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【发明授权】一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法_江苏正元堂生物科技有限公司_201810609164.2 

申请/专利权人:江苏正元堂生物科技有限公司

申请日:2018-06-13

公开(公告)日:2021-04-09

公开(公告)号:CN108610391B

主分类号:C07H19/167(20060101)

分类号:C07H19/167(20060101);C07H3/06(20060101);C07H1/08(20060101);C08B37/00(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.04.09#授权;2018.10.30#实质审查的生效;2018.10.02#公开

摘要:本发明公开了一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,属于天然产物有效成分提取领域技术领域。其特征在于,通过连续回流的方法提取桑黄子实体颗粒中的有效成分,通过大孔树脂吸附‑脱附原理将桑黄中多糖和腺苷有效地分离,多糖收率为6.5%以上,纯度可达65%以上,腺苷收率不低于0.04%,纯度不低于92%,本发明操作简单,效率高,易于推广。

主权项:1.一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,其特征在于,包括如下步骤:1将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水,连续回流1.5-3小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时,抽滤;3将步骤2中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得0.3-0.5gml的桑黄溶液;4用氢氧化钠溶液调节步骤3中桑黄溶液的pH值至9-10,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;5将步骤4中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性,并透过可以过滤掉蛋白质大分子的第一超滤膜,收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖;6将步骤4中大孔树脂中吸附的吸附物用乙醇溶液洗脱,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏;7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样,上层析柱,先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱,再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉淀物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出的沉淀与原有的沉淀混合,混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50℃真空干燥,得腺苷成品。

