申请/专利权人：辽宁省农业科学院

申请日：2018-08-21

公开（公告）日：2021-02-19

公开（公告）号：CN108828103B

主分类号：G01N30/02(20060101)

分类号：G01N30/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.19#授权;2018.12.11#实质审查的生效;2018.11.16#公开

摘要：本发明公开了羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，包括以下步骤：1将羊肚菌菌丝体烘干制成菌粉，添加于水中超声，90‑95℃水浴锅保温3.5‑4.5h，过滤后取上清液；再用水系滤膜过滤，收集续滤液加同体积的运行缓冲液作为样品溶液；2样品溶液进行毛细管电泳，检测波长214nm，分离电压18‑22kV，温度20‑25℃，压力0.5psi进样8‑12s，运行时间为30‑40min，得到标准指纹图谱；并且公开了其标准指纹图谱。通过比较羊肚菌共有的特征峰可有效地将其与其他食用菌区分开；本发明方法样品处理简单，色谱条件容易实现，对环境无害；稳定性和重现性好；适用于羊肚菌真伪、品质的鉴别和控制。

主权项：1.羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，其特征在于，包括以下步骤：1将羊肚菌菌丝体烘干制成菌粉，添加于水中超声，90℃-95℃水浴锅保温3.5-4.5h过滤后取上清液；再用水系滤膜过滤，收集续滤液加同体积的运行缓冲液作为样品溶液；2样品溶液进行毛细管电泳，电泳条件为：50μm×57cm未涂层石英毛细管，有效检测长度48cm；运行缓冲液为10mmolLpH9.21的硼砂缓冲液；检测波长214nm；分离电压20kV；温度25℃；压力0.5psi进样10s，运行时间为30min，得到指纹图谱。

