申请/专利权人：扬州大学

申请日：2017-03-02

公开（公告）日：2021-02-23

公开（公告）号：CN106834242B

主分类号：C12N7/01(20060101)

分类号：C12N7/01(20060101);C12N15/85(20060101);C12N15/66(20060101);C12R1/93(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.23#授权;2017.07.07#实质审查的生效;2017.06.13#公开

摘要：嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1‑233株及其构建方法，属于疫苗研究生产技术领域，包括PCV1、PCV2毒株的筛选、表达猪圆环病毒2b型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株的构建、重组病毒核酸、氨基酸序列的组成特征与生物学特性。最终获得可用于工业化生产的表达猪圆环病毒2b型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1‑233株）。

主权项：1.嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株，保藏号为CGMCCNo.13592。

全文数据：嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株及其构建方法技术领域[0001]本发明属于疫苗研究生产技术领域，特别是表达猪圆环病毒2b型0RF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株的构建技术。背景技术[0002]猪圆环病毒2型PCV2严重危害世界养猪业的健康发展，PCV2广泛分布于世界各地。而猪圆环病毒1型PCVl是1974年由德国学者Tischer从PK15传代细胞系中作为一种细胞污染物而首次发现的[TischerI,RaschR，TochtermannG，etahCharacterizationofpapovavirusandpicornavirus—likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines[J]·ZentralblBakteriolOrigA,1974,2262:153-167.]，尽管在全球各地流行，但迄今为止并未发现其具有致病能力。而PCV2是随后从病猪体内分离得到的，其与PCVl非常类似，但在抗原性和基因组序列上有很大差异，因而被命名为猪圆环病毒2型PCV2。所以，根据PCV的致病性与基因组核酸序列的不同将PCV分为PCVl与PCV2两种基因型。因PCV2能够造成断奶仔猪多系统衰竭综合征、繁殖障碍、猪呼吸道病复合征及皮炎和肾病综合征等多种疾病，给世界养猪业造成了严重危害，因此成为国内外研究的热点。[0003]当然，目前研究最多的是PCV2。基于对PCV2核酸序列的比较，又将其分为PCV2a_PCV2e等5个基因亚群，我国目前主要流行的是PCV2b和PCV2d亚群。在20世纪90年代到2000年流行的基因群主要是PCV2a，2001-2010年流行的主要基因群为PCV2b，2011年至今，主要流行PCV2b和PCV2d基因群[XiaoCT，Halbur，OpriessnigT，etahGlobalmoleculargeneticanalysisofporcinecircovirustype2PCV2sequencesconfirmsthepresenceoffourmainPCV2genotypesandrevealsarapidincreaseofPCV2d.[J]JGenVirol,2015,96:1830-1841·]。为控制猪圆环病毒病的流行，商品化的亚单位疫苗及全病毒灭活疫苗在世界多地的养猪场得到使用，并取得了一定的效果。[0004]PCV2是已知的脊椎动物中最小的可自主复制的无囊膜病毒，具有1.7kb的单链闭合环状负链DNA基因组，其中有三个研究透彻的开放阅读框[WaliaR，DardariR，ChaiyakulM,etal.Porcinecircovirus-2capsidproteininducescelldeathinPK15cells[J].Virology,2014，11:126-132.]。？^2基因组排列十分紧密，基因组包含11个潜在ORFs，其阅读框大小各异，编码产物大小也相差悬殊。大多数阅读框出现重叠，基因组长度分为两种，一种1767bp，另一种为1768bp[FenauxM,HalburPG,GillM，etal.Geneticcharacterizationoftype2porcinecircovirusPCV2frompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofNorthAmericaanddevelopmentofadifferentialPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithPCVlandPCV2[J].JClinMicrobiol,2000,387:2494-2503.]〇ORFl编码参与病毒基因组复制的两种蛋白质，rep和剪接变异体rep’，而0RF2编码主导免疫原性的cap衣壳蛋白。0RF3编码非结构蛋白，该蛋白具有促凋亡蛋白的特征。PCV2基因组有限的编码容量意味着PCV必须为多功能产物编码，以确保在宿主细胞内稳定高效地复制与转录。[0005]由于PCV2感染危害严重，而疫苗是预防该病的有效手段之一，疫苗自然成为全世界研究的热点。Fenaux等2004用PCV2的0RF2基因替换非致病性PCVl相应的0RF2基因成功构建出了PCV1-2感染性克隆，其保留了PCVl的非致病性，同时还能诱导猪体产生针对PCV2的特异性抗体[FenauxM,OpriessnigT,HalburPG,etal.AchimericporcinecircovirusPCVwiththeimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2PCV2clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVlinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J].JVirol,2004,7812:6297-6303.]。值得强调的是，上述作者在构建PCV1-2时，采用I不完全酶切方法实现PCVl-2双拷贝的构建，经本实验室多年、多次验证，这一方法中的不完全酶切条件难以精准控制，导致构建成功率极低。发明内容[0006]本发明的第一目的是提出一种嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株。[0007]该嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株的保藏号为CGMCCNo.13592。[0008]该材料于2017年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号），建议的分类命名为:嵌合型猪圆环病毒l-2b。[0009]本发明第二目的是提出以上嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株的构建方法。[0010]本发明方法包括以下步骤：1构建缺失PCVl0RF2基因组的pSK+-PCVlΔ0RF2:以PCVl全基因组为模板，用引物I-F和引物I-R扩增出PCVl全基因组;将PCVl全基因组与pGEM-TEasy质粒连接，获得质粒T-PCVl，pBluescriptSK+载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCVl基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCVl与pSK+载体连接，获得重组质粒pSK+-PCVl;以质粒pSK+-PCVl为模板，用引物丑paI-R和引物VarI-F扩增出pSK+-PCVlA0RF2基因；2构建重组质粒pSK+-sPCVl-2b:以PCV2b0233株基因组为模板，用引物PsiI-F和引物UI-R扩增出PCV2b0RF2的DNA片段;再将pSK+-PCVlΔ0RF2与PCV2b0RF2连接得到重组质粒pSK+-sPCVl-2b;3构建重组质粒pSK+-dPCVl-2b:对重组质粒pSK+-sPCVl-2bm^MI和BstBI进行双酶切，得到1563bp的条带片段；对重组质粒pSK+-sPCVl-2b®〇MI和BstEΠ进行双酶切，得到1543bp的条带片段；对重组质粒pSK+-sPCVl-2b甩BstBI和BstEΠ进行双酶切，得到3428bp的条带片段；将上述1563bp的条带片段、1543bp的条带片段和3428bp的条带片段以1:1:3的摩尔比混合，并用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pSK+dPCVl-2b，即嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株。[0011]以上方法中采用的各引物为：引物引物引物.引物VarI-F:引物PsiI-F引物4cJI-R[0012]本发明采用特殊方法构建一种表达猪圆环病毒2b型0RF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株C1-233株），通过其核苷酸、氨基酸序列组成与生物学特性鉴定，这种活载体疫苗株可用于工业化生产。