全文数据:一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法技术领域[0001]本发明涉及天然产物有效成分提取领域,尤其涉及一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法。背景技术[0002]在中国,桑黄自古就是一味名贵的中药,中国民间将桑黄作为一种治疗肝病、癌症的神药。近几十年,桑黄的药理作用渐渐得到现代医学的解释,桑黄具有刺激体液免疫调节和细胞免疫调节的活性,身体因而释放出很多的免疫产物。桑黄主要的有效功能成分有桑黄多糖、黄酮、三萜类、酶类物质,还有大量人体有益的氨基酸、微量元素等。日本、韩国是较早研究桑黄抗肿瘤的国家,日本国家癌症研究中心进行大量的研究发现,桑黄对于肿瘤抑制率为96.7%。就肿瘤的免疫代替疗法而言,桑黄的效果在国际上被公认为第一位。[0003]腺苷是桑黄中另一种具有广泛药用价值的有效成分,它具有抗癫痫和强效扩张冠脉的作用,可用于治疗心绞痛、心肌梗塞、冠脉功能不全、动脉硬化等病症,同时还是重要的医药中间体,可合成治疗恶性肿瘤药物8-氯腺苷等。[0004]桑黄子实体质地较硬,成份复杂,致使多糖分离纯化较为困难,传统的样品前处理方法一般采用高温水煮、超声的方法,而高温水煮耗时长、有效成分挥发严重、效率低,超声波过强时会破坏多糖等的结构。另外,现有桑黄多糖提取方法只能单纯的提取多糖,而忽略了桑黄中其他有药用价值的活性物质,无疑造成了资源的浪费。发明内容[0005]本发明提供一种原料利用率高、操作简单、成本低、产物获得率高的一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法。本发明的技术方案如下:[0006]1将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;[0007]2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水,连续回流1.5-3小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时,抽滤;[0008]3将步骤⑵中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得0.3-0.5gml的桑黄溶液;[0009]4用氢氧化钠溶液调节步骤⑶中桑黄溶液的pH值至9-10,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;[0010]5将步骤⑷中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性,并透过可以过滤掉蛋白质等大分子的第一超滤膜,收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖;[0011]⑹将步骤4中大孔树脂中吸附的吸附物用乙醇溶液洗脱,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏;[0012]7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样,上层析柱,先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱,再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉淀物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出的沉淀与原有的沉淀混合,混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50°C真空干燥,得腺苷成品。[0013]通过采用上述技术方案,本发明达到的有益效果如下:[0014]1桑黄子实体样品前处理采用两次连续回流的方式,药物提取效率高,有效地节省了原料,最大限度的提高了桑黄子实体的利用率。[0015]2本发明采用大孔树脂吸附-脱附的方法在提纯多糖的同时,还有效的分离了腺苷,不仅分离效率高、杂质少,同时免去了静置沉淀、浓缩等耗时的工序,节约了成本。[0016]3多糖精制采用超滤膜过滤,有效地控制了多糖分子量范围,提高了多糖的纯度。附图说明[0017]图1是本发明的流程示意图。具体实施方式[0018]—种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,其特征在于,包括如下步骤:[0019]1将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;[0020]2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水,连续回流1.5-3小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时,抽滤;[0021]3将步骤⑵中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得0.3-0.5gml的桑黄溶液;[0022]⑷用氢氧化钠溶液调节步骤⑶中桑黄溶液的pH值至9-10,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;[0023]5将步骤4中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性,并透过可以过滤掉蛋白质等大分子的第一超滤膜,收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖;[0024]6将步骤⑷中大孔树脂中吸附的腺苷吸附物用乙醇溶液洗脱,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏;[0025]7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样,上层析柱,先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱,再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉淀物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出的沉淀与原有的沉淀混合,混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50°C真空干燥,得腺苷成品。[0026]本发明步骤⑴中所述桑黄子实体颗粒尺寸为20-30目。[0027]本发明步骤4中所述大孔树脂采用HPD-D型吸附树脂,流出液的流速为15-40mlmin〇[0028]本发明步骤⑸中所述第一超滤膜为200KDa的超滤膜,第二超滤膜为IOKDa的超滤膜。[0029]本发明步骤⑹中所述乙醇溶液的浓度为15%,乙醇洗脱的量为两个柱体积。[0030]本发明步骤⑺中所述乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂中乙酸乙酯与丙酮的体积比为2:1〇[0031]实施例1[0032]—种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,具体包括如下步骤:[0033]1将3Kg桑黄子实体粉碎成尺寸为20目桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;[0034]2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积7倍量的水,连续回流1.5小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积4倍量的水连续回流3小时,抽滤;[0035]3将步骤2中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得IOL质量浓度为0.3gml的桑黄溶液;[0036]4用lmolL氢氧化钠溶液调节步骤3中桑黄溶液的pH至9左右,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速为20mlmin,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;[0037]5将步骤⑷中的桑黄多糖粗溶液用0.lmolL硫酸溶液调节pH至中性,温度为35°C,压力差为0.02MPa条件下,桑黄多糖粗溶液透过可以过滤掉蛋白质等大分子的200KDa的第一超滤膜,收集滤液并通过IOKDa的第二超滤膜,去除小分子杂质,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖,得率为生药的6.6%,通过苯酚-硫酸法测得多糖纯度为65.8%;[0038]6将步骤⑷中的装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱用15%乙醇洗脱1个柱体积,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏690g;[0039]7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1·2干法拌样,上φIOOmmxIOOmm玻璃层析柱,先用乙酸乙酯洗脱,再以体积比为2:1的乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉底物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出后的沉淀与原沉淀混合,混合沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50°C真空干燥,得腺苷成品,得率为〇.04%,经HPLC检测,腺苷纯度为92.1%。[0040]实施例2[0041]—种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,具体包括如下步骤:[0042]1将3Kg桑黄子实体粉碎成尺寸为25目桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;[0043]2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积8倍量的水,连续回流2小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积5倍量的水连续回流2小时,抽滤;[0044]3将步骤2中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得6L质量浓度为0.5gml的桑黄溶液;[0045]⑷用lmolL氢氧化钠溶液调节步骤⑶中桑黄溶液的pH至10左右,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速为30mlmin,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;[0046]5将步骤⑷中的桑黄多糖粗溶液用0.lmolL硫酸溶液调节pH至中性,温度为35°C,压力差为0.02MPa条件下,桑黄多糖粗溶液透过可以过滤掉蛋白质等大分子的200KDa的第一超滤膜,收集滤液并通过IOKDa的第二超滤膜,去除小分子杂质,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖,得率为生药的6.7%,通过苯酚-硫酸法测得多糖纯度为66.0%;[0047]6将步骤⑷中的装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱用15%乙醇洗脱2个柱体积,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏700g;[0048]7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样,上CplOOmmMOOmm玻璃层析柱,先用乙酸乙酯洗脱,再以体积比为2:1的乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉底物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出后的沉淀与原沉淀混合,混合沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50°C真空干燥,得腺苷成品,得率为〇.04%,经HPLC检测,腺苷纯度为92.4%。[0049]实施例3[0050]—种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,具体包括如下步骤:[0051]1将3Kg桑黄子实体粉碎成尺寸为30目桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;[0052]2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积9倍量的水,连续回流3小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积5倍量的水连续回流2小时,抽滤;[0053]3将步骤2中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得7.5L质量浓度为0.4gml的桑黄溶液;[0054]⑷用lmolL氢氧化钠溶液调节步骤⑶中桑黄溶液的pH至10左右,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速为40mlmin,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;[0055]5将步骤⑷中的桑黄多糖粗溶液用0.lmolL硫酸溶液调节pH至中性,温度为35°C,压力差为0.02MPa条件下,桑黄多糖粗溶液透过可以过滤掉蛋白质等大分子的200KDa的第一超滤膜,收集滤液并通过IOKDa的第二超滤膜,去除小分子杂质,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖,得率为生药的6.5%,通过苯酚-硫酸法测得多糖纯度为65.3%;[0056]6将步骤⑷中的装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱用15%乙醇洗脱2个柱体积,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏698g;[0057]7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样,上cplOOmmxlOOmm玻璃层析柱,先用乙酸乙酯洗脱,再以体积比为2:1的乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉底物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出后的沉淀与原沉淀混合,混合沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50°C真空干燥,得腺苷成品,得率为〇.04%,经HPLC检测,腺苷纯度为92.9%。[0058]所需设备主要包括:[0059]中药材料粉碎机,型号YKF20B,青州市益康中药机械配件厂;[0060]电加热提取罐,型号YP-TQ-50,杭州玉派轻工机械设备有限公司;[0061]HPD树脂由沧州宝恩化工有限公司提供,不锈钢层析柱、玻璃层析柱由江阴金确层析设备有限公司提供;[0062]台式真空干燥箱,型号DZF-6020,镇江市科密仪器仪表有限公司;[0063]超滤膜分离机采用RNF-2500多功能卷式膜中试设备,由厦门福美科技有限公司提供;[0064]HPLC高效液相色谱仪,型号LC2000,上海天美仪器有限公司。[0065]其中,装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱使用完毕后,先用95%的乙醇洗脱至无色,再用大量的水去醇化,以备下次使用。

