申请/专利权人：中国科学院大连化学物理研究所

申请日：2016-11-30

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN108118064B

主分类号：C12N15/53(20060101)

分类号：C12N15/53(20060101);C12N9/04(20060101);C12N15/70(20060101);C12N15/81(20060101);C12P17/04(20060101);C12R1/38(20060101);C12R1/19(20060101);C12R1/84(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2018.06.29#实质审查的生效;2018.06.05#公开

摘要：本发明提供了一种硝基还原假单胞菌Pseudomonasnitroreducens5‑羟甲基糠醛氧化酶及其制备方法，具体的说是将5‑羟甲基糠醛氧化酶的DNA序列克隆到质粒，并将重组质粒整合到宿主菌中，获得可异源表达该酶的基因工程菌株，用该菌株异源表达制备的5‑羟甲基糠醛氧化酶，能氧化5‑羟甲基糠醛转化为2,5‑呋喃二甲酸，2,5‑呋喃二甲醛和5‑甲酰基‑2‑呋喃甲酸。本专利为生物法氧化5‑羟甲基糠醛制备呋喃类大宗化学品提供技术基础。

主权项：1.一种5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO，其核苷酸序列为SEQIDNO.1的DNA序列。

全文数据：5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO及其编码酶和应用技术领域[0001]本发明涉及一种硝基还原假单胞菌中5-羟甲基糠醛氧化酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该5-羟甲基糠醛的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的5-羟甲基糠醛氧化酶主要用于生物法制备大宗化学品领域，具体用于5-羟甲基糠醛的氧化制备呋喃类大宗化学品领域。技术背景[0002]随着化石资源的日益消耗，以及其带来大量温室气体的排放，可再生能源和可再生资源的开发利用在世界范围引起广泛重视。生物质是唯一可再生的碳资源，将生物质转化成平台化合物和大宗化学品是生物质转化利用的重要发展方向。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF被认为是可由生物质原料制备的、最具价值和潜力替代石化工业中基础化学品的生物基平台化学品，在国际上被视为一种介于生物基糖化学和石油基化学之间的关键桥梁化合物0^〇31611六六，8；1_1116〇11〇¥8?以161^1^，6131.5-HydroxymethylfurfuralHMFasabuildingblockplatform:Biologicalproperties,synthesisandsyntheticapplications[J].GreenChemistry,2011,13:754-793.。欧盟BRE\T‘以可再生原料利用生物技术生产大宗化工产品的中长期挑战”2006-2050中将HMF列为最重要的六碳平台化合物。HMF分子呋喃环上带有醛基和羟甲基，可以催化氧化生成一系列呋喃类芳香化合物，从而替代石油来源的苯类大宗化学品，因此具有广泛的经济和社会意义。[0003]HMF带有一个醛基和一个羟甲基，根据氧化的位置和氧化程度，可以分别氧化成5-轻甲基-2-呋喃甲酸（5-hydroxymethylfuroicacid，HMFCA，2,5_呋喃二甲醛（2,5_diformylfuranDFF，5-甲酰基-2-呋喃甲酸（5-formylfuroicacid，FFCA，2,5-呋喃二甲酸（2,5-furandicarboxylicacicUFDCALilgaMA,HallenRT，GrayM.ProductionofOxidizedDerivativesof5-HydroxymethylfurfuralHMF[J].TopicsinCatalysis,2010,53:1264-1269。[0004]在这些HMF氧化产物中，FDCA的市场前景最为广阔。FDCA与石油基大宗化学品对苯二甲酸结构相似，可以替代对苯二甲酸用于制造聚酯，聚酰胺类材料（GandiniA，SilvestreAJD,NetoCP,etal.Thefurancounterpartofpolyethyleneterephthalate:Analternativematerialbasedonrenewableresources[J]•JournalofPolymerSciencePartA:PolymerChemistry,2009,47:295-298.，市场潜在规模可达每年百万吨级;此外、FDCA在农药和医药方面也有着广泛应用。2004年美国能源部doe将rocA列为可通过以生物质为原料制备的最具价值、最有希望替代石化产业中基础化学品的十二个平台化学品之一WerpyT,PetersenG.TopValueAddedChemicalsfromBiomassVolumeI—ResultsofScreeningforPotentialCandidatesfromSugarsandSynthesisGas[J].2004.。