申请/专利权人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所

申请日：2020-12-18

公开（公告）日：2021-03-26

公开（公告）号：CN112553248A

主分类号：C12N15/84(20060101)

分类号：C12N15/84(20060101);C12N15/82(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.10.21#授权;2021.04.13#实质审查的生效;2021.03.26#公开

摘要：本发明公开了一种老芒麦遗传转化体系的建立方法及遗传转化方法，属于植物生物工程技术领域。所述老芒麦遗传转化体系的建立方法对五种外植体愈伤诱导能力进行测试和统计，确定幼穗诱导的愈伤为最佳转化受体；用基因枪法进行介导转化老芒麦幼穗以及幼穗愈伤，分别挑选老芒麦幼穗诱导25d、35d的胚性愈伤组织作为靶愈伤，轰击前对靶愈伤进行两种方法预处理：高渗处理和滤纸干燥，轰击后的愈伤组织上继代培养基于暗培养条件进行恢复培养。最终确定了以25d的幼穗愈伤为转化受体，滤纸干燥预处理2h的基因枪介导川草2号老芒麦的遗传转化方法。所述方法能够获得再生效率为63％的老芒麦幼苗以及转化效率约40％的老芒麦阳性愈伤。

主权项：1.一种老芒麦遗传转化体系建立的方法，其特征在于所述方法具体如下：1转化受体确定：对成熟种子、根、下胚轴、茎和幼穗五种外植体愈伤诱导能力进行测试和统计，再对五种外植体诱导的愈伤进行分化再生能力测试和筛选，结果表明仅幼穗愈伤能分化再生；最终确定幼穗诱导的愈伤为最佳转化受体；2农杆菌介导转化老芒麦幼穗以及幼穗愈伤：利用4种不同侵染方式和不同载体对老芒麦幼穗以及幼穗愈伤进行农杆菌介导转化，结果未能转化成功，接下来采用基因枪转化法进行介导；3转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：PANIC6A转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行PCR鉴定潮霉素抗性基因，保存阳性菌落并吸取约50μL阳性菌体于50mL含卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养6h，随后提取质粒，放-20℃以备用；4挑选胚性靶愈伤：分别挑选老芒麦幼穗诱导约25d、35d的结构致密，颗粒状且状态较一致的胚性愈伤组织置于两个无菌培养皿中，捏碎，分别混合均匀备用；5轰击前靶愈伤预处理：两种预处理方式：1高渗处理：愈伤放置在高渗培养基上培养6h；2滤纸干燥：愈伤放置在2层无菌滤纸上干燥处理2h，滤纸用之前置于愈伤诱导培养基表面微浸湿，培养皿用Pirifilm膜封口；6轰击前准备工作及轰击：1洗涤浓度为60mgmL微载体金粉；2DNA分子包埋微载体：2.5molLCaCl2和0.1molLC7H22CL3N3做沉淀剂，DNA溶液浓度为1μgμL；3挑选3中预处理后的靶愈伤组织放置在高渗培养基中央直径2.5cm范围内，开始准备轰击；4开始轰击；每次轰击上述包埋后的微载体6μL，轰击压力为1100psi，轰击距离为9cm，每皿材料轰击一次；7对6中所述轰击后的愈伤组织放置在26℃暗培养12h后平移到继代培养基上进行恢复培养，平移过程中保持愈伤与原培养基接触面不变，恢复培养期间连续10d定时定点在体视镜下进行RFP荧光跟踪观测与统计，最终建立了一种以25d的幼穗愈伤为转化受体滤纸干燥预处理2h的基因枪介导老芒麦的遗传转化方法。

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