申请/专利权人：有研工程技术研究院有限公司

申请日：2017-12-28

公开（公告）日：2021-02-26

公开（公告）号：CN109971665B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);C02F3/28(20060101);C02F3/34(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.26#授权;2019.07.30#实质审查的生效;2019.07.16#专利申请权的转移;2019.07.05#公开

摘要：本发明提供了一株寡营养反硝化菌株，分类命名为：DenitrobacilluslicheniformisEM1保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月10日，保藏编号为：CCTCCNo.M2017678。该菌可在低碳源浓度下存活，并可高效地实现反硝化过程，从而低成本实现城镇污水处理厂提标改造。

主权项：1.一株寡营养反硝化菌，其特征在于，分类命名为：DenitrobacilluslicheniformisEM1，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期：2017年11月10日，保藏编号为：CCTCCNo.M2017678。

全文数据：一株寡营养反硝化菌及其用于污水处理厂低COD浓度污水脱氮的工艺技术领域本发明属于应用微生物学科领域，涉及一株寡营养反硝化菌及其用于污水处理厂提标改造的工艺。背景技术随着我国城市化进程及工业的加速发展，环保问题，特别是城市污水处理已成为各国研究的热点。然而随着大量的生活与工业污水流入江河、湖泊或地下水中，给水体造成严重污染，对渔业用水、生活用水等产生影响。城市污水污染已成为制约国家发展的重要因素之一，因此国家对污水处理厂的排放标准也愈发严格。越来越多的城市污水处理厂为响应国家节能减排号召，排放标准由原来的《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002中的一级B标准提升为一级A或者更高标准。为达到更高的排放标准，许多水厂由于设计原因，原有的处理单元已无法满足现有要求，所以对污水处理厂的提标改造也不得不提上日程。《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002一级B标准出水处理至一级A标准出水，进一步脱氮处理是关键技术难题。由于深度脱氮需要反硝化过程，而反硝化菌是异养微生物，在较低碳源浓度下，反硝化菌往往难于生长，并使得深度脱氮反硝化受限。因而常规深度脱氮处理往往需要加入碳源，造成额外的投入，处理成本较高。发明内容为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一株寡营养反硝化菌，该菌可在低碳源浓度下存活，并可高效地实现反硝化过程。本发明的第二个目的在于提供放大培养上述寡营养反硝化菌的培养基。本发明的第三个目的在于提供上述寡营养反硝化菌的方法培养方法。本发明的第四个目的是提供一种用于污水处理厂低COD浓度污水脱氮的工艺，采用该菌种和该工艺处理《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002中的一级B标准出水，可在无外加碳源情况下，高效实现反硝化过程，出水总氮达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002中的一级A标准，从而实现现有污水处理厂低成本提标改造的目标。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供一株寡营养反硝化菌，该菌的分类命名为：DenitrobacilluslicheniformisEM1，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期：2017年11月10日，保藏编号为：CCTCCNo.M2017678。该寡营养反硝化菌DenitrobacilluslicheniformisEM1菌落特征为：在固体培养基上30℃生长较快，3天后菌落直径为0.5mm，菌落呈不规则形，质地致密。本发明另提供一种用于放大培养上述的寡营养反硝化菌的培养基，该培养基配方为：氯化铵0.1gL，硫酸钠0.1gL，硫酸锌0.01gL，七水硫酸镁0.01gL，磷酸二氢钾0.01gL，氯化钙0.01gL，蛋白胨0.001gL，酵母提取物0.001gL，丝氨酸0.001gL，亮氨酸0.001gL，pH7.0～7.5。配好后高压灭菌锅中121℃灭菌20min，然后冷却备用。本发明还提供一种上述寡营养反硝化菌的放大培养方法，将所述寡营养反硝化菌接种入上述述的培养基中，在温度30～35℃条件下，静置培养至菌浓度达到108个mL。本发明还提供一种用于污水处理厂低COD浓度污水脱氮的工艺，用于城镇污水处理厂的提标改造，包括以下步骤：1将污水处理厂一级B标准排放污水调整pH至7.0；2在生物反应器内投放悬浮微生物填料，接种使用权利要求3的放大培养方法培养的所述寡营养反硝化菌，菌浓度108个mL，接种体积为生物反应器体积的1％，并将污水处理厂一级B标准排放污水通入生物反应器；3生物反应器以厌氧运行，运行温度为5-40℃，水力停留4-8小时后，生物反应器出水，得到净化水体。优选地，生物反应器内敷设微生物填料厚度≥10cm；寡营养反硝化菌添加量相对于填料堆积体积不小于2×1011-4×1011CFUM3。本发明所用提取细菌的样品来自于北京高碑店污水处理厂，经筛选分离后，得到一株可在寡营养情况下生长的反硝化菌株，编号为EM1菌株。经过形态学鉴定、菌株的16SrDNA序列鉴定，将其鉴定命名为DenitrobacilluslicheniformisEM1菌株，该菌株具有较好的反硝化能力。