2012年国际能源署（IEA将FDCA列为生物基来源的C6平台化合物（JongEd,HigsonA,WalshP,etal.Bio-basedChemicalsValueAddedProductsfromBiorefinerie[J].2012cjHMF的其他氧化广物同样具有非常重要的应用价值。DFF具有醛的典型化学性质，可以作为聚合物单体以及药物和农药中间体HopkinsKT，WilsonWD,BenderBC,etal.ExtendedAromaticFuranAmidinoDerivativesasAnti-PneumocystiscariniiAgents[J].MedicinalChemistry,1998,41:3872-3878.?功能性材料（MaJ，DuZ，XuJ，etal.Efficientaerobicoxidationof5-hydroxymethy1furfuralto2,5~diformylfuran,andsynthesisofafluorescentmaterial[J].ChemSusChem，2011,4:5卜54，具有广泛应用自身带有竣基和轻甲基，可以自身或者与其他化合物聚合成多种聚酯（HiraiH.OligomersfromHydroxymethyIfurancarboxylieAcid[J].JournalofMacromolecularScience:PartA-Chemistry，2006,21:1165-1179.，同时还可以作为白介素抑制剂（BraistedAC，0slobJD,DelanoWL,etal.DiscoveryofaPotentSmallMoleculeIL-2InhibitorthroughFragmentAssembly[J].J.AM.CHEM.SOC.,2013,125:3714-3715.〇[0005]HMF的化学转化已经取得较多进展，主要是以钌，锰和钒（NieJ，XieJ，LiuH.Efficientaerobicoxidationof5-hydroxymethylfurfuralto2,5-diformylfuranonsupportedRucatalysts[J].JournalofCatalysis，2013,301:83-91.AmarasekaraAS,GreenD，McMillanE.Efficientoxidationof5-hydroxymethylfurfuralto2,5-diformylfuranusingMnIII-salencatalysts[J].CatalysisCommunications,2008,9:286-288.Hal1idayGA,YoungRJ,Jr.,GrushinVV.One-pot,tw〇-step,practicalcatalyticsynthesisof2,5-diformylfuranfromfructose[J].OrgLett,2003,5:2003-5.SiankevichS,SavoglidisG，FeiZ，etal.Anovelplatinumnanocatalystfortheoxidationof5-Hydroxymethylfurfuralinto2,5-Furandicarboxylicacidundermildconditions[J].JournalofCatalysis，2014,315:67-74_等金属催化剂催化HMF氧化制备DFF和MA，用铀，金和祀等GorbanevYY，KlitgaardSK，WoodleyJM，etal.Gold-catalyzedaerobicoxidationof5-hydroxymethylfurfuralinwateratambienttemperature[J].ChemSusChem,2009,2:672-675.ZhangZ,ZhenJ,LiuB,etal.Selectiveaerobicoxidationofthebiomass-derivedprecursor5-hydroxymethylfurfuralto2,5-furandicarboxylicacidundermildconditionsoveramagneticpalladiumnanocatalyst[J].GreenChem_，2015，17:1308_1317.催化HMF氧化制备FDCA。然而所有的这些方法都需要较高温度和压力，存在产物选择性和底物耐受性差的问题。与化学转化相比，生物转化具有反应条件温和，选择性高的特点。[0006]近几年，生物转化HMF越来越成为人们关注的重点。HMF的生物催化氧化主要有全细胞催化和分尚酶胞外催化氧化两种。Wierckx等KoopmanF，WierckxN,deWindeJH,etal.Efficientwhole-cellbiotransformationof5-hydroxymethylfurfuralintoFDCA，2,5-furandicarboxylicacid[J].BioresourTechnol,2010,101:6291-6296.