【发明授权】贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用_华南农业大学_201810810848.9 

申请/专利权人:华南农业大学

申请日:2018-07-23

发明/设计人:邓音乐;孙秀云;宋施豪

公开(公告)日:2021-02-19

代理机构:广州市华学知识产权代理有限公司

公开(公告)号:CN108853120B

代理人:苏运贞

主分类号:A61K31/58(20060101)

地址:510642 广东省广州市天河区五山路483号

分类号:A61K31/58(20060101);A61P31/10(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.02.19#授权;2018.12.18#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要:本发明公开了贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用。本发明发明人以白色念珠菌为供试对象,筛选高效、低毒、不易产生耐药性的化合物,发现贝母辛对白色念珠菌的粘附性和致病性具有很好的抑制作用。而且,该化合物本身毒性较小,不影响人类细胞的生长;同时不影响白色念珠菌的正常生长,表明该化合物对白色念珠菌菌株的作用并不主要是依靠杀死白色念珠菌,而是通过抑制白色念珠菌的粘附性和致病性,因此不易产生耐药性。这在新型抗真菌药物的开发,尤其是抗白色念珠菌感染药物的开发方面具有很好的应用前景。

主权项:1.贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用。

全文数据:贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用技术领域[0001]本发明属于生物医药技术领域,特别涉及贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用。背景技术[0002]白色念珠菌Candidaalbicans是在人类中广泛传播的真菌疾病,是一种重要的条件致病真菌,通常会引起急性、亚急性或慢性感染,也是现在医院获得性感染最重要的病原之一。在健康人体黏膜表面,如口腔、肠道,白色念珠菌通常不会引起病害,但在免疫系统受到损害或抑制的病人体内,如化疗病人、器官移植病人或艾滋病人中,会引起严重的系统性感染,其致死率高达40%。[0003]目前在临床上抗真菌药物种类有限,其中唑类药物氟康唑)应用广泛,氟康唑是通过抑制真菌复制起到抑菌的作用,但是随着抗生素的滥用,耐药性的现象越来越严重。发明内容[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用。[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用。[0006]所述的贝母辛的CAS号为19773-24-1,其结构式如下所示:[0008]具体地,所述抗白色念珠菌是指抑制白色念珠菌的粘附性、致病性对白色念珠菌的毒力作用)。[0009]所述的抗白色念珠菌药物包括用于预防和或治疗白色念珠菌感染的药物,以及用于预防和治疗白色念珠菌引起的感染性疾病药物。[0010]本发明具有以下有益效果:[0011]本发明在前期工作中针对性地筛选高效、低毒、不易产生耐药性的化合物。然后以白色念珠菌Candidaalbicans为供试对象,考察了本发明筛选的贝母辛对白色念珠菌的粘附性以及细胞毒性的影响作用,目的是通过检测贝母辛对白色念珠菌毒力形成因素的干扰,进一步影响白色念珠菌的侵染作用。结果显示,贝母辛对白色念珠菌的粘附性和致病性具有很好的抑制作用。而且,贝母辛本身毒性较小,不影响人类细胞的生长;同时不影响白色念珠菌的正常生长,表明贝母辛对白色念珠菌菌株的作用并不主要是依靠杀死白色念珠菌,而是通过抑制白色念珠菌的粘附性、致病性,因此不易产生耐药性。这在新型抗真菌药物的开发,尤其是抗白色念珠菌感染药物的开发方面具有很好的应用前景。[0012]因此,贝母辛在制备抗白色念珠菌感染的药物中的应用,以及在制备预防和或治疗白色念珠菌引起的感染性疾病的药物中的应用,均应在本发明的保护范围之内。附图说明[0013]图1是贝母辛对白色念珠菌在A549细胞致病性方面的影响结果图;其中,图(A是终浓度为1〇〇μΜ的贝母辛对A549细胞的细胞毒性检测结果图;图⑻是不同浓度的贝母辛对白色念珠菌侵染细胞后的检测结果图;数据显示的是4个生物学重复的平均结果,误差棒反映了标准差。