申请/专利权人：成都世联康健生物科技有限公司

申请日：2020-03-12

公开（公告）日：2021-02-23

公开（公告）号：CN111388504B

主分类号：C12N5/10(20060101)

分类号：C12N5/10(20060101);A61K35/36(20150101);A61K9/06(20060101);A61K47/42(20170101);A61P1/02(20060101);A61L27/38(20060101);A61L27/24(20060101);A61L27/52(20060101);A61L27/54(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.23#授权;2020.08.04#实质审查的生效;2020.07.10#公开

摘要：本发明公开了一种牙上皮细胞外泌体制备，包括以下步骤:1工程化牙上皮细胞系的处理；2工程化牙上皮细胞系上清液的获取；3工程化牙上皮细胞系提取液的获取；4工程化牙上皮细胞外泌体的获取。本发明还公开了一种胶原凝胶复合工程化牙上皮细胞外泌体植入物的制备方法。本发明还公开了一种工程化牙上皮细胞外泌体在体内促进牙周和牙髓再生中的应用。利用永生化的赫特维希上皮细胞系HERS‑H1长期稳定的扩增并且规模化制备牙上皮来源的外泌体。且由于外泌体不含有主要组织相容性复合体，避免了以干细胞为基础的再生中面临的免疫排斥问题，且外泌体易于储存与运输。

主权项：1.一种牙上皮细胞外泌体制备方法，其特征在于，包括以下步骤:（1）工程化牙上皮细胞系的处理：1.1、取液氮保存的工程化牙上皮细胞系HERS-H1，用40-50℃温水复苏，接种于10cm培养皿中；1.2、加入含有2%胎牛血清的上皮细胞培养基，存放于35-38℃，4-5%CO2的培养箱，24-26小时后换液，待细胞融合至80-95%用胰蛋白酶消化传代；1.3、待扩增出105-108个细胞后，进行工程化牙上皮细胞系提取液的提取；（2）工程化牙上皮细胞系上清液的获取：2.1、转移步骤1.3中获取的工程化牙上皮细胞系至T75培养瓶中；2.2、加入含2%胎牛血清的上皮细胞培养基，存放于35-38℃，4-5%CO2的培养箱中；2.3、当细胞密度达到60%-75%时，吸弃培养基，用PBS清洗培养瓶底部2-3次，加入含有2%无外泌体血清的上皮细胞培养基，存放于35-38℃，4-5%CO2的培养箱中；2.4、连续培养两天后收集上清液，收集到的上清液以1900-2100g的转速,离心28-32min，去除死细胞和细胞碎片，弃沉淀；（3）工程化牙上皮细胞系提取液的获取：取离心后的上清液放于100KD膜的离心过滤器中，以3-5℃的温度，4500-5200g的转速离心28-32min，进行两次离心，获得的膜上清液即为工程化牙上皮细胞系提取液，提取液于-80℃的环境中进行保存；（4）工程化牙上皮细胞外泌体的获取：加入外泌体提取试剂至步骤（3）获得的工程化牙上皮细胞系提取液中，牙上皮细胞系提取液和外泌体提取试剂用量比例为1.8-2.2：1，在3-5℃下保存12-18小时，以3-5℃的温度、8000-12000g的转速离心50-70min，取沉淀，即得工程化牙上皮细胞外泌体；其中外泌体提取试剂为TotalExosomeIsolationTMreagent、ExoQuick-TC或exoEasyMaxiKit。

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权利要求：

百度查询： 成都世联康健生物科技有限公司 牙上皮细胞外泌体制备、外泌体植入物的制备及其应用

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