利用氧化还原酶仅限用于有氧条件的特点，利用全细胞催化氧化HMF，其FDCA收率能达到97%。但全细胞催化过程需要持续的碳源，同时生成的rocA不易分离，不利于下游氧化产物的回收。而胞外酶氧化能够作用于更高的底物浓度，产物回收率高，且耗水量低，胞外催化氧化HMF制备下游大宗化学品日益成为大家研究的重点。一种醇氧化酶AA0被发现在邱6的磷fe盐缓冲体系中能完全氧化HMF转化为FFCACarroJ,FerreiraP,RodriguezL，etal.5-hydroxymethylfurfuralconversionbyfungalaryl-alcoholoxidaseandunspecificperoxygenase[J].FEBSJ,2014.。半乳糖氧化酶能选择性氧化HMF转化为DFF，黄嘌呤氧化酶氧化HMF转化为HMFCAQinY-Z，LiY-M，ZongM-H，etal.Enzyme-catalyzedselectiveoxidationof5-hydroxymethylfurfuralHMFandseparationofHMFand2,5-diformylfuranusingdeepeutecticsolvents[J].GreenChem.,2015，17:3718-3722•，这些酶选择性较高，但是不能同时完成HMF到FDCA的三步氧化，而且反应pH多为中性。与上述氧化酶相比，5-羟甲基糠醛氧化酶是一种FAD依赖酶，在FAD辅因子的作用下能完全氧化HMF转化为FDCA，首个可以单酶氧化5-羟甲基糠醛完全转化为FDCA的酶，而且反应介质为磷酸盐缓冲液，更环保，在将5-羟甲基糠醛氧化制备呋喃类大宗化学品领域的应用方面具有优势（DijkmanWP,GroothuisDE，FraaijeMW.Enzyme-catalyzedoxidationof5-hydroxymethylfurfuraltofuran-2,5-dicarboxylieacid[J].AngewChemIntEdEngl,2014,53:6515-6518.〇[0007]本专利通过NCBI软件Blast分析筛选到一株硝基还原假单胞菌（Pseudomonasnitroreducens具有5-羟甲基糠醛氧化活性，将其基因进行克隆、测序和在宿主菌种表达，构建高产5-羟甲基糠醛氧化酶菌株，获得高活性5-羟甲基糠醛氧化酶，用于制备氧化5-羟甲基糠醛转化为2，5-呋喃二甲酸，2，5-呋喃二甲醛和5-甲酰基_2-呋喃甲酸。该酶在FAD辅因子作用下，能将HMF氧化到nCA，且该酶反应pH范围较宽，尤其在碱性环境中酶活更高，环境适应性更强，有利于产业化。本专利为生物法氧化5-羟甲基糠醛制备呋喃类大宗化学品提供技术基础，为生物法氧化5-羟甲基糠醛提供了一条绿色、环保的路线。发明内容[0008]本发明的目的是提供一种重组5-轻甲基糠醛氧化酶的制备方法和应用。[0009]为实现上述目的，本发明的技术方案如下。[0010]一种来源于硝基还原假单胞菌（Pseudomonasnitroreducens，保藏编号：CICCN0.20703的5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMF0,其核苷酸序列具有如下特征之一：[0011]1具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸DNA序列；[0012]2对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸DNA序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有5_羟甲基糠醛氧化酶活性的核苷酸序列。[0013]所述的5-羟甲基糠醛氧化酶基因编码的5-羟甲基糠醛氧化酶，其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：[0014]1序列表中SEQIDN0.2从氨基端开始的第1-532位氨基酸残基序列；[0015]2对序列表中SEQIDN0.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有5-羟甲基糠醛氧化酶活性的氨基酸序列。[0016]所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的制备方法，将5-羟甲基糠醛氧化酶的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET21a，并将重组质粒整合到宿主菌大肠杆菌BL21中，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的5-轻甲基糠醛氧化酶。[0017]所述的表达载体为大肠杆菌表达载体或者酵母表达载体，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞（EscherichiacoliBL21'EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5a，或者酵母菌宿主细胞（如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis〇[0018]所述的重组5-轻甲基糠醛氧化酶，其特征在于：可用于氧化5-羟甲基糠醛以及其他初级醇，初级硫醇，偕二醇。