[0014]图2是贝母辛对白色念珠菌生长速率的影响结果图;其中,DMSO作为对照;数据显示的是3个生物学重复的平均结果,误差棒反映了标准差。[0015]图3是贝母辛对白色念珠菌粘附性的影响结果图;其中,DMS0、BDSF作为对照;数据显示的是4个生物学重复的平均结果,误差棒反映了标准差。具体实施方式[0016]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。[0017]除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。[0018]除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。[0019]实施例1贝母辛抗菌活性检测[0020]1、试验方法:[0021]1白色念珠菌菌株的活化:[0022]将白色念珠菌标准菌株SC5314名称亦为ATCCMYA-2876于LB固体培养基活化胰蛋白胨l〇gL、酵母提取物5gL、NaCl10gL、琼脂15gL,置于30°C培养箱培养过夜。[0023]2贝母辛对白色念珠菌菌株SC5314细胞毒力的影响:[0024]a人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的复苏及培养:将冻融的A549细胞转移至含10%vvFBS的DMEM培养基Gibco公司)中,37°C、5%C〇2条件下过夜培养。[0025]⑹A549细胞准备:A549细胞在含10%vo1胎牛血清的高糖培养基DMEM中,以1.5XIO4个孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80%的时候,弃去培养液,用IXPBS清洗细胞3次。[0026]c白色念珠菌准备:挑取新鲜SC5314接种于GMM培养液6.7gLYNB,0.2%wt葡萄糖)中,于30°C、200rpm条件下振荡培养过夜;用细胞维持液含l%volFBS的DMEM调节至㈤6QQ=1.0,再用细胞维持液稀释10倍〜108cfumL,得到含菌的细胞维持液。[0027]d细胞毒力测定:[0028]a用DMSO溶解贝母辛,制备浓度为2mM的贝母辛母液。[0029]b测定贝母辛本身对细胞的毒力作用:将贝母辛母液用DMSO稀释到ImM,加入细胞维持液中,贝母辛的终浓度为1〇〇μΜ,得到测试液A;同时,设置对照组,即以相同体积的DMSO取代贝母辛母液,得到测试液Β。按IOOyL孔,将测试液A和测试液B分别加入准备好的Α549细胞中,置于37°C、5%CO2细胞培养箱内培养8h,每处理4个重复。[0030]C测定贝母辛和白色念珠菌对细胞的毒力作用:将贝母辛母液用DMSO稀释成浓度为ImM、500μΜ、250μΜ、125μΜ的稀释药液,然后将贝母辛母液和贝母辛稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,得到测试液C,贝母辛在测试液C中的终浓度分别为200μ皿、10^]\1、5^]\1、25以]\1、12.5以]\1;同时设置只加0150二甲基亚砜)、805?^8-2-1〇16。611〇化acid,顺2-十二碳烯酸,上海有德化工科技有限公司)和FLC氟康唑)作为对照,其中,以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,得到测试液D;以BDSF母液(用DMSO溶解得至IJ,浓度为ImM与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,得到测试液E;以氟康唑母液用DMSO溶解得到,浓度为ImM与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,得到测试液F。按IOOyL孔,将测试液C〜F分别加入准备好的A549细胞中,置于37°C、5%CO2细胞培养箱内培养8h,每处理4个重复。[0031]d参照Promega公司CytoTox96:*NonRadioactiveCytotoxicityAssay操作方法测定细胞LDH活性,随后用GraphPadPrism6处理数据。[0032]3贝母辛对白色念珠菌菌株SC5314生长影响测定:[0033]挑取菌株SC5314单菌落接种于GMM培养液6.7gLYNB,0.2%wt.葡萄糖),30°C、200rpm振荡培养过夜,测定菌液㈤600,用GMM将菌液稀释至OD6qq=O.05。