRN基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro进行了实验，实验情况如下：[0102]1、表达靶向人GLRX3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型SgRNA的载体对目标基因的编辑效率和药物调控效果[0103]发明人将实施例1中构建的载体pU6-sgRNA-AZ2.0经过EcoRI与SpeI双酶切，使用1%的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，然后插连入由苏州金唯智公司合成的5’端带有EcoRI位点，3’端带有SpeI位点的不带有适体核酶修饰的sgRNA骨架片段，该片段序列如下：[0104]GAATTCGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGT。[0105]所获得的载体命名为pU6-sgRNA，该载体为表达不带有适体核酶修饰的sgRNA的载体，其表达的sgRNA不会受到茶碱药物的调控，在本实验中作为对照。载体pU6-sgRNA中也插入了靶向人GLRX3基因的sgRNA序列，其方法与实施例1中构建方法步骤4相同，获得的载体命名为pU6-sgRNA-GLRX3。接种HEK293细胞于24孔板，每孔IXIO5个细胞，共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9Addgene，#41815与pU6-sgRNA-AZ2·0-GLRX3进入细胞；而同时，共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9与pU6-sgRNA-GLRX3进入细胞，作为阳性对照。细胞培养基中加入或不加入终浓度为3mM的茶碱。48小时后提取细胞基因组DNA。使用巢式PCR扩增基因组中包含编辑位点的区域。[0106]外巢反应：[0107]引物：[0108]P7:ACTCAAACTGGAGGCTGGAG；[0109]P8:GCTGCACCCAGTAAAACACGA。[0110]反应体系：[0111][0112]聚合酶链式反应的条件是:94°C，30秒，98°C，10秒70°C，30秒每个循环下降rc72°C，30秒，10个循环，98°C，10秒，60°C，30秒，72°C，30秒，25个循环。[0113]内巢巢反应：[0114]引物：[0115]P9:AGGTACCCCCCAGTCTCTGGGATTACA；[0116]P10:AAGATCTAAAAGCAAAGCAGATCCTCCA〇[0117]反应体系：[0118][0119]聚合酶链式反应的条件是:94°C，30秒，98°C，10秒，60°C，30秒，72°C，30秒，30个循环。[0120]所获得的PCR产物经过PCR仪器变性退火的程序是：[0121]95°C，5分钟；95°C-85°C，每秒降低2°C_2°Cs;85°C-25°C，每秒降低Ο.ΙΓ-0.1°Cs〇[0122]产物经过质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳后回收后，测量含量，然后使用经典的T7EndonUCleaSeI内切酶检测法检测各组中目标基因的编辑效率。具体方法如下：每组取PCR产物DNA500ng，0.5yL的T7EndonucleaseINEB，M0302S内切酶，2yL的lOXBuffer，补水至总体积20yL。37°C，反应20分钟。结束后进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。T7EndonucleaseI内切酶能够将PCR产物中不配对的部分切断，如果PCR产物被切开成两条小的条带，则说明其在目标位置发生了基因组编辑，产生了碱基突变，而两条小的条带的亮度越亮，则说明基因组编辑的效率越高。结果见图4所示，在不是加入药物茶碱时，pU6-sgRNA-AZ2.0-GLRX3与pU6-sgRNA-GLRX3均能介导Cas9进行基因组编辑，但加入茶碱后，载体pU6-sgRNA-AZ2·0-GLRX3介导Cas9进行基因组编辑的效应被明显的削弱，而pU6-sgRNA-GLRX3介导Cas9进行基因组编辑的效应则无明显变化。此结果说明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体介导Cas9对人GLRX3位点基因组编辑的效应可有有效的被茶碱控制。[0123]2、表达靶向人VEGFA基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体对目标基因的编辑效率和药物调控效果[0124]发明人在载体pU6-sgRNA中也插入了靶向人VEGFA基因的sgRNA序列，其方法与实施例1中构建方法步骤4相同，获得的载体命名为pU6-sgRNA-VEGFA。接种HEK293细胞于24孔板，每孔IXIO5个细胞，共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9与pU6-sgRNA-AZ2.0-VEGFA入细胞;而同时，共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9与pU6-sgRNA-VEGFA进入细胞，作为阳性对照。细胞培养基中加入或不加入终浓度为3mM的茶碱。48小时后收取细胞提取细胞基因组DNA。使用降落PCR扩增基因组中包含编辑位点的部分。[0125]引物：[0126]Pl1：TCCAGATGGCACATTGTCAG；[0127]P12:AGGGAGCAGGAAAGTGAGGT〇[0128]反应体系：[0129][0130]聚合酶链式反应的条件是:94°C30秒，98°C10秒70°C30秒每个循环下降1°C72°C30秒10个循环，98°C10秒60°C30秒72°C30秒，25个循环。[0131]所获得的PCR产物经过PCR仪器变性退火，T7E1内切酶检测法检测各组中目标基因的编辑效率。其具体方法与实验1中相同。结果见图5所示，图中显示，在不是加入药物茶碱时，pU6-sgRNA-AZ2.0-VEGFA与pU6-sgRNA-VEGFA均能介导Cas9进行基因组编辑，但加入茶碱后，载体pU6-sgRNA-AZ2.O-VEGFA介导Cas9进行基因组编辑的效应被明显的削弱，而pU6-sgRNA-VEGFA介导Cas9进行基因组编辑的效应则无明显变化。此结果说明，本发明的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体介导Cas9对人VEGFA位点基因组编辑的效应可有有效的被茶碱控制。[0132]上述实验1和实验2说明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体介导Cas9对目标位点基因组编辑的效应可有效的被茶碱控制。[0133]3、表达靶向人PGRN基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体介导dCas9-KRAB蛋白对目标基因转录抑制效率和药物调控效果[0134]首先，发明人构建了人PGRN启动子启动表达萤光素酶的载体pGL3-PGRNPro-Luc，方法简述如下：[0135]使用引物[0136]Pl3：GGTACCAGGATACTTCTTTGTTG；[0137]P14：AGATCTCTCCTCCCTGCTTCCTCT〇[0138]以人胚肾HEK293细胞系的基因组为模板，扩增人PGRN启动子，其序列如下：[0139]GGTACCAGGATACTTCTTTGTTGTGGGGGATTGTTCTGTGTGTCGTGTGATGTTTAGTGGGATTGCTGGCCCTTACCTACCAGATGCCAGTGTCCCTCCACCCTGAGTTGTGACAACCCAGATTGTCTCCAGACACTCCTAAATGTCCCTGGCCGGCAAAATTGCCGCTGCTCAAGAATCACGGCTTTGACGATTAGACTTTGTGATATTTGTTTCAGTCTGTTTAGGTTT[0140]将PCR产物经质量浓度为I%的琼脂糖凝胶电泳后回收，克隆至pGEMT-easy载体，测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pGEMT-easy-PGRNPro;将载体pGEMT-easy-PGRNPro经过KpnI与BglΠ双酶切后，经过1%的琼脂糖凝胶电泳后回收PGRNPro片段，将其连接入经同样酶切的pGL3-basic载体上，经转化后，挑取克隆，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pGL3-PGRNPro-Luc载体结构如图6所示）。[0141]发明人在已有载体pU6-sgRNA中也插入了靶向人PGRN基因启动子的SgRNA序列，其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pU6-sgRNA-PGRNPro。[0142]接种HEK293细胞于24孔板，每孔1\105个细胞，共同转染表达《^9-1〇^8的蛋白的载体pHAGEEFladCas9-KRABAddgene，#50919，pGL3-PGRNPro-Luc与pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro入细胞；而同时，共同转染载体pHAGEEFladCas9-KRAB，pGL3-PGRNPro-Luc，pU6-sgRNA-PGRNPro进入细胞，作为阳性对照。细胞培养基中在不同时间点加入浓度为3mM的茶碱。24小时后收取细胞，使用试剂盒测试不同时间点加入茶碱后，各组细胞的焚光素酶表达变化，结果由实验组值与对照组值之间的比值来呈现。PGL3-PGRNPro-Luc上的PGRN启动子的活性会被靶向其启动子的sgRNA和具有转录抑制作用的dCas-KRAB9蛋白所抑制，而加入茶碱后pU6-sgRNA-AZ2.0-PGRNPro表达的靶向人PGRN基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA中包含的适体核酶会发生自剪切，使整个系统对PGRN启动子的抑制活性解除，所以实验结果中荧光素酶活力比值扩大，说明实验组中PGRN启动子的活性提高，即说明药物加入解除了该系统中的转录抑制的作用。结果见图7,结果表明，加入茶碱后的2个小时荧光素酶报告基因的活力就开始快速上升。[0143]上述实验3说明，本发明的表达靶向人PGRN基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体介导dCas9-KRAB的转录抑制作用可以被茶碱有效调控。