由于一级B标准出水中碳源浓度低，一般异氧反硝化菌难于生长，使得进一步地反硝化作用难以进行。而本发明提供的寡营养反硝化菌可以在低碳源浓度条件下正常生长，为一级B标准出水的深度脱氮创造了条件。本发明的优点在于：1.在低碳源浓度下，无需额外投加碳源即可实现污水反硝化处理，运营流程短，维护方便。2.水力停留时间较短，最短为3h，可大大节约运行成本。本发明的有益效果在于：本发明提供一种寡营养反硝化菌及使用该菌的城镇污水处理厂提标改造的工艺，本发明提供的工艺可以比常规工艺成本降低30-50％。附图说明图1为本发明所提供菌种扫描电镜图。具体实施方式本发明的工艺包括寡营养反硝化菌株的富集分离、筛选纯化、反硝化能力检测以及鉴定，具体说明如下：本发明所用的寡营养反硝化菌株为Denitrobacilluslicheniformis，命名为EM1，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期：2017年11月10日，保藏编号为：CCTCCNo.M2017678。实施例1寡营养反硝化菌的富集分离及纯化1培养基固体培养基：氯化铵0.1gL，硫酸钠0.1gL，硫酸锌0.01gL，七水硫酸镁0.01gL，磷酸二氢钾0.01gL，氯化钙0.01gL，蛋白胨0.001gL，酵母提取物0.001gL，丝氨酸0.001gL，亮氨酸0.001gL，结冷胶20g，pH7.4～7.6。上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，然后倒平板，冷却备用。固体培养基用于寡营养反硝化菌的分离。液体培养基：氯化铵0.1gL，硫酸钠0.1gL，硫酸锌0.01gL，七水硫酸镁0.01gL，磷酸二氢钾0.01gL，氯化钙0.01gL，蛋白胨0.001gL，酵母提取物0.001gL，丝氨酸0.001gL，亮氨酸0.001gL，pH7.0～7.5。上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min冷却备用。液体培养基用于寡营养反硝化菌的富集及放大培养。2样品采集及准备本试验所用分离细菌的样品来自于北京高碑店污水处理厂剩余污泥，取1kg剩余污泥装入无菌封口袋种，在24h内通过冷链运输将样品带回实验室并放置于4℃冰箱保存备用。3寡营养反硝化菌的富集培养准确称量20g的污泥样品放入装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶，用磁力搅拌器以300rmin的转速搅拌40min，静置分层。取上清液观察，菌量较少。取20mL上清液于装有200mL上述液体培养基的250mL锥形瓶中，封好瓶口在35℃培养箱静置富集培养2d，取出锥形瓶，取上清液分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，六个梯度的稀释。将灭过菌的固体培养基倒入平皿，厚度大概占平皿的三分之一。待结冷胶冷却后，分别向对应的培养皿中加入各稀释梯度的菌悬液20μL，用涂布棒涂布均匀。待菌液渗透几分钟后，在平皿内再导入一定量冷却的固体培养基，使培养基占整个平板的三分之二，菌液夹在两层培养基之间，造成厌氧的环境。每个浓度重复三次，将制好的平板放在35℃培养箱中，静置培养3～4天，每天观察平板菌落的变化。4寡营养反硝化菌株的纯化观察固体平板上菌落的变化，用接菌环挑取单个颜色变黑的菌落到装有10ml液体培养基的试管中，在35℃条件下静置培养三天得到单个的纯菌。实施例2菌种的鉴定观察固体培养基平板上的菌落形态，并用光学显微镜观察菌株的形态，然后再用PCR扩增菌株的16SrDNA序列并进行测序分析分析，将测序获得的16S序列到NCBI公共数据库https:blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome进行比对，比对结果为Denitrobacilluslicheniformis。实施例3步骤一：取高碑店污水处理厂一级B标准排放污水，调pH至7.0。步骤二：在生物反应器内投放悬浮微生物填料，生物反应器内敷设微生物填料厚度≥10cm；接种使用上述培养基培养的所述寡营养反硝化菌，菌浓度108个mL，BiometekEM1添加量相对于填料堆积体积不小于2×1011-4×1011CFUM3。步骤三：生物反应器以厌氧运行，运行温度为30℃，水力停留6小时；生物反应器出水，得到净化水体。对进水以及处理后出水进行检测，检测结果见表1。表1单位mgLCOD总氮氨氮总磷SS原水6022151.220出水471040.48排放限值a501550.510a《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002中的一级A标准实施例4步骤一：取延庆污水处理厂一级B标出水，调pH至7.0。步骤二：在生物反应器内投放悬浮微生物填料，生物反应器内敷设微生物填料厚度≥10cm；接种使用上述培养基培养的所述寡营养反硝化菌，菌浓度108个mL，EM1添加量相对于填料堆积体积不小于2×1011-4×1011CFUM3。步骤三：生物反应器以厌氧运行，运行温度为30℃，水力停留6小时；生物反应器出水，得到净化水体。对进水以及处理后出水进行检测，检测结果见表2。表2单位mgLCOD总氮氨氮总磷SS原水2018140.510出水15830.38排放限值a501550.510a《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002中的一级A标准从上述实施例可以看出，本发明提供的寡营养反硝化菌可以进一步降低低碳浓度污水中的COD、总氮、氨氮、总磷等指标，使得污水处理厂的排放水质由B级提升为A级，而无需额外投入碳源，为污水处理厂的提标改造降低了改造难度和成本。

