申请/专利权人：华中农业大学

申请日：2018-07-18

公开（公告）日：2021-04-09

公开（公告）号：CN108823209B

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/85(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.09#授权;2018.12.11#实质审查的生效;2018.11.16#公开

摘要：本申请属于基因工程应用和生物技术领域。本发明提供了一种改造的骨骼肌特异性启动子2eMCK‑pMCK‑T208，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。将其与目的基因相连后，通过腹腔注射发现在心肌中经2eMCK‑pMCK‑T208启动表达的目的蛋白表达量比2eMCK‑pMCK低，表现为差异显著，而在骨骼肌中经2eMCK‑pMCK‑T208启动表达的目的蛋白表达量与2eMCK‑pMCK启动的相比，其差异不显著。本发明所公开的启动子能使外源基因在骨骼肌中高效特异性表达，不但可以提高猪肌肉品质，还可以降低因启动子特异性不高而带来的潜在危害。

主权项：1.一种人工合成的骨骼肌特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

全文数据：骨骼肌特异性启动子及应用技术领域[0001]本研究涉及属于基因工程应用和生物技术领域，涉及骨骼肌特异性启动子和HIiR-208及应用，该改造启动子降低了目的基因在心肌中的表达水平，从而提高启动子组织特异性。背景技术[0002]在基因编辑技术越来越成熟的现在，使外源基因能够在体内特异性表达已成为基因编辑技术应用的一个亟待解决的问题。而我们利用转基因技术改善猪肌肉品质也遇到了类似的问题。[0003]目前对外源基因进行肌肉特异性调控的启动子有许多。肌肉特异性unc45b有助于肌节肌球蛋白的折叠。斑马鱼肌肉特异性基因unc45b最小启动子503unc可以驱动斑马鱼肌肉组织中的基因表达BergerandCurrie2013。在哺乳动物中，肌肉肌酸激酶MCK基因在从成肌细胞向肌细胞分化过程中被激活，并且已经充当肌肉发育的标志并且驱动转基因小鼠中的转基因表达。MCK启动子在幼年蝌蚪和成年蛙中的骨骼肌高效转基因表达Lim，Neffetal.2004。肌营养不良蛋白启动子可以使外源基因在小鼠的骨骼肌的中表达，其恢复肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物Anderson,DeRepentignyetal.2006。但是这些肌肉特异性启动子并不是骨骼肌特异性启动子，有些除了在骨骼肌中高效表达外，在心肌中也有较高的表达水平，例如MCK基因启动子。[0004]miRNA是转录后调控元件，能够与mRNA5’UTR区结合从而沉默或降解目的基因。大量的研究表明miRNA的表达具有组织特异性Barad，Meirietal.2004,BaskervilleandBartel2005JiR-208家族能调节心脏应激反应，是具有高度保守性以及心肌组织特异性的一类miRNAvanRooij,Sutherlandetal.2007,Montgomery,Hullingeretal.2011,在心肌疾病的研究中起着重要作用。Wang等人的研究结果表明：90.9%AMI病人和100%症状发作4个小时内的AMI患者容易检测到miR-208a。这也说明，miR-208a可以作为早期AMI更敏感的标志物。心脏纤维化可导致心肌机械僵硬，从而导致其收缩功能出现障碍，而Satoh等人的数据表明miR208a是参与心脏纤维化和肥厚性生长的基因表达的基础。[0005]目前所应用的肌肉特异性启动子并不仅仅只在骨骼肌中表达，其在心肌中也有较高水平的表达。而尽管miR-208在心肌疾病中的研究比较深入，但是关于miRNA在5’UTR区发挥作用并无相关报道。本发明利用miR-208心肌特异性和转录后水平调控的特点，将miR-208的种子序列与肌肉特异性启动子串联，以降低该启动子在心肌中的表达，从而提高启动子骨骼肌特异性。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种骨骼肌特异性启动子，所述启动子命名为：2eMCK_PMCK-T208,其核苷酸序列为SEQIDN0.1所示。[0007]本发明的另一个目的在于提供SEQIDNO.1所示的骨骼肌特异性启动子的应用，将该启动子与目的基相连，可启动目的基因在骨骼肌中的的特异性表达。[0008]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：[0009]一种骨骼肌特异性启动子2eMCK-pMCK-T208,所述启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。[0010]启动子2eMCK-pMCK-T208的应用，是将目的基因与2eMCK-pMCK-T208连接后，在骨骼肌中进行表达，本发明提供的启动子可用于提高目的基因在骨骼肌中的表达特异性。[0011]含有启动子2eMCK-pMCK-T208的表达载体也属于本发明的保护内容。[0012]与现有技术相比，本发明具有以下优点：[0013]本发明将肌肉特异性启动子与miR-208结合应用，改造成骨骼肌特异性启动子。