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【发明授权】一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性方法_宁波市农业科学研究院_201610837480.6 

申请/专利权人:宁波市农业科学研究院

申请日:2016-09-09

公开(公告)日:2021-03-12

公开(公告)号:CN107805672B

主分类号:C12Q1/6895(20180101)

分类号:C12Q1/6895(20180101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.03.12#授权;2018.04.10#实质审查的生效;2018.03.16#公开

摘要:本发明题为《一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性方法》,属于生物领域。鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。印中杂交南瓜砧木品种繁多外观相似,利用形态指标甄别真伪,耗时长可靠性差,为此,发明一种利用分子标记鉴定品种真实性的方法成为当务之急。技术方案为利用5对SSR引物SEQIDNO.1‑SEQIDNO.10对三个砧木品种及对照材料进行PCR扩增,产生的9个差异位点经过“1”和“0”赋值,构建品种指纹图谱用以真实性鉴定。发明以更灵敏的鉴定手段、更低的时间人工成本,对印中杂交南瓜砧木品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’进行更准确更有效的鉴定与保护。

主权项:1.一种鉴定印度南瓜×中国南瓜杂交种砧木品种真实性的方法,所述砧木品种包括:‘甬砧7号’、‘甬砧8号’,包括以下步骤:1取样:播种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’及其对照材料,待植株长至5-6片真叶时,采集嫩叶1g,-80℃保存;2DNA提取:参照CTAB法提取新鲜叶片总基因组DNA;3利用5对SSR引物进行PCR扩增:混样体系为15μl,包括1.5μl1.25mMdNTP,1.5μl10×buffer,1.5μl25mMMgCl2,2.0μl5mM引物,5μl10ngulDNA,0.05μl1UTaq,3.45μl超纯水;其中,2.0μl5mM引物为SSR引物对中两条引物分别添加1.0μl;PCR扩增程序为:预变性94℃1min;变性93℃1min,退火40℃1min,延伸72℃2min,40个循环;延伸72℃1min;4PCR产物检测:使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖,DNA片段分离范围40-1Kbp;添加20μlEB显色,在PCR产物中加入2μlLoadingDye,电泳2-3小时,电压200-250v;电泳结束后,利用凝胶成像系统观察结果;5数据收集与分析:对5对SSR引物N1112、N4142、N5152、N121122和N155156在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、及对照材料‘明秀’和‘金甲田’的扩增结果进行赋值,某等位基因扩增出条带的记为“1”,同一位点无扩增条带的记为“0”,将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串,即构成下表所示的品种指纹图谱: 所述5对SSR引物包括:N1112、N4142、N5152、N121122、N155156,N1112的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示,N4142的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示,N5152的序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示,N121122的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示,N155156的序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。

