申请/专利权人：有研工程技术研究院有限公司

申请日：2017-12-25

公开（公告）日：2021-02-23

公开（公告）号：CN109957523B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);C02F11/02(20060101);C12R1/01(20060101);C02F101/20(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.23#授权;2019.07.26#实质审查的生效;2019.07.16#专利申请权的转移;2019.07.02#公开

摘要：本发明提供一株寡营养硫酸盐还原菌，分类命名为DesulfovibriovulgarisEM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCCM2017645。该菌可在寡营养浓度下厌氧还原硫酸根为负二价硫离子，可用于河道底泥重金属重金属污染修复。

主权项：1.一株寡营养硫酸盐还原菌，其特征在于，分类命名为DesulfovibriovulgarisEM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCCM2017645。

全文数据：一株寡营养硫酸盐还原菌及其用于河道底泥重金属污染修复的工艺技术领域本发明涉及微生物技术领域。特别是涉及一种Desulfovibrio属细菌、其培养方法以及利用该菌对河道底泥重金属污染进行治理的工艺。背景技术随着我国城市化进程及工业的加速发展，河道重金属污染普遍存在。2012年龙江河镉污染事件后，大量镉以氢氧化镉的方式沉积于河道底泥，却仍然在缓慢溶解，污染周边水体环境，类似环保事故在我国多地不断发生。现有河道底泥重金属污染治理技术主要以工程清淤为主，在清淤过程中，由于河道底泥和水体及氧气的二次混合，容易造成已沉积的大量重金属氧化返溶，形成二次重金属污染，且清淤工程成本较高，清淤底泥的处置也是较大的问题。目前缺乏原位低成本底泥重金属污染治理技术。硫酸盐还原菌可以还原硫酸根产生S2-，所产生的S2-可与重金属形成金属硫化物沉淀，所形成的金属硫化物，在缺乏氧气的环境是很难再次溶解的，因此硫酸盐还原菌可考虑用于底泥重金属污染治理，然而，硫酸盐还原菌还原硫酸根的过程需要大量的碳源，而河道中碳源浓度不足，因而造成硫酸盐还原菌在底泥重金属污染治理过程中受限。发明内容本发明的第一个目的是提供一株高效的寡营养硫酸盐还原菌种，该菌种可在较低碳源浓度下生长，并实现高效硫酸盐还原过程。本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。本发明的第三个目的是提供一种利用该菌在低浓度碳源下实现硫酸盐还原并对河道底泥重金属污染进行治理的工艺。为了实现上述目的，本发明提供一株寡营养硫酸盐还原菌，分类命名为DesulfovibriovulgarisEM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCCM2017645。如上所述的寡营养硫酸盐还原菌菌株是纯菌株，利用16SrDNA克隆文库技术鉴定该菌株表明，该菌株属于Desulfovibrio属。如上所述的寡营养硫酸盐还原菌可在低碳源浓度COD15mgL下稳定生长并实现高效硫酸盐还原过程。本发明还提供一种用于放大培养如上所述的寡营养硫酸盐还原菌的培养基，该培养基配方为：1.0gL氯化铵，2.0gL硫酸钠，1.0gL硫酸锌，2.0gL七水硫酸镁，0.5gL磷酸二氢钾，0.1gL氯化钙，0.1gL蛋白胨，0.2mLL乳酸钠，pH7.0～7.5。本发明还提供一种上述寡营养硫酸盐还原菌的放大培养方法，将所述硫酸盐还原菌接种入如上所述的培养基中，在25-35℃的培养温度下，摇床转速200rpm培养至菌种浓度107个mL。本发明另提供一种利用如上所述的寡营养硫酸盐还原菌进行河道底泥重金属污染治理的工艺，将所述硫酸盐还原菌，采用如上所述的方法进行放大培养后，接种至活性炭填料上，接种量为每立方米体积约2-3L，培养时间3d，之后将填料组装成为填料球，并配重沉至河道底泥表面，即可开展底泥重金属污染修复如上所述硫酸盐还原菌的获得方法为：1按照如上所述的菌种富集分离培养基配方：1.0gL氯化铵，2.0gL硫酸钠，1.0gL硫酸锌，2.0gL七水硫酸镁，0.5gL磷酸二氢钾，0.1gL氯化钙，0.1gL蛋白胨，0.2mLL乳酸钠，pH7.0～7.5，结冷胶30gL。2将取自广西河池市龙江河底泥5g，加入0.3g酵母粉，在30℃轻轻震荡富集培养1周，利用显微镜检测判断细菌生长情况；细菌生长至测量细菌培养液在600nm处的吸光值,得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，即可进行下一步操作。3将富集的硫酸盐还原菌接入上述培养基利用涂布平板法进行纯化；并挑单菌落进行进一步平板划线。分离出的单菌落进行下一步操作。4纯化后的细菌利用扫描电镜进行菌种形态观察；5采用16SrDNA克隆文库技术对分离纯菌株进行鉴定，鉴定结果表明该菌株属于Desulfovibrio属。本发明的有益效果在于：本发明提供了一株菌株DesulfovibriovulgarisEM2，该菌在寡营养条件下COD15mgL高效还原硫酸根为S2-，从而方便实现河道底泥重金属污染治理。附图说明图1为本发明所提供硫酸盐还原菌的扫描电镜照片。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。本发明所涉及的寡营养硫酸盐还原菌已进行保藏，科学命名为DesulfovibriovulgarisEM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日为：2017年11月1日，保藏登记号为：CCTCCM2017645。本发明所述硫酸盐还原菌的培养方法如下：首先配制固体培养基：称取1.0g氯化铵，2.0g硫酸钠，1.0g硫酸锌，2.0g七水硫酸镁，0.5g磷酸二氢钾，0.1g氯化钙，0.1g蛋白胨，0.2mL乳酸钠，1000mL蒸馏水、结冷胶30gL配制培养基。配制培养基，调pH为7.0，121℃灭菌25分钟，灭菌后每100mL倒一平板，制成用于富集培养的固体培养平板。配制液体培养基：称取1.0g氯化铵，2.0g硫酸钠，1.0g硫酸锌，2.0g七水硫酸镁，0.5g磷酸二氢钾，0.1g氯化钙，0.1g蛋白胨，0.2mL乳酸钠，1000mL蒸馏水。配制培养基，调pH为7.0，121℃灭菌25分钟制成用于富集、分离、放大培养的液体培养基。将5g采自广西龙江河底泥加入0.3g酵母粉，在30℃轻轻震荡培养1周。利用显微镜检测判断细菌生长情况。采用膜过滤将上述培养液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以5％的接种量分别接种于多个100mL液体培养基中，30℃进行培养，并设置不接种对照CK。100rpm培养两周后观察细菌生长情况。将培养液梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，分别取100μL稀释液涂板，30℃培养三天。得到单菌落。用扫描电镜观察菌体形态，菌体形态如图1所示。用16SrDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16SrDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株为Desulfovibrio属细菌。将该菌种按进行放大培养后，接种至活性炭填料上，接种量为每立方米体积约3L，培养时间3d，之后将填料组装成为填料球，投放至Cd污染河道区域。在本实施例的具体施工时，将填料充填于填料球内，填料球之间以尼龙绳连接后形成填料球毯，每平方米需要直径10cm的浮球80个。每个浮球体积为0.0005m3，每平米浮球填充体积为0.04m3，充填率按50％计算，每平米浮球需要填料0.02m3。修复3个月后采集河道底泥分析底泥镉形态，与对照区相比，修复区底泥矿物态镉含量提高80％，可交换态镉降低90％，说明该菌可有效修复重金属污染底泥，并形成屏障层，防治底泥中重金属二次泄露。

