申请/专利权人：山东阜丰发酵有限公司

申请日：2017-05-19

公开（公告）日：2021-03-05

公开（公告）号：CN106978450B

主分类号：C12P7/46(20060101)

分类号：C12P7/46(20060101);C12R1/69(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.03.05#授权;2017.11.10#专利申请权、专利权的转移;2017.08.18#实质审查的生效;2017.07.25#公开

摘要：本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种利用糖蜜发酵生产L‑苹果酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）糖蜜预处理，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵产酸。本发明对糖蜜处理工艺简单，避免使用酸处理以及氰化处理，节约了成本，并且减少了培养基中无机矿物质的添加量。

主权项：1.一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1）糖蜜预处理：往糖蜜中添加两倍质量的纯化水，1000rpm搅拌3min，然后添加占糖蜜质量2%的活性炭，200rpm搅拌30min，过滤，收集滤液；步骤3）发酵产酸：按照米曲霉种子液∶发酵培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，再添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵，继续发酵36h，然后控制温度为39-40℃，压强为2-3个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.2；并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；所述碳酸钙的添加量为70-90gL；所述十六烷基三甲基溴化铵的添加量为30-40mgL；所述米曲霉种子液的浓度为1×109CFUmL；所述米曲霉为米曲霉AspergillusoryzaeACCC30584。