[0013]本发明的主要内容在于，通过对PCV1-2单拷贝质粒pSK+-SPCVl-2b采用特定的限制性内切酶分别进行三组双酶切，然后进行常规的连接反应实现PCV1-2双拷贝（pSK+-dPCVl-2b的构建。发明的核心避免了国外研究者使用的XpnI不完全酶切过程中反应条件不可控的缺陷，从而，大大提高了PCV1-2双拷贝构建的成功率；同时，通过探索不同的转染方法和筛选、使用特定的无PCVl污染的PK-15细胞系，使得转染后PCV1-2滴度可达IO5TCID5QmL以上，高于国外报道的104·6TCID5QmL。最终获得了完全适用于工厂化生产的表达猪圆环病毒2b型0RF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株C1-233株）。附图说明[0014]图Ia为pSK+-sPCVl-2b单拷贝）的构建示意图。[0015]图Ib为pSK+-dPCVl-2bC1-233双拷贝）的构建示意图。[0016]图2为办21和BstBI双酶切pSK+-sPCVl-2b质粒获得1563bp左右目的片段的电泳图。[0017]图3为办21和BstEn双酶切pSK+-sPCVl-2b质粒获得1543bp左右目的片段的电泳图。[0018]图4为BsiBI和BsiEn双酶切pSK⑴-sPCVl-2b质粒获得3428bp左右目的片段的电泳图。[0019]图5为BstBI单酶切pSK+-dPCVl-2b获得1767bp与4767bp左右目的片段的电泳图。[0020]图6为PCV2b0RF2特异性条带的电泳图。[0021]图7为接种PCV2b0233株的PK-15细胞的IFA图。[0022]图8为接种表达猪圆环病毒2b型0RF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株C1-233株的PK-15细胞的IFA图。[0023]图9为正常对照细胞IFA图。[0024]图10为试验猪血清荧光抗体消长情况图。[0025]图11为试验猪血清中和抗体消长情况图。具体实施方式[0026]一、表达猪圆环病毒2b型0RF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（Cl-233株的构建：设计用于扩增的引物序列如下：弄1所需引物及内切BS的iR別序列注:下划线部分为各内切酶的识别序列1、构建缺失PCVl0RF2基因组的pSK+-PCVlΔ0RF2:如图Ia所示，以PCVl全基因组为模板，用引物I-F和引物I-R扩增出PCVl全基因组;将PCVl全基因组与pGEM-TEasy质粒连接，获得质粒T-PCVl，pBluescriptSK+载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCVl基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCVl与pSK+载体连接，获得重组质粒pSK+-PCVl;以质粒pSK+-PCVl为模板，用引物丑paI-R和引物VarI-F扩增出长度为4065bp的pSK+_PCVlA0RF2基因。[0027]2、构建重组质粒pSK⑴-sPCVl_2b:以PCV2b0233株基因组为模板，用引物PsiI-F和引物UI-R扩增出PCV2b0RF2长度约702bp的DNA片段;将回收纯化的pSK+-PCVlA〇RF2与PCV2b0RF2连接得到长度为4767bp的pSK+-sPCVl-2b。[0028]3、构建重组质粒pSK⑴-dPCVl-2b:如图Ib所示：1对?31+-#^1-213用办71和5扣81进行双酶切，将酶切产物用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为204bp，1563bp，3000bp左右的三条条带片段，如图2所示。图2中，M:DL5000DNAMarker;l:pSK+-sPCVl-2b质粒；24ρώΙ酶酶切pSK+-sPCVl-2b质粒获得3000bp与1767bp左右片段;3=BstBI酶酶切1767bp片段获得1563bp与204bp左右片段;4:胶回收孔2中1767bp左右目的片段。[0029]将孔3中1563bp左右的条带片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。2对pSK+-sPCVl-2bffli扬州大学〈120嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株及其构建方法〈16010121DNA〈213人工序列〈223根据pSK+-sPCVl-2b基因序列设计1tttggtacccgaaggccgatt2〈21124DNA〈213人工序列〈223根据pSK+-sPCVl-2b基因序列设计2attggtacctccgtggattgttct3〈21139DNA〈213人工序列〈223根据pSK+-sPCVl-2b基因序列设计3gaagttaaccctaaatgaataaaaataaaaaccattacg437DNA〈213人工序列〈223根据pSK+-sPCVl-2b基因序列设计4ggtggcgcctccttggatacgtcatcctataaaagtg5〈21133DNA〈213人工序列〈223根据pSK+-sPCVl-2b基因序列设计5aggttataagtggtggggggtctttaagattaa627DNA〈213人工序列〈223根据pSK+-sPCVl-2b基因序列设计6ggaaacgttaccgcagaagaagacacc71767DNA〈213人工序列〈223人工合成的C1-233株基因组核酸序列〈4007Cl-233株0RF2推导的氨基酸序列9MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro15ArgGerHisLeuGlyGlnHeLeuArgArgArgProTrpLeuVal30HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyliePhe45AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrlieLysLysThr60ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn75HeAsnAspPheLeuProProGlyGlyGlyGerAsnProArgGer90ValProPheGluTyrTyrArgHeArgLysValLysValGluPhe105TrpProCysGerProHeThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer120GerGlaValHeLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrlie150ThrGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro165ValLeuAspGerThrHeAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg180AsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrThrGlyAsnValAspHis195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerHeTyrAspGlnGlu210TyrAsnHeArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn225LeuLysAspProProLeuLysPro10233PRT〈213〉人工序列PCVl-2a0RF2推导的氨基酸序列10MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro15ArgGerHisLeuGlyGlnHeLeuArgArgArgProTrpLeuVal30HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyliePhe45AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrValLysGlaThr60ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn75HeAspAspPheValProProGlyGlyGlyThrAsnLysHeGer90HeProPheGluTyrTyrArgHeArgIysValLysValGluPhe105TrpProCysGerProHeThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer120ThrGlaValHeLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrlie150ProGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro165ValLeuAspGerThrHeAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg180AsnGlnLeuTrpMetArgLeuGlnThrGerArgAsnValAspHis195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerHeTyrAspGlnAsp210TyrAsnHeArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn225LeuLysAspProProLeuLysPro