权利要求：1.一株寡营养反硝化菌，其特征在于，分类命名为：DenitrobacilluslicheniformisEM1，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期：2017年11月10日，保藏编号为：CCTCCNo.M2017678。2.一种用于放大培养如权利要求1所述的寡营养反硝化菌的培养基，其特征在于，该培养基配方为：氯化铵0.1gL，硫酸钠0.1gL，硫酸锌0.01gL，七水硫酸镁0.01gL，磷酸二氢钾0.01gL，氯化钙0.01gL，蛋白胨0.001gL，酵母提取物0.001gL，丝氨酸0.001gL，亮氨酸0.001gL，pH7.0～7.5。3.如权利要求1所述的寡营养反硝化菌的放大培养方法：其特征在于，将所述寡营养反硝化菌接种入如权利要求2所述的培养基中，在温度30～35℃条件下，静置培养至菌浓度达到108个mL。4.一种用于污水处理厂低COD浓度污水脱氮的工艺，其特征在于，包括以下步骤：1将污水处理厂一级B标准排放污水调整pH至7.0；2在生物反应器内投放悬浮微生物填料，接种使用权利要求3的放大培养方法培养的所述寡营养反硝化菌，菌浓度108个mL，接种体积为生物反应器体积的1％，并将污水处理厂一级B标准排放污水通入生物反应器；3生物反应器以厌氧运行，运行温度为5-40℃，水力停留4-8小时后，生物反应器出水，得到净化水体。5.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，步骤1中调整pH使用盐酸或氢氧化钠。6.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，生物反应器内敷设微生物填料厚度≥10cm；寡营养反硝化菌添加量相对于填料堆积体积不小于2×1011-4×1011CFUM3。

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