全文数据:一种鉴定印度南瓜X中国南瓜杂交种砧木品种真实性方法一、技术领域[0001]本发明属于生物领域,特别涉及甬砧系列印度南瓜X中国南瓜杂交种砧木品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’真实性的一种鉴定方法。二、背景技术[0002]西瓜枯萎病引发连作障碍,在瓜类种植区普遍发生,是瓜类生产的重大难题。据统计,每年西瓜枯萎病的发病率可达10-30%,严重地块甚至绝产,造成巨大经济损失。目前,由于土地资源限制和枯萎病病原菌的顽固性,轮作和化学防治效果不佳,且存在环境污染和食品安全等问题,因此,嫁接是西瓜生产中用以克服连作障碍和枯萎病的有效手段。[0003]南瓜是人类最早栽培的古老作物之一,它种类繁多,变异丰富,不仅是人类餐桌上的保健彩色蔬菜,也是瓜类生产克服连作障碍的重要砧木资源。生产上常见的南瓜种主要包括中国南瓜(Cucurbitamoschata、印度南瓜(Cucurbitamaxima和美洲南瓜Cucurbitapepo等种类。这些南瓜种起源不同,生态适应性也不同。印度南瓜起源于美洲秘鲁南部、玻利维亚和阿根廷北部的干燥地带,高温条件下,病毒病和白粉病发病严重。中国南瓜起源于墨西哥和中南美洲,在中国栽培历史悠久,普遍表现耐热、耐贫瘠、抗病,适应性广。通过种间远缘杂交,能够聚合不同亲本的优点,形成新的表型变异,为砧木育种提供丰富的种质资源。‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’是宁波市农业科学研究院重点针对西瓜嫁接栽培,自主育成的一系列印度南瓜X中国南瓜杂交种砧木品种。该系列兼具中国南瓜的抗性和印度南瓜的嫁接亲和性,对西瓜品质无不良影响,深受瓜农欢迎。[0004]随着甬砧系列印中杂交南瓜砧木品种的推广,鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。然而,目前砧木品种的鉴定多运用植株形态学鉴定等常规方法。这些方法耗时长、易受环境影响、可靠性差,面对品种繁多、外观表型相似的印中杂交南瓜砧木材料,鉴定真伪难以奏效。[0005]砧木新品种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’至今只作了大田形态学纯度鉴定,尚缺乏便捷有效的品种真实性鉴定方法,对于品种保护还远远不够。三、发明内容[0006]针对上述问题,本发明提供了一种利用DNA指纹图谱鉴定甬砧系列印中杂交南瓜石占木品种‘甬站7号’、‘甬站8号’和‘甬站10号’品种真实性的方法。[0007]为实现本发明的目的,发明者提供以下技术方案:采用CTAB法提取‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’及其对照品种的幼叶DNA;利用5对SSR引物进行PCR扩增(引物名称与序列表中序列号的对应关系如表1所不,引物具体序列见本说明书最后所附序列表);扩增产物经高分辨率琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。有差异的等位位点,扩增出条带的记为“1”,同一位置无带记为“0”;将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串,即构成DNA指纹图谱,用以区分3份印中杂交南瓜砧木品种及其对照。[0008]本发明的优点:与常规形态鉴定比较,本发明的鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单,可以同时鉴定多个品种,方便快捷。四、附图说明[0009]图1为本发明实施例中,SSR引物N1112、N4142、N5152、N121122*N155156‘_砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’中的扩增。[0010]图1中左侧三幅图片自上而下分别是331?引物价112、财142和阳152在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’中的扩增;右侧两幅图片自上而下分别是SSR引物N121122和N155156在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’中的扩增。两组图片样品排列顺序自左至右依次为DNAMarker、‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’、5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’。图片左侧标注是DNAmarker标准分子量,右侧标注是引物名称及差异位点所在片段大小。五、具体实施方式[0011]1、取样:播种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’及其对照,待植株长至5-6片真叶时,采集嫩叶Ig,-80°C保存。[0012]2、DNA提取:参照CTAB法(见:MurrayHG,ThompsonWF·RapidisolationofhigherweightDNA.NucleicAcidsRes,1980,8:4321,提取新鲜叶片总基因组DNA。[0013]3、PCR扩增:混样体系为15μ1FazioG,StaubJE,StevensMR.GeneticmappingandQTLanalysisofhorticulturaltraitsincucumberCucumissativusL.usingrecombinantinbredlines.TheorApplGenet,2003,107:864-874,包括1·5μ1dNTP1.25mM,1.5ul10Xbuffer,1.5ulMgCl225mM,2.0ul引物(5mM;SSR两条引物分别添加l.Oul,5ulDNA10ngul,0.05ulTaqIU,3.45ul超纯水。PCR扩增程序为:预变性94°Clmin;变性93°Clmin,退火40°Clmin,延伸72°C2min40个循环);延伸72°Clmin。[0014]4、PCR产物检测:使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖(DNA片段分离范围40-IKbp。添加20μ1EBethidiumbromide,溴化乙徒)显色。在PCR产物中加入2μ1LoadingDye,电泳2-3小时,电压200-250v。电泳结束后,利用凝胶成像系统观察结果。[0015]5、数据收集与分析:对5对SSR引物N1112、N4142、N5152、N121122*N155156在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’的扩增结果进行赋值,某等位基因扩增出条带的记为“1”,同一位点无扩增条带的记为“0”。将这些差异扩增片段转换为由1和〇组成的字符串,即构成品种指纹图谱表1。利用5个分子标记产生的9个多态性位点,构建‘甬砧7号’的指纹图谱为1-1-0-1-1-0-1-0-1、‘甬砧8号’的指纹图谱为0-0-1-0-1-1-0-1-0、‘甬砧10号’的指纹图谱为〇-〇-〇-〇-〇-〇-〇-〇_〇、5558的指纹图谱为1-〇-1-〇-1-1-〇-1-〇、5559的指纹图谱为1-1-1-0-1-1-0-1-0、‘明秀’的指纹图谱为1-1-0-1-1-0-1-1-0和‘金甲田’的指纹图谱为0-1-0-1-1-0-1-0-1。这些指纹图谱不仅可以有效区分上述三个品种,还可以将它们从形态易混淆的相似品种中甄别出来,起到品种鉴定与保护的作用。[0016]表1供试印中杂交南瓜砧木品种及对照材料的名称和SSR指纹图谱[0017]

权利要求:1.一种鉴定印度南瓜X中国南瓜杂交种砧木品种真实性的方法,包括以下步骤:⑴取样:播种‘甬砧7号’、‘甬砧8号’和‘甬砧10号’及其对照材料,待植株长至5-6片真叶时,采集嫩叶Ig,-80°C保存;⑵DNA提取:参照CTAB法提取新鲜叶片总基因组DNA;3PCR扩增:混样体系为15μ1,包括1·5μ1dNTP1.25mM,1.5ul10Xbuffer,1.5ulMgCl225mM,2.0ul引物(5mM;SSR两条引物分别添加l.Oul,5ulDNA10ngul,0.05ulTaqIU,3.45ul超纯水。PCR扩增程序为:预变性94°CImin;变性93°CImin,退火40°CImin,延伸72°C2min40个循环);延伸72°Clmin;4?〇?产物检测:使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖0嫩片段分离范围40-110^。添加20μ1EBethidiumbromide,溴化乙锭)显色。在PCR产物中加入2μ1LoadingDye,电泳2-3小时,电压200-250v。电泳结束后,利用凝胶成像系统观察结果;⑸数据收集与分析:对5对SSR引物价112、财142、阳152、价21122和价55156在‘甬砧7号’、‘甬砧8号’、‘甬砧10号’及对照材料5558、5559、‘明秀’和‘金甲田’的扩增结果进行赋值,某等位基因扩增出条带的记为“1”,同一位点无扩增条带的记为“0”。将这些差异扩增片段转换为由1和〇组成的字符串,即构成品种指纹图谱表1。利用7个分子标记产生的15个多态性位点,构建‘甬砧7号’的指纹图谱;其中,所述5对SSR引物中N1112的序列如SEQIDN0.1和SEQID冊.2所示,财142的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示,N5152的序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示,N121122的序列如SEQIDN0.7和SEQIDN0.8所示,N155156的序列如SEQIDN0.9和SEQIDNO.10所示。

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