[0019]所述的重组5-轻甲基糠醛氧化酶，酶反应PH范围较宽，尤其在碱性环境中酶活更高，环境适应性更强;其催化氧化5-羟甲基糠醛反应的PH在6-10之间，优选为8-9;反应温度在20-40°C之间。[0020]与现有技术相比，本发明的优势在于以下几点：[0021]1.本专利发现的5-羟甲基糠醛氧化酶基因来源于硝基还原假单胞菌，为一种新的5-轻甲基氧化酶。[0022]2.本专利发明的5-轻甲基氧化酶活性更高，催化反应时间更短；[0023]3.5-轻甲基氧化酶在碱性时具有较好活性，环境适应性更好，催化反应时底物转化率更高，更有利于产业化。附图说明[0024]图1:5-轻甲基糠醛氧化酶HMF0基因的电泳检测。[0025]图2:5-轻甲基糠醛氧化酶》〇纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（3〇3-?八6已）[0026]各泳道加入的样品分别是：泳道1-E•co1iBL21pET21a-HMFO诱导表达前的菌液沉淀；泳道2-E•coliBL21pET21a_HMF0破菌后上清;泳道3-E•coliBL21pET21a-HMF0破菌后沉淀;泳道4-破菌上清经線柱的流出液;泳道M_预染蛋白分子量标准;泳道5-40mmolL咪唑洗脱液;泳道6-60mmolL咪唑洗脱液;泳道7-80mm〇lL咪唑洗脱液;泳道8-250mm〇lL咪唑洗脱液;泳道9-500mmo1L咪唑洗脱液。[0027]图3:5-轻甲基糠醛氧化酶催化氧化HMF。[0028]图4:5-轻甲基糠醛氧化酶最适pH值测定。[0029]图5:5-轻甲基糠醛氧化酶最适温度测定。具体实施方式[0030]下面结合具体实施例，对本发明进一步说明。[0031]实施实例1:5-轻甲基糠酸氧化酶基因序列分析[0032]测序的结果采用GenBank数据库中的BasicLocalAlignmentSearchToolBLAST分析，VectorNTISuite8.0软件进行多序列比对，分析序列信息。[0033]获得的5-羟甲基糠醛氧化酶基因（命名为HMF0编码区长1632bp，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。HMF0编码543个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQIDN02所示，蛋白质理论分子量为58686Da，预测等电点为5.96,氨基酸中带电的有152个，占34.45%，酸性氨基酸有65个，占13•17%，碱性氨基酸有52个，占12.98%，极性氨基酸有102个，占19.07%，疏水性氨基酸有2〇5个，占36.44%Ala有58个，Gly有56个，Glu有26个。[0034]1SEQIDNo.1的信息参见序列表）[0035]a序列特征[0036]*长度:1632碱基对[0037]*类型:核酸[0038]*链型:双链[0039]*拓扑结构:线性[0040]⑹分子类型：cDNA[0041]c假设:否[0042]d反义:否[0043]e最初来源：Pseudomonasnitroreducens菌株。[0044]序列表：[0045]SEQIDN0.1[0046]ATGACCACTCCTCGCTATGACCACATCATCGTCGGCGGCGGCAGCGCCGGCAGCGTGCTTGCCAGCCGCCTCAGCGCCGACCCGCAACGCCACGTCCTGCTCATCGAAGCCGGCCCGGACACCCCACCCCACGCCACGCCGGCGGAAATCCTCGACGGCCACAACCCCTTCCGCCTGCGCCTGGAACTGCGCGATCGCTATTTCTGGCCGGACCTGAGCGTCCGCCACGGTGCGCAGCCCGAAGGCATCGAGCGCCCCGAGCGCTATCTCGAGCAGGCCCGCTTGCTCGGCGGCGGCTCCAGCGTCAACGTGCTGGTGGCCAACCGCGGTCTGCCGCGCGACTACGACCAGTGGGCAGCGCTGGGTGCCGAAGGCTGGGGCTGGGACGACGTGCTGCCGTACTTCCGCAAGCTCGAACGCGACACCGACTACGCCGGCCCGCTGCACGGGCATGACGGGCCGATCCCGATCAGCCGCGTCTCCACCCGCGACTGGACGCCCTTCACCCGCTCCGTGGTCTCGGCGCTGCAAGCCGAAGGCCTGCGCGACATCGGCGACCAGAACGGCGTGTTCGACGACGGCTACTTCGCCCCCGCGGTAAACCTGGAGCATGGCCAGCGCGTGTCCGCCGCCCGCGGCTACCTCGATGAAGCAGTGCGCGCACGGCCCAACCTGACGCTGTGGACCGACAGCCAGGTACTCGGCCTGCAACGCGAGGGCACGCGCATCACCGGCGTCGAACTGCAACGTAACGGTGAGCACGTCACCGTGGGGGCTGGCGAAGTCATCCTCGCCGCCGGAGCGCTGCAATCGCCGGCCTTCCTGCTGCGTAGCGGCATCGGCCCGGCCAGCCAGTTGCAGGAGCTGGGCATCGAGGTGATCGTCGACCGCCCCGGCGTCGGCGGCAACCTGTGGGAGCACAGCTCGCTGGGCACCCTCGCCACCCTGGGCGATGCCGCCCGCTCGGACGCCGTGCTGGCACGGCCCGGCACCTCGCACCAACTGGGTATCCGGGTGTCCTCGGGCGTCGATCCGGACACGCCCTCGGACCTCTACCTGGCCATCGGCGCGGACGCCGAGCGCGGCGTGGCCCACGCGCTGTTCTGGATCAACAAACCCAGCTCCAGTGGCCGCCTGACCTTGCGCGATCGCGACCCGGCAAGCCCGCCGCACGTCGATTTCAACCTGCTCTCCGACCCTCGCGATCTGCAACGCGCCCGTGTGGCGCTGCGCACCATCCAGCGCCTGTTCAAGCACCCGGTCCTGGCGCGCTACGAACTGCAATTGGCGCTTACCCCCTTCGCCGTGCCGCAACCGGGCGGGCCGAAGCTGGAAACCCTGCTGGCCGACGACACGGCGCTGGAAGCCTACCTGCGCCGGCACATAGGCGGCGTCTGGCACCCCAGCGGTACCTGCCGCATCGGCACCGCCGATGACCCGCAGGCCGTGGTCGACAGCGCCGGTCGCGTCCATGGCGTGGAAGGCCTGCGTGTCGCCGACGCCTCGATCATCCCGGTGATCCCCACCGCCAACACCAACCTGCCGACCCTGATGCTCGCCGAGAAAATCGCCGACGCCATCCTGGGCGGAGCCAAGCTTTCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA[0047]SEQIDNo.2的信息[0048]a序列特征[0049]*长度:544氨基酸残基[0050]*类型:氨基酸[0051]*链型:单链[0052]*拓扑结构:线性[0053]⑹分子类型：蛋白[0054]SEQIDNO.2[0055]MTTPRYDHIIVGGGSAGSVLASRLSADPQRHVLLIEAGPDTPPHATPAEILDGHNPFRLRLELRDRYFffPDLSVRHGAQPEGIERPERYLEQARLLGGGSSVNVLVANRGLPRDYDQWAALGAEGWGWDDVLPYFRKLERDTDYAGPLHGHDGPIPISRVSTRDWTPFTRSVVSALQAEGLRDIGDQNGVFDDGYFAPAVNLEHGQRVSAARGYLDEAVRARPNLTLffTDSQVLGLQREGTRITGVELQRNGEHVTVGAGEVILAAGALQSPAFLLRSGIGPASQLQELGIEVIVDRPGVGGNLffEHSSLGTLATLGDAARSDAVLARPGTSHQLGIRVSSGVDPDTPSDLYLAIGADAERGVAHALFWINKPSSSGRLTLRDRDPASPPHVDFNLLSDPRDLQRARVALRTIQRLFKHPVLARYELQLALTPFAVPQPGGPKLETLLADDTALEAYLRRHIGGVWHPSGTCRIGTADDPQAVVDSAGRVHGVEGLRVADASIIPVIPTANTNLPTLMLAEKIADAILGGAKLSAALEHHHHHH[0056]实施例25-轻甲基糠醛氧化酶HMFO全长基因克隆[0057]按细菌基因组DNA提取试剂盒TaKaRa公司）操作步骤提取硝基还原假单胞菌的基因组DNA。对5-羟甲基糠醛氧化酶基因序列进行多序列比对分析后，设计引物F:5’-AGTCCATATGACCACTCCTCGCTATGAC-3’和R:5’-ATATAAGCTTGGCTCCGCCCAGAATG-3’。以硝基还原假单胞菌菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为:94°C4min，l个循环;98°C10s，68°C5s每个循环降低0•2°C，72°Clmin45s，35个循环;72°ClOmin，1个循环。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产物大小为1596bp。胶回收试剂盒购自Axygen公司）纯化PCR产物。[0058]实施例3重组质粒PET21a-HMFO的构建[0059]纯化后的PCR产物和空载体pET21a分别用限制性内切酶NdeI和HidHI进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞后，涂布于含有100ugml的氨苄LB酵母粉5gL，胰蛋白胨10gL，氯化钠10gL，琼脂粉15gL固体培养基上，37°C培养12h。