权利要求：1.嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株，保藏号为CGMCCNo.13592。2.如权利要求1所述嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1构建缺失PCVl0RF2基因组的pSK+-PCVlΔ0RF2:以PCVl全基因组为模板，用引物I-F和引物I-R扩增出PCVl全基因组;将PCVl全基因组与pGEM-TEasy质粒连接，获得质粒T-PCVl，pBluescriptSK+载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCVl基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCVl与pSK+载体连接，获得重组质粒pSK+-PCVl;以质粒pSK+-PCVl为模板，用引物丑paI-R和引物VarI-F扩增出pSK+-PCVlA0RF2基因；2构建重组质粒pSK+-sPCVl-2b:以PCV2b0233株基因组为模板，用引物PsiI-F和引物UI-R扩增出PCV2b0RF2的DNA片段;再将pSK+-PCVlΔ0RF2与PCV2b0RF2连接得到重组质粒pSK+-sPCVl-2b;3构建重组质粒pSK+-dPCVl-2b:对重组质粒pSK+-sPCVl-2bm^Ml和BstBI进行双酶切，得到1563bp的条带片段；对重组质粒pSK+-sPCVl-2bm^MI和BstEΠ进行双酶切，得到1543bp的条带片段；对重组质粒pSK+-sPCVl-2b甩BstBI和BstEΠ进行双酶切，得到3428bp的条带片段；将上述1563bp的条带片段、1543bp的条带片段和3428bp的条带片段以1:1:3的摩尔比混合，并用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pSK+dPCVl-2b，即嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株；所述引物尤ΡΏI-F:5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’；引物办乃I-R:5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3’；引物丑paI-R:5,-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3,；引物VarI-F:5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’；引物PsiI-F:5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’；引物UI-R:5,-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3,〇

百度查询： 扬州大学 嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株及其构建方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD