申请/专利权人：马金佑

申请日：2021-01-13

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN112646796A

主分类号：C12N9/38(20060101)

分类号：C12N9/38(20060101);C12N15/56(20060101);C12N15/70(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2023.01.17#发明专利申请公布后的撤回;2021.04.30#实质审查的生效;2021.04.13#公开

摘要：本发明涉及耐热β‑半乳糖苷酶的制备，酶基因序列β‑galactosidase，GenBank:NT_166518.1在第2010位上发生突变，由原来的A分别突变为C，其有益效果在于，获得的突变β‑半乳糖苷酶最适反应温度大大提高。

主权项：1.耐热β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1在第2010位，由原来的A分别突变为C，构建方法包括以下步骤：1从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b+质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；2质粒DNA的提取将携带有质粒pET20b+β-galactosidase的E.coliBL21基因工程菌接种于LBAmpAmp终浓度100μgmL液体培养基中，于37℃，200rmin过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；3易错PCR扩增与突变文库的构建以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系50μl为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmolL，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，5mmolLMn2+，0.5Uμl的TaqDNA聚合酶2.5μl，7mmolL的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b+质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliBL21；4突变文库的高通量筛选将步骤3得到的转化E.coliBL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基100μgmL，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μgmL氨苄青霉素的100mLLB培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经XbaⅠ酶切后电击转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有X-gal的MM培养基上，使X-gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入YPD培养基500μL、2％接种量，于28℃、200rmin培养48h，离心收集菌体以500μLBMMY培养基重悬菌体，28℃、200rmin培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；5酶蛋白纯化配制AKTA使用的缓冲液，其中A液：20mmolL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH7.5，B液：1molL氯化钠溶液20mmolL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH7.5，以5倍柱床体积的A液平衡柱子后，粗酶液经A液流入captorQ1mL阴离子柱中，通过B液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的B液洗脱杂蛋白，再以5％B液洗脱目的蛋白；6粗酶液中蛋白含量的测定标准曲线绘制：以牛血清蛋白BSA为标准品，配置10mgmLBSA母液，稀释为以下几个梯度：10.0mgmL、8.0mgmL、6.0mgmL、4.0mgmL、2.0mgmL、1.0mgmL、0.5mgmL，取不同浓度BSA溶液或超纯水40μL，加入5倍稀释后的Bio-Rad考马斯亮蓝蛋白染液260μL，震荡混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线，取粗酶液或纯化后的酶液40μL，加入稀释后染液260μL，混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中于595nm下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度；7酶活及比活力测定配制不同浓度对硝基苯酚溶液浓度分别为0.01mmolL、0.02mmolL、0.03mmolL、0.04mmolL、0.05mmolL、0.06mmolL、0.07mmolL、0.08mmolL、0.09mmolL和0.1mmolL，定容至10mL，各取2mL，加入2mL1molLNa2CO3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚-光密度标准曲线；将200μL稀释的酶液加入到800μL2.5gL经预热的ONPGpH6.5，1mM磷酸钾缓冲液溶液中，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应10min，加入1mL10％Na2CO3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液，假设标准曲线为Y＝aX+b； E:酶活，单位UmLt:反应时间N:酶液稀释倍数V2：反应终体积V1：酶液添加量8将比活最高的突变子，送生物公司测序。

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