将该菌液与浓度为ImM的贝母辛药液按体积比9:1混合,按300μ!7孔的量加入到100孔板中,每个处理设置3个重复,同时设置只加DMSO的处理。置于生长曲线测定仪中,30°C,200rpm,每211测定一次OD600值,2d后观察实验结果,GraphPadPrism6处理数据。[0034]⑷贝母辛对白色念珠菌菌株SC5314粘附性的影响:[0035]aA549细胞的复苏及培养:将冻融的A549细胞转移至含10%volFBS的DMEM培养基Gibco公司)中,37°C,5%C02条件下过夜培养。[0036]⑹A549细胞准备:A549细胞在含10%vo1胎牛血清的高糖培养基DMEM中,以0.5XIO3个孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80%的时候,弃去培养液,用IXPBS清洗细胞3次。[0037]c挑取LB固体平板上的SC5314菌株,接种于GMM培养液6·7gLYNB,0·2%wt葡萄糖)中,30°C,200rpm振荡培养过夜,测定菌液0D6QQ。随后用细胞维持液含l%volFBS的DMEM调节将菌液稀释至OD6qq=O.5。将贝母辛母液用DMSO稀释成浓度为1πιΜ、500μΜ、250μΜ、125μΜ的稀释药液,然后将贝母辛母液、贝母辛稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,震荡混匀,得到测试液G,贝母辛在测试液G中的终浓度分别为200μΜ、100μΜ、50μΜ、25μΜ、12.5μΜ。按IOOyL孔加入步骤⑹已培养细胞的96孔板中,每个处理设置4个重复;同时设置只加DMSO和BDSF的处理,其中,以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,得到测试液Η;以BDSF母液用DMSO溶解得到,浓度为ImM与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合,得到测试液I。将96孔板静置于37°C中孵育,1.5h后弃掉培养液,每孔加入100yL浓度为0.1%wv的结晶紫溶液,室温作用45min。将结晶紫弃掉,并用冰ddH20洗10次,加入IOOyL浓度为体积百分比75%的乙醇溶液,室温放置30分钟,测定OD59q,用GraphPadPrism6软件处理数据。[0038]2、实验结果[0039]1贝母辛对白色念珠菌菌株SC5314的毒力有一定抑制作用[0040]我们通过检测LDH的释放量来检测细胞的毒性,在检测白色念珠菌的细胞毒性时,我们将加入了DMSO组的LDH释放量作为100%,并由此来规范其他加入贝母辛组的LDH释放比例。结果如图1所示,数据显示的是4个生物学重复的平均结果,误差棒反映了标准差。[0041]细胞毒力实验结果显示,以DMSO为对照,在没有白色念珠菌的条件下,贝母辛对细胞没有毒性,如图UA所示。[0042]而在加白色念珠菌SC5314的条件下,以DMSO为阳性,BDSF为阴性对照,图1⑻显示贝母辛在抑制菌株SC5314对细胞的侵染有一定保护作用;贝母辛在ΙΟΟμΜ的浓度时,白色念珠菌的毒力降低到2.8%。[0043]2贝母辛对白色念珠菌菌株SC5314的生长没有影响[0044]结果如图2所示,以DMSO为对照,贝母辛的浓度为ΙΟΟμΜ时对白色念珠菌菌株SC5314的生长基本没有影响。该结果表明贝母辛对白色念珠菌菌株SC5314的作用并不是杀死细菌,因此不易产生耐药性。[0045]3贝母辛抑制白色念珠菌菌株SC5314的粘附性[0046]如图3所示,以DMSO、BDSF为参照,经终浓度为1ΟΟμΜ的贝母辛处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯上的粘附性,降低了75.6%左右。表明贝母辛显示出了对白色念珠菌SC5314的粘附性有一定抑制作用。[0047]上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求:1.贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用,其特征在于:所述的抗白色念珠菌药物是具有抑制白色念珠菌的粘附性、致病性的药物。3.根据权利要求1所述的贝母辛在制备抗白色念珠菌药物中的应用,其特征在于:所述的抗白色念珠菌药物为用于预防和或治疗白色念珠菌感染的药物,以及用于预防和治疗白色念珠菌引起的感染性疾病药物中的一种或两种。

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