该启动子相对于以往的肌肉特异性启动子而言，不仅具有较高的活性，而且在骨骼肌中的特异性较高。除此之外，该启动子片段较小，为以后利用转基因研究肌肉品质降低了难度。附图说明[0014]图1为pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP和pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP转染小鼠后mCherry在心肌和骨骼肌中的表达情况示意图。[0015]左图为心肌中mCherry的表达水平，右图为骨豁肌中mCherry的表达水平**表示差异极显著，P〈〇.01;NC表示差异不显著，P0.05。[0016]图2为pGL3_Basic、pGL3_Contro1以及pRL-TK真核表达载体示意图。[0017]图3为pGL3-mCherry_EGFP载体信息示意图。具体实施方式[0018]本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术;所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。[0019]胶回收试剂盒GelExtractionKit购自OmegaBio-tek公司）、FastDigestKpnI、FastDigestXhoKFastDigestAgeI购自于Fermentas公司）、T4Ligase购自Fermentas公司）、DNA纯化试剂盒购自BioFlux、感受态大肠杆菌购自全式金）、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司）。[0020]实施例1:[0021]pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP载体的构建：[0022]IpGL3-mCherry-EGFP载体的构建[0023]A.分别根据pCMV-C-EGFP、pGL3-Control和pBABE-puromCherry-EGFP-LC3B载体序列设计引物扩增EGFP、SV40poly㈧和mCherry序列。引物见表1。[0024]表IEGFP、SV40polyA和mCherry引物[0025][0026]表1说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。[0027]表2PCR体系[0028][0029]PCR反应才程序:98°C预变性3min，98°C变性1〇8,60°：退火1〇8,72°：延伸28，变性至延伸35个循环后，72°C延伸3min。[0030]PCR产物纯化回收:将扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳20min后紫外灯下将目的条带切下，放入1.5ml离心管中，然后经PCR产物纯化试剂盒，按其说明书回收纯化PCR产物，将回收产物保存至-20°C备用。[0031]B.用HindIII和XbaI内切酶酶切pGL3-Control和EGFP片段，酶切体系见表3。[0032]表3:双酶切体系[0033][0034]37°C反应Ih后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。[0035]回收产物连接:利用T4Ligase，将纯化后的EGFP片段连接与pGL3-Control载体连接。连接体系：2μ1EGFP，0.5yl线性化pGL3-Control，lylIOXLigaseBuffer，0.1ylT4Ligase，6·4μ1ddH20。将混合体系放置22°C2h。[0036]连接产物转化感受态大肠杆菌:从-80°C冰箱取出感受态大肠杆菌，冰上融化，用灭菌的枪头将连接产物加入到50μ1感受态细胞中，冰浴30min后42°C热激90s，再次冰浴2-3min，然后向感受态中加入500μ1无抗生素的也已培养基，于摇床中（37°C，180r摇45min。随后3000r离心3min，去450μ1上清，用移液枪吹打使细菌完全悬浮，并将菌液涂布于含有100ygml氨苄的固体培养基上，37°C正置30min，再倒置12-16h。[0037]筛选阳性克隆并测序鉴定：用灭菌枪头从平板中蘸取单克隆接入400μ1含lOOygm1氨苄霉素的液体培养基中，放入220r、37°C摇床扩大培养6h。以菌液为模板，用插入载体的目的片段的引物对按扩增条件进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有目的条带表明该克隆可能为阳性菌。[0038]将阳性菌送至奥克生物有限公司进行测序并对比。将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，该质粒命名为PGL3-EGFP。[0039]C.用XhoI和BglII内切酶酶切pGL3-EGFP和poly㈧片段，酶切体系见表4。[0040]表4:双酶切体系[0041][0042]37°C反应Ih后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。[0043]回收产物连接:利用T4Ligase，将纯化后的polyA片段连接与pGL3-EGFP载体连接。