申请/专利权人：武汉轻工大学

申请日：2017-06-16

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN107236718B

主分类号：C12N9/18(20060101)

分类号：C12N9/18(20060101);C12N15/55(20060101);C12N1/21(20060101);C12N15/70(20060101);C12N15/85(20060101);C12N15/81(20060101);C12P13/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2017.11.07#实质审查的生效;2017.10.10#公开

摘要：本发明涉及生物技术和基因工程领域，具体涉及到一种来源于宏基因组的低温酯酶、编码基因及其应用。低温酯酶为Est18，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。Est18是低温碱性酯酶，在温度40℃以下时相对稳定，最适温度20℃，最适pH为8.0，pH11.0时的最大活性80%。

主权项：1.一种低温碱性酯酶Est18，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述低温碱性酯酶Est18在pH6-11范围内稳定，pH11时的最大活性大于80％。

全文数据：一种来源于宏基因组的低温酯酶、编码基因及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术和生物工程领域，具体涉及一种来源于土壤宏基因组的低温醋酶Est18及其编码基因和应用。背景技术[0002]酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽GXSXG序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统即油-水界面或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。[0003]宏基因组，又称元基因组，是指生境中全部微小生物遗传物质的总和。因为宏基因组技术是将直接提取的环境微生物基因组DNA克隆于不同的载体并转入合适的宿主，通过不同的筛选技术筛选并获得新基因或生物活性类物质，所以该技术实际上绕过了微生物培养环节，能够更好地开发和利用未培养微生物资源，为工业、农业或各方面提供了更广阔的基因库。目前，越来越多的专利酶类是来自于宏基因组文库，它们可适用于食品、化工、医药等领域。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种来源于泰山土壤宏基因组的新的低温碱性酯酶Estl8、编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯键的水解，尤其是短链酯类的水解。[0005]本发明从泰山土壤宏基因组文库中，通过特异性底物三丁酸甘油酯利用功能筛选方法（Function-drivenScreening从中筛选到一株表现出酯酶活性的菌株TS-Estl8，利用生物信息学分析方法，分析得到一个酯酶基因est_ZS。该基因全长为957bp从起始密码子到终止密码子），编码318个氨基酸。通过PCR的方法，将克隆得到酯酶基因^。§与表达载体pET_3〇b+连接后得到重组质粒pEstl8,经大肠杆菌BL21DE3pLys诱导表达后，得到了重组酯酶EsUSoEstlS是低温碱性酯酶，在温度4TC以下时相对稳定，最适温度2TC，在PH6-11范围内稳定，最适PH为8，PH11时的最大活性80%。包含该基因的重组菌株保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017317,菌株分类为Escherichiacoli〇[0006]本发明的第一个目的是提供一种编码所述的酯酶Estl8的酯酶基因estj所述的酯酶基因estiS的核苷酸序列如SEQidNO.1所示。[0007]本发明的第二个目的是提供一种酯酶Estl8,其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。[0008]本发明还提供一种含有所述的酯酶基因esUS的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET_30b+载体。[0009]本发明还提供一种含有所述的酯酶基因estl8的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌Esciierichiaco_iBL21DE3pLys。[0010]本发明的第三个目的是提供一种制备低温碱性酯酶Estis的方法，包括以下步骤：1用上述重组载体转化宿主细胞£sciericin_acoiiBL21DE3pLys。，得重组菌株；2培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；3回收并纯化所表达的酯酶Estl8。