取单克隆接入含有1〇〇ygml氨苄的液体LB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶NdeI和Hidm进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒PET21a-HMF0送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在PET21a的NdeI和Hidm酶切位点之间插入5-羟甲基糠醛氧化酶的基因，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。[0060]实施例4重组质粒转化至大肠杆菌宿主细胞BL21[0061]取luL质粒加入50uLBL21感受态细胞冰浴10min到30min，42°C水浴2min，冰浴2min到1Omin加400uLLB液体培养基，37°C，150rmin摇30min。取适量涂布于含有100ygml的氨苄LB酵母粉5gL，胰蛋白胨10gL，氯化钠10gL，琼脂粉15gL固体培养基上，37°C培养12h〇[0062]实施例5重组菌株的诱导表达[0063]挑单菌落于200mlLB液体培养基（氨苄浓度100ugmL，37°C，180rmin培养至OD6〇q值0•6-0.8;加IPTG至终浓度为0•lmmolL16°C，180rmin诱导表达14h〇8000rmin离心10min，去除上清，菌体加NAT缓冲液20mMTris-Hcl0.5MNacl10%甘油再悬浮，超声破碎，8000rmin离心，去除菌体，获得酶液，Ni柱纯化，得纯化蛋白。[0064]实施例6HMF0基因在酵母中表达[0065]1.重组质粒pPICZaA-HMFO突变体的构建：将实施例1纯化的PCR产物与T载体PMD19-T进行TA连接，连接产物转化E•coliToplO，经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZaA购自Invitrogen公司）分别用限制性内切酶Ndel和HindHI进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞后，涂布于含有25iigml博来霉素Zeocin，Invitrogen公司）的LLB酵母粉5gL，胰蛋白胨10gL，氯化钠5gL，琼脂粉15gL固体培养基上，37°C培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25iigmlZe〇Cin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶Ndel和HindHI进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒pPICZaA-HMK送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在pPICZaA的Ndel和HindHI酶切位点之间插入了成熟HMF0基因，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。[0066]2.重组质粒电转化至毕赤酵母X-33:用SacI线性化重组质粒pPICZaA-HMFO,参照GeneJETGelExtractionandDNACleanupMicroKit法国Fermentas公司）的操作说明对单酶切产物进行柱式纯化，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册（pPICZaA，B，andCPichiaexpressionvectorsforselectiononZeocinTMandpurificationofrecombinantproteins进行电转化和诱导表达。取5ul线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母感受态细胞X-33购自Invitrogen公司），线性化的空载体pPICZaA作为对照同时进行电转化，电转化的条件为:2mm转化杯，2000V电压，200D电阻，25uF电容，在含有100ugmLZeocin的YPDS山梨醇181.6gL，酵母粉10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂粉15gL抗性平板上，30°C培养3-4后长出单菌落，挑取了9个单菌落进行酵母菌落PCR。[0067]3.重组菌株的诱导表达:将阳性克隆单菌落接种至5〇mlBMGY酵母粉10gL，蛋白胨20gL，YNB13•4gL，10%甘油1〇〇ml，4X10_5%生物素，100•OmMpH6.0的磷酸盐缓冲液100ml培养基中，28°C，200rpm培养至〇D6〇0=2_6，室温下15〇〇rpm离心5min，收集菌体，用lOOmlBMMY酵母粉10gL，蛋白胨20gL，YNB13.4gL，4X10_5%生物素，100.OmMpH6•0的磷酸盐缓冲液l〇〇ml，0.5%的甲醇）重悬菌体，28°C，180rpm进行诱导表达，每24h加入终浓度为0.5%的甲醇，同时取样5ml，进行菌体密度、菌体湿重的测定。诱导9他后，4°C，8000rpm离心20min收集上清，获得5-羟甲基糠醛氧化酶。