连接体系：2μ1poly⑷，0·5μ1线性化pGL3-EGFP，lylIOXLigaseBuffer，0.1ylT4Ligase，6·4μ1ddH20。将混合体系放置22°C2h。[0044]连接产物转化感受态大肠杆菌:同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。[0045]筛选阳性克隆并测序鉴定：同PGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。将构建好的质粒命名为PGL3-EGFP-A。[0046]D.用XhoI和EcoRI内切酶酶切pGL3-EGFP-A和mCherry片段，酶切体系见表5。[0047]表5:双酶切体系[0048][0049]37°C反应Ih后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。[0050]回收产物连接:利用T4Ligase，将纯化后的mCherry片段连接与PGL3-EGFP-A载体连接。连接体系：2μ1mCherry，0.5yl线性化pGL3-EGFP-A，lylIOXLigaseBuffer，0.1ylT4Ligase，6·4μ1ddH20。将混合体系放置22°C2h。[0051]连接产物转化感受态大肠杆菌:同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。[0052]筛选阳性克隆并测序鉴定：同PGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。将构建好的质粒命名为pGL3-mCherry-EGFP。[0053]2猪pGL3-T208-mCherry-EGFP载体的构建[0054]根据猪THRAPl基因序列数据，设计引物。上游引物酶切位点为Xhol，下游引物的酶切位点为AgeI，以PK-15细胞基因组为模板扩增长78bp的miR-208的种子序列T208。引物见表6,PCR体系如见表7。[0055]表6本发明设计的T208引物序列[0056][0057]表6说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。[0058]表7PCR扩增T208体系[0059][0060]PCR反应才程序:98°C预变性3min，98°C变性1〇8,60°：退火1〇8,72°：延伸28，变性至延伸35个循环后，72°C延伸3min。[0061]PCR产物纯化回收:与pGL3-mCherry-EGFP中PCR产物纯化回收过程一致。[0062]用XhoI和AgeI内切酶酶切pGL3-mCherry-EGFP和T208,酶切体系见表8。[0063]表8:双酶切体系[0064][0066]37°C反应Ih后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。[0067]回收产物连接:利用T4Ligase，将纯化后的T208片段连接与pGL3-mCherry-EGFP载体连接。连接体系：2μ1T208，0·5μ1线性化pGL3-mCherry-EGFP，Ιμΐ10XLigaseBuffer，0.1ylT4Ligase，6.4ylddH2〇。将混合体系放置22°C2h。[0068]连接产物转化感受态大肠杆菌:同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。[0069]筛选阳性克隆并测序鉴定:同pGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。[0070]构建好的质粒命名为pGL3-T208-mCherry-EGFP。[0071]2pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP载体的构建：[0072]IpGL3-2eMCK-pMCK载体的构建[0073]A、根据猪MCK基因序列数据，设计引物pMCK-F、pMCK-R，上游引物酶切位点为NheI，下游引物的酶切位点为XhoI，以PK-15细胞基因组为模板扩增长1042bp的启动子截短片段pMCK;用NheI和XhoI内切酶酶切pGL3-Basic载体和pMCK，将酶切后的pMCKDNA片段利用T4Ligase连接pGL3_Basic载体中的NheI和XhoI酶切位点之间，随后经转化、阳性鉴定、质粒提取获得载体，命名为pGL3-pMCK载体；[0074]表9pMCK启动子引物[0075][0076]表9说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。[0077]B、根据猪MCK基因序列数据，设计两对引物，一对上游引物酶切位点为MluI，下游引物的酶切位点为NheI，另一对上游引物酶切位点为KpnI，下游引物的酶切位点为MIuI，本步骤的上游引物酶切位点为MluI，下游引物的酶切位点为NheI;以PK-15细胞基因组为模板扩增长260bp的增强子片段eMCK;用MluI和NheI内切酶酶切pGL3-pMCK载体和eMCK，将酶切后的pMCKDNA片段利用T4Ligase连接pGL3-pMCK载体中的MluI和NheI酶切位点之间，随后经转化、阳性鉴定、质粒提取获得载体，命名为pGL3-eMCK-pMCK载体；[0078]表10eMCK增强子引物[0079][0080]表10说明：下划线部分为添加的酶切位点，加粗部分为保护碱基。