权利要求：1.一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型SgRNA的载体，其特征在于，在表达的SgRNA-八22.0骨架的四碱基环〇：61:抑1〇^以及莖环28七61111〇^2位置插入适体核酶？1-?5;通过KpnI与EcoRI位点和EcoRI与SpeI位点分别将U6启动子、sgRNA-AZ2.0骨架依次连入载体PUC19EKSHL中，获得载体pU6-sgRNA-AZ2.0;使用BsaI酶切载体pU6-sgRNA-AZ2.0，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列，获得pU6-sgRNA-AZ2.0-targetsite。2.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于：所述的插入适体核酶PI-F5的序列为：GGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCC。3.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，所述sgRNA-AZ2.0骨架的完整序列为：GAATTCGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGTo4.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，所述的U6启动子序列如下：GGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCGAATTCo5.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，所述的载体pU6-sgRNA-AZ2.0完整序列为：GGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCGAATTCGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGT〇6.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，所述的针对目标基因的sgRNA序列是针对目标基因编辑靶点，它们是针对GLRX3基因，VEGFA基因或者PGRN基因启动子中的任意一种。7.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体，其特征在于，所述的粘性末端连入针对目标基因编辑靶点的长度为19或20个核苷酸，退火构成其sgRNA片段的引物序列如下：GLRX3：ACCGTGAGGATAGGTAGGCCAAC与AAACGTTGGCCTACCTATCCTCA；VEGFA：ACCGGGTGAGTGAGTGTGTGCGTG与AAACCACGCACACACTCACTCACC；PGRNPro:ACCGCGTCGGGACAGCCTCAGCA与AAACTGCTGAGGCTGTCCCGACG〇8.权利要求1至7其中之一所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体在基因组编辑中的应用。9.权利要求1至7其中之一所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体在基因转录调控中的应用。

百度查询： 陕西师范大学 一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体及应用

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