SDS-PAGE检测诱导表达效果，在SDS-PAGE电泳胶上呈现一条大约55kD的蛋白条带。[0068]实施例75-羟甲基糠醛氧化酶最适PH检测[0069]分别取i〇〇uLlOmgmL香草醇于85〇uL5〇mM甘氨酸-盐酸缓冲液pH2_2，醋酸-醋酸钠缓冲液pH4.05.0，50mM磷酸钾缓冲液PH6•07•〇8•05〇mM甘氨酸-氢氧化钠pH9.010.0分别加入50ugHMF0，3TC反应lh。按标准方法测定酶活。以最高酶活力为1〇〇%计算相对酶活。结果如图4所示，HMF0的最适反应PH值为8.0。[0070]实施例85-轻甲基糠醛氧化酶最适温度检测[0071]取10组i〇〇uL10mgmL香草醇于850uL50mM憐酸钾缓冲液（pH8_0中，加入50ugHMF0，分别在25，30，40，45，50，55°C下反应lh。产物于340nM下检测。按标准方法测定酶活。以最高酶活力为100%计算相对酶活。结果如图5所示，腹阳的最适反应温度为30°C。[0072]实施例95-轻甲基糠醛氧化酶催化氧化5一轻甲基糠醛[0073]取23.3mg5-轻甲基糠醛于25mL5〇mM鱗酸钾缓冲液（pH8.0中，加入0_39mgHMFO，通空气，在25。：下搅拌反应24h。5_轻甲基糠醛的转化率S9%，产物5-甲酰基-2_吹哺甲酸，2，5-呋喃二甲醛，2，5-呋喃二甲酸的收率分别为58%，9%，8%。[0074]实施例1〇5-羟甲基糠醛氧化酶催化氧化2,5_呋喃二甲醛制备2,5-呋喃二甲酸，5-甲酰基-2-咲喃甲酸[0075]取2mM2,5-呋喃二甲醛于25mL50mM磷酸钾缓冲液pH8_0加入2uMHMF0,通空气，在25。：下搅拌反应。HPLC检测反应产物。2，5-呋喃二甲醛转化率100%，5-甲酰基-2-呋喃甲酸收率91%，2,5-呋喃二甲酸收率9%。[0076]实施例115-轻甲基糠醛氧化酶催化氧化HMF制备mCA[0077]取23.8mg5-羟甲基糠醛于25mL5〇mM磷酸钾缓冲液（pH8.0中，加入0.25mgHMF0，20uMFAD辅因子，通空气，在25°C下搅拌反应24h。5_羟甲基糠醛转化率100%，产物5-甲酰基-2-呋喃甲酸，2,5-呋喃二甲醛，2，5-呋喃二甲酸的收率分别为0%，0%，99•9%。

权利要求：1.一种5-轻甲基糠醛氧化酶基因HMFO,其核苷酸序列具有如下特征之一：1具有序列表中SEQIDN0.1的脱氧核糖核酸DNA序列；、2对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸DNA序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有5_轻甲基糠醛氧化酶活性的核苷酸序列。2.—种权利要求1所述的5-羟甲基糠醛氧化酶基因编码的5_羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于:其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：1序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-532位氨基酸残基序列；2对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有5_羟甲基糠醛氧化酶活性的氨基酸序列。3.—种权利要求2所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的制备方法，其特征在于:将5-羟甲基糠醛氧化酶的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET21a，并将重组质粒整合到宿主细胞中，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的5-羟甲基糠醛氧化酶。4.根据权利要求3，其特征在于:所述的表达载体为大肠杆菌表达载体或者酵母表达载体的制备方法，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞®scherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5a中的一种或二种以上），或者酵母菌宿主细胞（如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis中的一种或二种以上）中的一种或二种以上。5.—种权利要求2所述的重组5-轻甲基糠醛氧化酶的应用，其特征在于:可用于氧化5_羟甲基糠醛以及酚类，呋喃类，不饱和直链的初级醇和初级硫醇，以及可自发水合的偕二醇中的一种或二种以上。6.根据权利要求5所述的重组5-羟甲基糠醛氧化酶的应用，其特征在于:其催化氧化5-羟甲基糠醛反应的pH在6-10之间，优选为8-9;反应温度在20-40°C之间。

百度查询： 中国科学院大连化学物理研究所 5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO及其编码酶和应用

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