[0011]本发明所述低温碱性酯酶Estl8来自泰山土壤宏基因组（宿主菌未知），其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示：MSTLDPKLFSDKAIAPETRAVNDAIIAAMTGMPEffffDVGAAKTRAARARGEGIFPAAAKSERARWIEIDGPAGKVPLRVIAPENPRGVYLHIHGGGHVLGAADQQDRLLERISNETRLTAISVEYRLAPENPYPAGPDDCEAAALWVNEHAADFGGHKIAIGGESAGAHLSALTILRLRDKHGLTPFNAANLVFGVFDLGMTPSARAFGDERLVLRTRDIEKFGEAFLPGTDDEQKRAPEFSPLYANLAGLCPALFTIGTRDALLDDSLFMHARWVAAGNVGELDIYPGGCHGFIAFPYPQAFASIARQATFLNAALG本发明还提供上述的低温碱性酯酶EstlS在催化酯类水解、酯化或转酯化反应中的应用。优选的短链脂肪酸酯为具有C2-C8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯乙酸酯、对硝基苯丁酸酯，对硝基苯辛酸酯等，其中底物为对硝基苯丁酸酯C4时催化活性最高。[0012]酯酶EstlS为一种低温碱性酯酶，共含有318个氨基酸，在20-45°C间的酶活力达80%以上，温度大于50°C时酶活性急剧下降。最适pH为8.0,在pH11的缓冲液中保温20min仍然保存80%以上的酶活，在pH值7-11之间有较高酶活性，优选为7.0〜9.0。1mM的Cu2+、Fe2+和Zn2+对Estl8的酶活产生强烈的抑制作用，而Ca2+，Mg2+，Ni2+和Co2+，以及金属螯合剂EDTA均对酶活有增强作用。[0013]本发明从泰山土壤宏基因组文库中筛选得到新的酯酶基因，发现该基因编码的蛋白在20°C时稳定高效，50°C时迅速失活便于酶促反应控制），同时在碱性环境中表现出较高稳定性和活性。因此本发明的低温碱性酯酶可在食品、化工、洗涤、制药等工业中应用，以降低生产温度减少能耗。[0014]附图说明[0015]图1:在£.c〇h•中表达的重组酯酶Estl8的SDS-PAGE分析。泳道M为蛋白质Marker，泳道A为酯酶Estl8诱导前的可溶性组分，泳道B为酯酶Estl8诱导后的可溶性组分，泳道C为酯酶Estl8纯化后的蛋白。[0016]图2:重组酷酶Estl8最适反应pH。[0017]图3:重组酷酶Estl8最适反应温度。[0018]图4:重组酯酶Estl8的热稳定性。[0019]图5:二价阳离子对醋酶Es118活性影响。[0020]图6:有机溶剂、变性剂和螯和剂对Estl8活性影响。具体实施方式[0021]实施例1:酯酶基因的获取以三丁酸甘油酯为底物从泰山土壤宏基因组文库中筛选并纯化得到表现出酯酶活性的菌株TS-EstlS。提取TS-Estl8的质粒DNA，经亚克隆测序得到插入片段的序列信息。利用生物信息学方法对基因信息进行注释，分析并确定了其中酯酶基因的开放阅读框0penReadingFrame,0RF，将该0RF命名为esWS，其基因序列如SEQIDNO.1所示，全长为957bpATG起始，TAG终止），其编码的酯酶Estl8的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示，共318个氨基酸。[0022]实施例2:酯酶基因的克隆、重组载体及重组菌株的构建将本发明获得的酯酶基因estiS克隆到表达载体上，构建重组表达载体。根据分析得到的酯酶基因序列，利用primer5软件设计扩增酯酶全基因的上游引物？〇;^以35’-CCAAGCTTTCCGGTTTTTGACGAAGCGC,BafflHI和下游弓丨物Reverse5,_CGGGATCCGAGCGCGATCCGCAAACTAG，ffindIII。使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因esW8:94°C预变性3min;94°C变性lmin，复性温度56°C1min，72°C延伸1min，进行25个循环;循环结束后72°C延伸10min，4°C10min，扩增目的片段的长度约为1kb。纯化后的PCR产物经BanHI和dl11双酶切，割胶回收后与SanHI和ffindIII双酶切的质粒pET-30b⑴连接，转化大肠杆菌DH5a，通过卡那霉素抗性及三丁酸甘油酯活性筛选得到阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒得到重组载体pEstlS，经双酶切及测序鉴定插入片段同SEQIDN0.1。包含重组载体pEstl8的大肠杆菌EscherichiacoliDH5a菌株保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017317,保藏日期为2017年6月8曰。[0023]实施例3:表达酯酶Estl8的基因工程菌的构建3.1大肠杆菌BL21DE3pLys感受态细胞制备1.