权利要求:1.一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法,其特征在于,包括如下步骤:1将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后,投入提取罐中;2向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水,连续回流1.5-3小时,抽滤,滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时,抽滤;⑶将步骤⑵中两次抽滤所得滤液混合,浓缩后获得〇.3-0.5gml的桑黄溶液;⑷用氢氧化钠溶液调节步骤⑶中桑黄溶液的pH值至9-10,将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中,控制流出液的流速,所得流出液即为桑黄多糖粗溶液;⑸将步骤⑷中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性,并透过可以过滤掉蛋白质等大分子的第一超滤膜,收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜,所得截留液通过减压真空浓缩的方式,获得桑黄多糖;⑹将步骤4中大孔树脂中吸附的吸附物用乙醇溶液洗脱,所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏;7取步骤6中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样,上层析柱,先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱,再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱,每1500ml收集一个流份,液相检测,将流份中的第24-29流份合并,减压真空浓缩,将出现的沉淀物合并,滤取沉淀,滤液再静置,析晶后滤出,滤出的沉淀与原有的沉淀混合,混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶,得无色针状结晶腺苷,抽滤,于真空干燥器中50°C真空干燥,得腺苷成品。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1中所述桑黄子实体颗粒尺寸为20-30目。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤⑷中所述大孔树脂采用HPD-D型吸附树脂,流出液的流速为15-40mlmin。4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5中所述第一超滤膜为200KDa的超滤膜,第二超滤膜为IOKDa的超滤膜。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤⑹中所述乙醇溶液的浓度为15%,乙醇洗脱的量为两个柱体积。6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(7中所述乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂中乙酸乙酯与丙酮的体积比为2:1。

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