申请/专利权人：北京艾迪康医学检验实验室有限公司

申请日：2017-09-15

公开（公告）日：2021-02-23

公开（公告）号：CN107447029B

主分类号：C12Q1/6858(20180101)

分类号：C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.23#授权;2018.01.05#实质审查的生效;2017.12.08#公开

摘要：本发明公开了利用荧光定量PCR技术检测MLL‑SEPT6融合基因相对表达量的方法，包括特异性的引物和探针，可作为筛查白血病患者体内MLL‑SEPT6融合基因微量残留，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

主权项：1.一组利用实时荧光PCR技术筛查MLL-SEPT6融合基因的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增MLL-SEPT6融合基因的引物和探针为：MLLexon9-F:GAACATCCTCAGCACTCTCTCCMLLexon10-F:TTGACTTCTGTTCCTATAACACCCMLLexon11-F:AAATTGGTGTTGTCGTCGTTGSEPT6exon2-R:CAAGCTGTCAAACCCCACAT和MLL-SEPT6-Probe:FAM-CCGAACTGTCCCCCTGGCTG-TAMRA。

全文数据：实时荧光PCR技术筛查白血病MLL-SEPT6融合基因的引物、探针和方法技术领域[0001]本发明属生物技术检测领域，特别涉及一种筛查融合基因的方法，采用探针Taqman实时荧光PCR技术检测人类白血病患者体内MLL-SEPT6融合基因的情况。背景技术[0002]白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。[0003]人类MLLmixed-lineageleukemiaormyeloidlymphoidleukemia基因，又称HRX、HTRX1、ALL-1或TRXl基因，位于11号染色体长臂2区3带（llq23，共36个外显子。MLL基因是造血过程调控的一个关键基因，其异常与白血病的发病密切相关。MLL基因与SEPT6基因发生易位重排，形成融合蛋白。SEPT6是MLL基因的融合伴侣之一，多见于婴儿型白血病。SEPT6基因位于X染色体长臂2区4带Xq24，有11个外显子。MLL-SEPT6融合基因目前发现五种融合形式：MLLexon7_SEPT6exon2、MLLexon8_SEPT6exon2、MLLexon9_SEPT6exon2、MLLexonl〇-SEPT6exon2和MLLexonll-SEPT6exon2。目前报道病例数最多的为：MLLexon9_SEPT6exon2、MLLexonl〇-SEPT6exon2和MLLexonll_SEPT6exon2三种融合形式。[0004]在实际应用中，用于筛查MLL-SEPT6融合基因的方法主要有染色体核型分析，多重巢式PCR联合电泳法等方法。染色体核型分析通过肉眼观察判断，需对样本中的有核细胞进行培养，具有核分裂相才能进行观察;而细胞培养增殖过程中，会出现某类细胞优势生长，“淹没”病变细胞的可能，造成染色体核型正常的假象。其次，有些病例染色体的易位复杂且微小，无法靠肉眼观察进行分析。再者，染色体核型分析无法满足MRDMinimalResidualDisease，微小残留病灶检测的需求。而多重巢式PCR联合电泳的方法耗时长，过程繁琐，易污染，结果的判断较主观，且PCR反应体系多，成本高，不适用于高通量的样本检测。只能进行定性检测，不能同时满足灵敏度高和特异性好的需求。因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对MLL-SEPT6融合基因的mRNA残留进行筛查。发明内容[0005]本发明设计了检测内参目的基因用引物、探针序列，采用实时荧光PCR技术，筛查MLL-SEPT6融合基因。该方法快速准确，灵敏度高，特异性好，检测通量大。[0006]用于MLL-SEPT6基因的检验试剂中包括红细胞裂解液、TRIzoI、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKitCTOYOBO公司）、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。[0007]检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIXT0Y0B0，QPS-101、检测目的基因用上下游引物分别为:MLLexon9-F、MLLexonlO-F、MLLexonll-F，SEPT6exon2-R探针为MLL-SEPT6-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针为abl-Probe。其中，[0008][0009][0010][0011][0012][0013][0014][0015][0016]具体地，所述阳性对照品分别为含有MLL-SEPT6基因的溶液;所述阴性对照品为不含MLL-SEPT6基因组溶液。[0017]本发明还提供了一种检测MLL-SEPT6融合基因相对表达量的试剂盒，包括：[0018]i全血基因组RNA抽提试剂及逆转录试剂；[0019]ii荧光定量PCR扩增反应试剂；[0020]所述荧光定量PCR反应试剂的引物和探针，包括：[0021][0022][0023][0024][0025][0026][0027][0028][0029]并且所述荧光定量PCR反应试剂还可包括扩增ABL内参基因的引物和探针，分别为：[0030][0031][0032][0033]本发明的有益效果:本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，分别构建内参基因abl和目的基因MLL-SEPT6,检测受测者体内MLL-SEPT6的相对于内参基因是否表达。实时荧光采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，自动化程度高、防污染等优点。相比于多重巢式PCR，该方法具有方便，经济，快捷，灵敏度高，特异性好，通量大等优点。避免巢式PCR的开盖反应，提高了结果的准确性，避免污染的发生;也提高了结果的易判断性，使检测记过更加客观易读。该方法有助于临床上白血病患者体内MLL-SEPT6融合基因的微量残留检测（灵敏度可达10个拷贝），对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。该方法可有效的节约检测时间，提高检测精度。本方法用于辅助临床上人类白血病的早期预防、早期诊断的辅助性指标;还可对对高危人群进行较为准确的筛查。[0034]MLL基因与SEPT6基因发生易位重排，形成融合蛋白。MLL-SEPT6融合基因目前发现融合概率高的主要为MLLexon9-SEPT6exon2、MLLexonl〇-SEPT6exon2和MLLexonll-SEPT6exon2三种融合形式。因此扩增MLL-SEPT融合基因从MLL基因第9、10、11外显子上设计上游引物，从SEPT6基因第2外显子上设计下游引物和探针。这样共用下游引物和探针，节约了成本。附图说明[0035]图1是使用本发明引物探针及方法对3号样本融合基因MLLexon9-SEPT6exon2的荧光扩增曲线图[0036]图2是使用本发明引物探针及方法对3号样本融合基因MLLexonl〇-SEPT6exon2的荧光扩增曲线图[0037]图3是使用本发明引物探针及方法对3号样本融合基因MLLexonll-SEPT6exon2的荧光扩增曲线图具体实施方式[0038]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。[0039]实施例1[0040]本方法用于辅助临床上人类白血病的早期预防、早期诊断的辅助性指标;还可对对高危人群进行较为准确的筛查。试剂包括：红细胞裂解液、TRIzoI、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKitT0Y0B0公司）。[0041]检测体系PCR反应液：ReverTraAceqPCRRTKitΤ0Υ0Β0公司）；THNDERBIRDProbeqPCRMix2X、MLL-SEPT6上、下游引物各0.32uM、MLL-SEPT6探针0.16uM;abl上、下游引物各〇·32uM、abl-probe探针0·16uM;其中：[0042][0043][0044][0045][0046][0047][0048][0049][0050]阳性对照品：分别含MLL-SEPT6基因组溶液；阴性对照品：不含MLL-SEPT6基因组溶液。[0051]实施例2[0052]本方法的操作流程：[0053]1抽提血液中的组织RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入Iml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混勾。室温静置IOmin;5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞;再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入ImlTRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min;加入0.2ml氯仿，震荡均匀；HOOOrpm4°C离心lOmin，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混勾，室温静置IOmin;HOOOrpm4°C离心IOmin，弃上清，加入75%乙醇Iml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；HOOOrpm4°C离心5min，弃乙醇；室温干燥10_15min，加入20ulRNase_free水溶解沉淀。[0054]2参考TOYOBO公司的ReverTraAceqPCRRTKit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNAo[0055]3试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xul，每人份23ul分装：[0056]X=23ul反应液Xη份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）；[0057]4加样:加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA;阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。[0058]5检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300,7500美国AppliedBiosysterns公司）等。反应条件：95°C预变性Imin;95°C15s，58°C35sec40个循环，荧光信号于58°C35sec时采集。[0059]6结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据CT值来判断。[0060]1内参阳性时，检测结果才认为有效；[0061]2阳性判断标准:CT值〈38的为阳性。无典型扩增曲线为阴性。[0062]实施例3[0063]临床样品检测[0064]取待测临床样品12个，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。[0065]每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。12例筛查样本中所有样本的abl均起线dSMLLexon9-SEPT6exon2、MLLexonl〇-SEPT6exon2和MLLexonll-SEPT6exon2未有标本出现起线。[0066]实验结果如下表：