将少量大肠杆菌BL21DE3pLys菌种接入3mlLB试管液中，200rpm、37°C过夜培养；2•按1%体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mlLB摇瓶中，200rpm、2〇°C过夜培养；3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至4°C，分装至冰预冷的离心管50ml，冰浴数分钟；4.4°C、4000rpm离心10min回收细胞，弃上清；5.用冰预冷的10ml0.1M的CaCl2重悬细胞，4°C4000rpm离心10〜15min回收细胞；6•重复5,用10ml0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴3〇min以上；7.4°C，4000rpm离心10min回收细胞；8.每50ml原培养物用1ml的0.1MCaCh重悬后，在加入1ml50%的甘油混匀后，分装于1.5ml离心管，50〜100ul每管。-8TC保藏。由此得到大肠杆菌BL2iDE3pLys感受态细胞。[0024]3.2转化取实施例2中得到的pEstl8质粒0.5〜1yl与50Ul大肠杆菌BL21DE3pLys感受态细胞混合，冰浴30min，于42°C水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500ulLB液体培养基，37°C200rpm培养45min。培养物离心后涂布于含有50ygml的卡那霉素的LB平板，由此得到含有pEstl8的大肠杆菌BL21DE3pLys。[0025]实施例4:酯酶Estl8的表达和纯化4.1蛋白诱导表达含有pEstl8的大肠杆菌BL21DE3pLys在200ml的LB培养基中37°C培养至0D600为0_4-0.6时，加IPTG至终浓度0.2mM，20°C培养过夜。每5〇ml菌液4000rpm、4°C离心10min，收集菌体，并2ml20mM，pH7.4PBS缓冲液KH2P04-K2HP04重悬菌体，超声波破碎15min分钟，离心，收集上清。[0026]4.2酯酶Estl8的纯化与SDS-PAGE电泳用His亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：1.His亲和层析柱的Ni2+结合和BindingBuffer20mMPBS缓冲液，5mM咪卩坐和500mMNaCl并用0.22wn过滤器过滤的平衡。加入0.5倍柱体积0.1MNiS04溶液进行Ni2+的相应结合，填充完后，加入dH20已用0.22mi过滤器过滤洗涤未结合的Ni2+，再用5倍柱体积的BindingBuffer进行平衡。[0027]2.酯酶EstlS蛋白的纯化。平衡后上样，样品为4.1中收集的上清上清中的盐浓度和咪唾浓度与BindingBuffer相同）10ml，以5倍柱体积的BindingBuffer洗去未结合（杂蛋白）蛋白。然后洗脱，洗脱体积为20ml在这20ml内，ElutionBuffer20mMPBS缓冲液，500mM咪卩坐和500mMNaCl并用0.22wn过滤器过滤）和BindingBuffer在该步骤进行混合，ElutionBuffer比例逐渐增大，使咪唑浓度从5mM匀速增加到500mM;最后再用5倍体积ElutionBuffer完全洗脱，收集蛋白峰（1mltube。[0028]3.检验收集的蛋白洗脱液的酯酶活性。在含有三丁酸甘油酯的LB培养皿底部划上小方格，然后对每个格进行标号，将收集的洗脱液各取l〇yl，然后根据序号加入相应的小格子内，置于37°C培养箱内正放培养3h左右即可观察到结果含有酯酶Estl8蛋白的洗脱液会有水解圈）。[0029]4.对收集的洗脱液进行脱盐和浓缩。用超滤管默克密理博MerckMillipore进行脱盐和浓缩，具体操作方法参照默克密理博MerckMillipore公司的操作手册进行。[0030]5.酯酶Estl8的SDS-PAGE电泳。将纯化的酯酶进行SDS-PAGE凝胶电泳（图1，得到纯化的酯酶Estl8，纯化的蛋白大小约37kDa，符合理论预期。[0031]4.3酯酶Estl8活性测定酯酶EstlS活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：1用二甲基亚砜DMS0配制200mM的对硝基苯酚酯；2在1ml反应体系中加980yl50mMTris-HClBuffer100mMNaCl，50mMTris-HC1，0.3%VVTritonX-100，pH8.0,10yl对硝基苯酚酯，10yl纯酶液稀释100倍后的浓度0.012276ygyl;3使用分光光度计在400nm吸光度下检测游离的对硝基苯酚的含量，在该条件下测定对硝基苯酚含量的消光系数为16,642M-icnf1即e=16,642M—icm—巧。酶活性单位的定义是在标准条件下25°C，101.325kPa每分钟生成1wnol对硝基苯酚所需的酶量。[0032]实施例5:酯酶Estl8的底物特异性分析按照4.3的测定条件，比较酯酶EstlS水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯的活性。