权利要求：1.一株寡营养硫酸盐还原菌，其特征在于，分类命名为DesulfovibriovulgarisEM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCCM2017645。2.一种用于放大培养如权利要求1所述的寡营养硫酸盐还原菌的培养基，其特征在于，该培养基配方为：1.0gL氯化铵，2.0gL硫酸钠，1.0gL硫酸锌，2.0gL七水硫酸镁，0.5gL磷酸二氢钾，0.1gL氯化钙，0.1gL蛋白胨，0.2mLL乳酸钠，pH7.0～7.5。3.如权利要求1所述的寡营养硫酸盐还原菌的放大培养方法，其特征在于，将所述硫酸盐还原菌菌种接种入如权利要求2所述的培养基中，在25-35℃的培养温度下，摇床转速200rpm培养至菌种浓度107个mL。4.一种如权利要求1所述的寡营养硫酸盐还原菌用于河道底泥重金属污染修复的工艺，其特征在于，将权利要求1所述的寡营养硫酸盐还原菌的菌种，采用如权利要求3所述的方法进行放大培养后，接种至活性炭填料上，接种量为每立方米体积2-3L，培养时间3d，之后将填料组装成为填料球，并配重沉至河道底泥表面，即可开展底泥重金属污染修复。

百度查询： 有研工程技术研究院有限公司 一株寡营养硫酸盐还原菌及其用于河道底泥重金属污染修复的工艺

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