权利要求：1.一种利用实时荧光PCR技术筛查MLL-SEPT6融合基因的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增MLL-SEPT6融合基因的引物和探针分别为：MLLexon9-F:GAACATCCTCAGCACTCTCTCCMLLexon10-F:TTGACTTCTGTTCCTATAACACCCMLLexon11-F:AAATTGGTGTTGTCGTCGTTGSEPT6exon2-R:CAAGCTGTCAAACCCCACATMLL-SEPT6-Probe:FAM-CCGAACTGTCCCCCTGGCTG-TAMRA。2.根据权利要求1所述的融合基因相对表达量的引物和探针，其特征在于，还包括扩增ABL内参基因的引物和探针，分别为：abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAabl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAabI-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。3.—种利用实时荧光PCR技术筛查MLL-SEPT6融合基因的检测方法，包括以下步骤：⑴抽提外周血中的总RNA并逆转录为cDNA;⑵利用荧光定量PCR反应试剂，以步骤1中的cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增；⑶判断结果；其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂的引物和探针，包括：MLLexon9-F:GAACATCCTCAGCACTCTCTCCMLLexon10-F:TTGACTTCTGTTCCTATAACACCCMLLexon11-F:AAATTGGTGTTGTCGTCGTTGSEPT6exon2-R:CAAGCTGTCAAACCCCACATMLL-SEPT6-Probe:FAM-CCGAACTGTCCCCCTGGCTG-TAMRA。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括扩增ABL内参基因的引物和探针，分别为：abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAabl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAabI-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

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