底物采用对硝基苯乙酸酯C2、对硝基苯丁酸酯C4，对硝基苯辛酸酯C8。结果表明，EstlS对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯具有催化活性，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯C4时催化活性最局。[0033]实施例6:酯酶Estl8的最适反应条件分析酯酶Est18的最适反应pH在4.0〜11.0范围内测定。配制不同的缓冲溶液，其中HAc-他八。缓冲液？11为4.0-6.0，12即〇3-趼2?〇3缓冲液？!1为6.0-8.0，！138〇3-恥出4〇7缓冲液pH为7.4-9.0，Na2C〇3-NaHC03缓冲液pH为9.0-11_0。这些不同pH的缓冲溶液浓度均为50mM。将4.3中测定条件所述的缓冲液（Tris-HClbuffer用配制的缓冲溶液分别进行替换，测定重组酯酶EstlS的酶活力,底物为对硝基苯酚丁酸酯。pH对重组酯酶EstlS活性的影响结果见图3。在50mM的H3BO3-Na2B4〇7缓冲液pH8.0时，酯酶Estl8的酶活性最高，pH值在7.0-11.0之间有较高的酶活性。当pH低于7.0时，其活性迅速降低图2酯酶Estl8的最适反应温度在20〜70°C范围内测定。使用4.3中测定条件所述的50mM缓冲液Tris-HClbufferpH8.0作为缓冲液，对硝基苯酚丁酸酯作为底物，按照4.3中的反应体系，在不同温度下测定酶活。结果表明，EstlS为低温酶，温度越低反应速度越高，在2〇_45°C间的酶活力达80%以上，温度大于50°C时酶活性急剧下降（图3。[0034]实施例7:酯酶Estl8酶学稳定性分析酯酶Est18的热稳定性在20〜50°C范围内测定。将纯化后的酶液分别保温在2〇、3〇、40、45和50°C下，间隔一定时间取出按4.3所示检测方法测定酶活性，结果见图4。酯酶EstlS随着处理温度的升高，酯酶残余酶活力逐渐下降，当温度高于50°C时酶活性急剧降低，在50°C处理5min后，残余酶活力基本丧失（图4。二价阳离子酯酶EstlS活性影响的测定。在反应体系中分别加入1mM的Fe2+、Zn2+、Cu2+、皿112+、02+^82+、則2+和：〇2+，在室温下孵育201^11，按4.3测定方法（以对硝基苯酚丁酸酯作为底物测定相对酶活，以未添加任何离子的反应体系中的酶活力为100%。结果表明，与对照相比，低浓度的Fe2+、Zn2+和Cu2+对酯酶催化对硝基苯酚丁酸酯的活力有不同程度的抑制作用。而Mn2+对酯酶Estl8酶活力的影响很小，低浓度Ca2+、Mg2+、Ni2+和Co2+对酯酶Estl8酶活力有增强效果图5。[0035]有机溶剂和变性剂等对Est18活性影响的测定。在反应体系中分别加入15%vv和30%vv有机溶剂（甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和二甲基亚砜DMS0、1%变性剂十二烷基硫酸钠SDS、吐温2〇及螯合剂（10%EDTA孵育20min后，按4.3测定方法（以对硝基苯酚丁酸酯作为底物测定相对酶活，以原始反应体系中的酶活力为100%。结果表明，所测有机溶剂对EstlS的活性有不同程度的抑制，且随着有机溶剂浓度的增大，抑制程度增强。变性剂对酶活的抑制是非常强烈的，加入1%的SDS孵育20min后仅剩下0.14%的活性。但是Estl8在螯合剂EDTAI22%存在下酶活性有较大的增加图6。

权利要求：1.一种低温碱性酯酶Estl8,其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.—种低温碱性酯酶基因esti8,编码权利要求1所述的低温碱性酯酶Estl8，其特征在于，对应的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.携带权利要求2所述的低温碱性酯酶基因的重组载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-30b㈩。4.包含权利要求2或3所述低温碱性酯酶基因estiS的重组菌株。5.根据权利要求4的重组菌株，其特征在于，所述菌株为细菌、酵母或动物细胞。6.—种包含Estl8低温碱性醋酶编码基因的大肠埃希氏菌Escherichiacoli，其保藏编号为CCTCCM2017317。7.—种制备低温碱性酯酶Est18的方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求3所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；回收并纯化所表达的酯酶Estl8。8.如权利要求1所述低温碱性酯酶Estl8在催化酯类水解、酯化或转酯化反应中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的酯类为短链酯类。

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