全文数据：羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱技术领域[0001]本发明涉及成分分析领域，更具体的说是涉及羊肚菌即⑶指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱。背景技术_2]羊肚菌MorchellaDill.ExPers.:Fr，隶属于子囊菌门Ascomycata、盘菌亚门Pezizomycotina、盘菌纲Pezizomycetes、盘菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae，因其菌盖有不规则的凹陷裙皱，状如羊肚而得名，是一种珍贵的食药用真菌。羊肚菌在亚洲、欧洲、北美洲等均有分布，以温带落叶阔叶林、高海拔暗叶针叶林及针阔混合林为主要植被生境，主要在3-5月出菇，少数物种在7月和9-10月出菇。[0003]我国羊肚菌主要分为两大类群，黑色羊肚菌支系和黄色羊肚菌支系，共30多个种，其中，仅部分种质羊肚菌可进行人工栽培。然而，由于缺乏有效的菌种鉴定方法，很容易造成羊肚菌生产中的菌种混乱，菌种鉴定是羊肚菌人工栽培、生产的重要前提，因此，如何提供一种科学有效的羊肚菌鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0004]有鉴于此，本发明提供了羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱，通过HPCE指纹图谱可有效对羊肚菌进行鉴别。[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0006]羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，包括以下步骤：[0007]1将羊肚菌菌丝体烘干制成菌粉，添加于水中超声，90-95。：水浴锅保温3.5-4•5h，过滤后取上清液;再用水系滤膜过滤，收集续滤液加同体积的运行缓冲液作为样品溶液；[0008]2样品溶液进行毛细管电泳，检测波长214nm，分离电压18-22kV，温度20-25。：，压力0.5psi进样8-12s，运行时间为30_40min，得到指纹图谱。[0009]通过上述样品处理方法及电泳条件均保证了样品良好的分离度，使得峰形完整、无拖尾，干扰峰较小。[0010]其中，通过对l9〇_3〇〇nm范围检测波长进行试验，本发明检测波长下12个特征峰出峰完整，干扰峰峰值小，分离效果最好。此外，254nra、28〇nm下分离效果较好。[0011]本发明分离电压及进样时间下峰形完整，无出峰延迟。[0012]优选地，步骤1中羊肚菌菌粉的制备方法如下：[0013]1羊肚菌活化接种于马铃薯液体培养基中，25。：，180rmin摇床培养7d;[0014]2过滤发酵液得到菌丝体，用无菌水冲洗菌丝体3次，6〇°C烘干，粉碎，过100目筛子，得到菌粉。[0015]优选地，步骤⑴中菌粉与水的质量比为1:30,超声30min。[0016]优选地，羊肚菌菌粉添加于水中超声，95°C水浴锅保温4h。[0017]优选地，步骤⑴中水系滤膜孔径为0•22um。[0018]优选地，运行缓冲液为lOmmolLpH9.21的硼砂缓冲液。[0019]通过对磷酸盐缓冲液等多种缓冲体系进行筛选，得到运行缓冲液的种类、浓度及pH，保证样品良好的分离度和峰形。[0020]优选地，步骤⑵中的电泳条件为:50mXMem未涂层石英毛细管，有效检测长度48cm;运行缓冲液为l〇mmolLpH9.21的硼砂缓冲液;检测波长21411111;分离电压201^;温度25°C;压力〇.5psi进样10s，运行时间为30min。[0021]羊肚菌HPCE标准指纹图谱，包括12个特征峰，1-12号特征峰的保留时间分别为6.237-6.554min，7.183-7.696min，7.675-8.454min，10.146_10.613min，11.512-12.567min，13.35-14.829min，14.363-16.179min，14.663-16.604min，14.942-17.235min，16.512-18_45min，17.829-20.579min，18•788-21.954min。[0022]优选地，黑色羊肚菌支系4号特征峰为单头峰，黄色羊肚菌支系4号特征峰为双头峰。[0023]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱，通过比较羊肚菌共有的特征峰可有效地将其与其他食用菌区分开;本发明方法样品处理简单，色谱条件容易实现，未使用有毒有害的溶剂，对环境无害;稳定性和重现性好;适用于羊肚菌真伪，品质的鉴别和控制。附图说明[0024]为了更清楚地说明本发明技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0025]图1附图为羊肚菌HPCE标准指纹图谱。[0026]图2附图为不同浓度硼砂缓冲液处理下羊肚菌指纹图谱。[0027]图3附图为不同分离电压下羊肚菌指纹图谱。[0028]图4附图为不同进样时间下羊肚菌指纹图谱。[0029]图5附图为羊肚菌Mel-10指纹图谱。[0030]图6附图为羊肚菌Mel-6指纹图谱。[0031]图7附图为羊肚菌Mel-7指纹图谱。[0032]图8附图为羊肚菌201指纹图谱。[0033]图9附图为羊肚菌Mes-9指纹图谱。[0034]图10附图为羊肚菌Mes-6指纹图谱。[0035]图11附图为羊肚菌Mes-24指纹图谱。[0036]图12附图为蛹虫草指纹图谱。[0037]图13附图为桑黄指纹图谱。具体实施方式[0038]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0039]实施例1[0040]羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，包括以下步骤：[0041]1羊肚菌活化接种于马铃薯液体培养基中，25°C，180rmin摇床培养7d;过滤发酵液得到菌丝体，用无菌水冲洗菌丝体3次，60°C烘干，粉碎，过100目筛子，得到菌粉。将菌粉添加于水中，菌粉与水的质量比为1:30，超声30min，95°C水浴锅保温4h，过滤后取上清液;再用0.22圓水系滤膜过滤，收集续滤液加同体积l〇mm〇lLpH9.21的硼砂缓冲液作为样品溶液。[0042]⑵样品溶液进行毛细管电泳，电泳条件如下：50umX57cm未涂层石英毛细管，有效检测长度48cm;检测波长214nm;分离电压20kV;温度25°C;压力0.5psi进样10s，运行时间为30min。[0043]以黑色羊肚菌为试验材料，制得的HPCE标准指纹图谱如图1所示，包括12个特征峰。1-12号特征峰的保留时间分别为6.471111111，7.58311^11，8.27911^11，10.5211^11，12.313min，14.488min，15.800min，16.175min，16.896min，18.025min，19.988min，21•196min〇[0044]实施例2[0045]分别使用10、20、50、75mtno1LpH9.21的硼砂缓冲液对黄色羊肚菌样品进行分离，比较不同缓冲液的分离效果，其余条件同实施例1。如图2所示，从上到下分别为10、20、50、75111111〇11硼砂缓冲液处理得到的图谱，其中，1〇11]111〇1几0}19.21的硼砂缓冲液分离效果最佳，因此，选择10mm〇lLpH9.21的硼砂缓冲液作为运行缓冲液。[0046]实施例3[0047]比较15、20、30kV分离电压下的迁移与分离情况，其余条件同实施例1。如图3所示，从上到下分别为分离电压15kV、20kV、30kV对应的图谱，其中，15kV时基线较差，30kV时出峰延迟，峰形拖尾，故最终选择20kV作为电泳测定的运行电压。[0048]进行5s、10s、20s进样时间的测定，如图4所示，从上到下分别为进样时间5s、1Os、20s对应的图谱，其中，进样5s峰形不完整，20s浓度过高，连峰情况增多，进样时间10s效果较好。[0049]实施例4[0050]对不同品种羊肚菌进行指纹图谱分析，实验样本包括Mel-10、Mel-6、Mel-7、201、Mes-9、Mes-6、Mes-24,其中，1^1-10、1^1-6、1^1-7、201为黑色羊肚菌，采自四川、武汉等地，可人工栽培;Mes-9、Mes-6、Mes-24为黄色羊肚菌，采自四川、辽宁，不可人工栽培。[0051]7种羊肚菌的指纹图谱如图5-11所示，由图可知，7种羊肚菌均具有12个特征峰。其中黑色羊肚菌支系4号特征峰为单头峰，黄色羊肚菌支系4号特征峰为双头峰。[0052]实施例5[0053]使用实施例1方法分别测定蛹虫草、桑黄的指纹图谱，如图12-13所示，蛹虫草、桑黄指纹图谱与本发明羊肚菌指纹图谱具有显著差异。[0054]本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0055]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