全文数据：一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法[0001]技术领域本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法。背景技术[0002]糖蜜含有少量粗蛋白质，一般为3%_6%，多属于非蛋白氮类，如氨、酰胺及硝酸盐等，而氨基酸态氮仅占38%_50%，且非必需氨基酸如天门冬氨酸、谷氨酸含量较多，因此蛋白质生物学价值较低，但天门冬氨酸和谷氨酸均为呈味氨基酸，故用于动物饲料中可大大刺激动物食欲。糖蜜的主要成分为糖类，甘蔗糖蜜含蔗糖约24%-36%，其他糖约12%-24%;甜菜糖蜜所含糖类几乎全为蔗糖，约47%之多。此外还含有3%-4%的可溶性胶体，主要为木糖胶、阿拉伯糖胶和果胶等。糖蜜的矿物质含量较高，约8%_10%，但钙、磷含量不高，甘蔗糖蜜又高于甜菜糖蜜。矿物元素中钾、氯、钠、镁含量高，因此糖蜜具有轻泻性。一般糖蜜维生素含量低，但甘蔗糖蜜中泛酸含量较高，达37mgkg，此外生物素含量也很可观。将提纯的甘蔗汁或甜菜汁蒸浓至带有晶体的糖膏，用离心机分出结晶糖后所余的母液，叫“蜜糖”。这种第一糖蜜中还含有多量蔗糖，可重复上法而得是第二、第三糖蜜等。最后得到一种母液，无法再蒸浓结晶，称废糖蜜wastemolasses。一般单称糖蜜指的就是废糖蜜，可用作食物或饲料，也可用于发酵工业的原料。但是糖蜜中存在一定量的铜铁锌等金属离子，会影响黄曲霉的发酵，“蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的研究，安徽农业科学”对糖蜜进行了处理，降低了金属离子的含量。[0003]L-苹果酸的生产最初是在培养黄曲霉时有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。后来，由糖类物质发酵来生产L-苹果酸，但是传统的发酵法生产L-苹果酸培养时间长、培养基成本高、能耗大、产酸率低，糖的利用率不高，很难实现工业化生产。随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术L-苹果酸也有了长足的进步。中国专利技术“CN2012101350639”公开了一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，该方法使用了甘蔗糖蜜作为发酵培养基原料，节省了培养基成本，但是产酸量达不到规模化生产的需求。申请人之前的专利技术“一种制备L-苹果酸的方法”采用米曲霉发酵来制备苹果酸，其取得了较好的苹果酸产率，本发明在该专利技术的基础上对发酵培养进行了改进，旨在于进一步提高苹果酸的产率。发明内容[0004]针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法。[0005]本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，其包括如下步骤:步骤1糖蜜预处理，步骤2制备发酵培养基，步骤3发酵产酸。[0006]进一步地，所述方法包括如下步骤：步骤1糖蜜预处理:往糖蜜中添加两倍质量的纯化水，IOOOrpm搅拌3min，然后添加占糖蜜质量2%的活性炭，200rpm搅拌30min，过滤，收集滤液；步骤2制备发酵培养基：按照IL培养基计，将70g碳酸钙、20g葡萄糖、IOg玉米浆、8g尿素、〇.Ig硫酸镁、〇.Ig磷酸二氢钾以及〇.Ig磷酸氢二钾依次添加到步骤1所得滤液中，定容IL，控制pH值6.2;步骤3发酵产酸:按照米曲霉种子液:发酵培养基为1:10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33°C，培养48h，然后添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵，继续发酵36h，然后控制温度为39-40°C，压强为2-3个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.2;并通过流加浓度为200gL的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0%;优选地，所述碳酸钙的添加量为70-90gL。[0007]优选地，所述十六烷基三甲基溴化铵的添加量为30-40mgL。[0008]优选地，所述米曲霉种子液的浓度为IX109CFUmL。[0009]优选地，所述米曲霉为米曲霉AspergillusoryzaeACCC30584。[0010]优选地，所述糖蜜为甘蔗糖蜜。[0011]本发明的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：本发明对糖蜜处理工艺简单，避免使用酸处理以及氰化处理，节约了成本，并且减少了培养基中无机矿物质的添加量;本发明对现有菌株进行通透化处理，提高了苹果酸的产率；本发明通过适当提高培养温度，可增加分子扩散的速度;增加压力对细胞的挤压作用增强，细胞表面发生轻微变形，细胞膜的通透性增加;培养过程后期加入合适剂量的CTAB，干扰细胞壁的合成，改善菌体细胞壁和细胞膜对催化反应中底物和产物的传质限制，同时调整合适的浓度，避免终浓度过低，达不到透性化改造的目的，终浓度过高则可能导致细胞死亡或生长停滞;本发明通过添加CTAB结合温度压强的改变，实现菌株培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为提高L-苹果酸产量提供了一个简便方法;本发明发酵工艺中添加碳酸钙来维持碳酸钙的浓度，提高了米曲霉的发酵效率。具体实施方式[0012]为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。[0013]实施例1一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，其包括如下步骤：糖蜜预处理:往甘蔗糖蜜中添加两倍质量的纯化水，IOOOrpm搅拌3min，然后添加占糖蜜质量2%的活性炭，200rpm搅拌30min，过滤，收集滤液；制备发酵培养基:按照IL培养基计，将70g碳酸H20g葡萄糖、IOg玉米衆、8g尿素、0.Ig硫酸镁、〇.Ig磷酸二氢钾以及〇.Ig磷酸氢二钾依次添加到步骤1所得滤液中，定容1L，控制PH值6.2;发酵产酸:按照米曲霉种子液:发酵培养基为1:10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33°C，培养48h，然后添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵CTAB，碳酸钙的添加量为70gUCTAB的添加量为30mgL，继续发酵36h，然后控制温度为39°C，压强为3个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液;发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.2;并通过流加浓度为200gL的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0%;米曲霉种子液的浓度为IX109CFUmL;所述米曲霉为米曲霉AspergillusoryzaeACCC30584。[0014]实施例2一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，其包括如下步骤：糖蜜预处理:往甘蔗糖蜜中添加两倍质量的纯化水，IOOOrpm搅拌3min，然后添加占糖蜜质量2%的活性炭，200rpm搅拌30min，过滤，收集滤液；制备发酵培养基:按照IL培养基计，将70g碳酸H20g葡萄糖、IOg玉米衆、8g尿素、0.Ig硫酸镁、〇.Ig磷酸二氢钾以及〇.Ig磷酸氢二钾依次添加到步骤1所得滤液中，定容1L，控制PH值6.2;发酵产酸：按照米曲霉种子液:发酵培养基为1:10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33°C，培养48h，然后添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，碳酸钙的添加量为90gL，CTAB的添加量为40mgL，继续发酵36h，然后控制温度为40°C，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液;发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.2;并通过流加浓度为200gL的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0%;米曲霉种子液的浓度为IX109CFUmL;所述米曲霉为米曲霉AspergillusoryzaeACCC30584。[0015]实施例3各因素对米曲霉发酵苹果酸产量的影响：L-苹果酸的测定:采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液1.0mL，加入6.0mL分析纯的浓硫酸，再加入0.1mL2,7—萘二酚溶液，接着在100°C水浴中加热20min，取出待冷却至室温后，于385nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385nm处吸收值即0D385为纵坐标，通过未知样品在385nm处的OD值，则可在标准曲线上查得相应的苹果酸含量。[0016]设置对照组，其中，对照组1:不提高温度和压强，其余同实施例1;对照组2:不添加CTAB，其余同实施例1;试验组为实施例1。各组别发酵液中苹果酸的产量见表1:表1实施例4一、CTAB梯度试验：以实施例1为例，检测了CTAB浓度对产酸量的影响，具体见表2:表2二、压强梯度试验:针对发酵后期12小时内，选择1-5大气压进行测试，其余实验流程同实施例2,具体发酵结果见表3:表3三、温度梯度试验:针对发酵后期12小时内，选择33-43Γ进行测试，其余实验流程同实施例1，具体发酵结果见表4:表4结论:适当提高温度和压强可以增加米曲霉细胞壁的透过性，从而提高苹果酸产量，但是压强或温度过高时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致苹果酸量下降。[0017]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种利用糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，其包括如下步骤:步骤1糖蜜预处理，步骤2制备发酵培养基，步骤3发酵产酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1糖蜜预处理:往糖蜜中添加两倍质量的纯化水，IOOOrpm搅拌3min，然后添加占糖蜜质量2%的活性炭，200rpm搅拌30min，过滤，收集滤液；步骤3发酵产酸：按照米曲霉种子液:发酵培养基为1:10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33°C，培养48h，再添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵，继续发酵36h，然后控制温度为39-40°C，压强为2-3个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到L-苹果酸发酵液;发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.2;并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0%；根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，碳酸钙的添加量为70-90gL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述十六烷基三甲基溴化铵的添加量为30-40mgL〇4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述米曲霉种子液的浓度为IX109CFUmL。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述米曲霉为米曲霉（AspergillusoryzaeACCC30584〇6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖蜜为甘蔗糖蜜。

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