[0081]C、更换⑻中引物的酶切位点，上游引物酶切位点为ΚρηΙ，下游引物的酶切位点为MIuI，以ΡΚ-15细胞基因组为模板扩增长260bp的增强子片段eMCK;用KpnI和MluI内切酶酶切pGL3-eMCK-pMCK载体和eMCK，将酶切后的pMCKDNA片段利用T4Ligase连接pGL3-pMCK载体中的KpnI和MluI酶切位点之间，随后经转化、阳性鉴定、质粒提取获得载体，命名为pGL3-2eMCK-pMCK载体。[0082]2pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP载体的构建[0083]邱111和乂11〇1双酶切？61^3120811〇16灯746??载体和？61^3-26]\1〇1]\1〇载体，双酶切体系见表11。[0084]表11双酶切体系[0085][0086]37°C反应Ih后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。[0087]利用T4Ligase，将2eMCK-pMCK片段与pGL3-T208-mCherry-EGFP载体连接。[0088]连接体系：2·5μ12eMCK-pMCK，lyl线性化pGL3-T208-mCherry-EGFP，lylIOXLigaseBuffer，0.1ylT4Ligase，5.4ylddH20。将混合体系放置22°C2h。[0089]连接产物转化感受态大肠杆菌:同pGL3-EGFP构建过程中转化过程一致。[0090]筛选阳性克隆并测序鉴定:同PGL3-EGFP构建过程中阳性鉴定过程一致。[0091]该质粒命名为pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP。[0092]3对照组载体的构建：[0093]用KpnI和XhoI双酶切pGL3-2eMCK-pMCK载体（目的条带2eMCK-pMCK和pGL3-mCherry-EGFP载体；[0094]利用T4Ligase，将2eMCK-pMCK片段与线性化pGL3-mCherry-EGFP载体连接。产物转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒命名为pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP。[0095]实施例3:[0096]启动子特异性的鉴定[0097]小鼠腹腔注射[0098]I120yg质粒（pGL3-2eMCK-pMCK-mCherry-EGFP或pGL3-2eMCK-pMCK-T208-111〇1虹^46??稀释于30^15%无菌葡萄糖液，震荡混匀。[0099]2稀释、18μ1HiGene于300μ15%葡萄糖，震荡混匀。[0100]3将稀释的HiGene加至质粒溶液中，立即震荡混匀，低速瞬时离心将液体甩至管底。[0101]⑷室温静置20min。[0102]⑸经腹腔注射入小鼠体内。[0103]⑹48h收集小鼠心肌与腿肌，并于液氮中保存。[0104]组织样RNA提取[0105]TriZO1法提取心脏、肌肉两种组织RNA，利用TAKARA公司的反转录试剂盒合成cDNA[0106]RNA水平检测启动子特异性。[0107]根据mCherry和EGFP基因序列，利用Primer5.0设计定量引物，其中EGFP作为内参。[0108]表12mCherry和EGFP的定量引物[0110]米用Roche公司的LightCycler480Real_TimePCRDetectionSystem，使用CWBIO公司的UltraSYBRMixture进行定量PCR的扩增。使用LightCycler480Software1.5软件，参照2-ΔACt方法，β-actin作为内参，ΔACt=CtTarget-Ct0_actinApiece-CtTarget-CtP-actinControl。其中，Target为待检测基因的Ct值，Apiece为每个cDNA样的Ct值与内参Ct值的差，Control是所有Apiece中ΔCt值最大的一个作为参考值。待检测cDNA样的各个待检测基因的相对表达倍数为2-ΛΛCt。[0111]qPCR反应体系[0112][0113]qPCR反应才程序:95°C预变性10min，95°C变性10s，60°C退火30s，72°C延伸12s，变性至延伸40个循环后，54°C0·05s°C，95°Clmin。[0114]申请人利用Excel对数据进行分析。再利用GraphPadPrism5绘制柱形图，统计结果显示注射pGL3-2eMCK-pMCK-T208-mCherry-EGFP的小鼠心脏中mCherry的表达量显著下降，与pGL3-2eMCK-pMCK_mCherry-EGFP相比下降了12倍，而腿肌中mCherry的表达量无明显变化。结果见图1。

权利要求：1.一种人工合成的骨骼肌特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.1所不。2.权利要求1所述的启动子在提高目的基因在骨骼肌中的表达特异性中的应用。3.含有权利要求1所述启动子的表达载体。

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