权利要求：1.羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴将羊肚菌菌丝体烘干制成菌粉，添加于水中超声，9〇。〇95°C水浴锅保温3.5-4.5h过滤后取上清液;再用水系滤膜过滤，收集续滤液加同体积的运行缓冲液作为样品溶液；⑵样品溶液进行毛细管电泳，检测波长214nm，分离电压18kV-22kV，温度20。：-25，压力0.5psi进样8s-l2s，运行时间为30min-40min，得到指纹图谱。2.根据权利要求1所述的羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤Q中羊肚菌菌粉的制备方法如下：1羊肚菌活化接种于马铃薯液体培养基中，25°C，180rmin摇床培养7d;2过滤发酵液得到菌丝体，用无菌水冲洗菌丝体3次，60°C烘干，粉碎，过100目筛子，得到菌粉。3.根据权利要求1所述的羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤（D中菌粉与水的质量比为1:3〇,超声3〇min。4.根据权利要求1所述的羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤（1中水系滤膜孔径为〇.22um。5.根据权利要求1所述的羊肚菌I1PCE指纹图谱建立方法，其特征在于，所述运行缓冲液为1〇111111〇11口!19.21的硼砂缓冲液。6.根据权利要求1所述的羊肚菌HPCE指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤2中的电泳条件为:50wnX57cm未涂层石英毛细管，有效检测长度48cm;运行缓冲液为lOmmolLpH9.21的硼砂缓冲液;检测波长214nm;分离电压20kV;温度25°C;压力0.5psi进样10s，运行时间为30min。7.羊肚菌HPCE标准指纹图谱，其特征在于，包括12个特征峰，1-12号特征峰的保留时间分别为6•237-6.554min，7•183-7•696min，7•675-8.454min，10.146-10•613min，11•512-12.567min，13.35-14.829min，14.363-16•179min，14•663-16.604min，14•942-17•235min，16.512-18.45min，17•829-20.579min，18.788-21.954min。8.根据权利要求7所述的羊肚菌HPCE标准指纹图谱，其特征在于，黑色羊肚菌支系4号特征峰为单头峰，黄色羊肚菌支系4号特征峰为双头峰。

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