申请/专利权人：江苏省农业科学院

申请日：2017-06-29

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN107118256B

主分类号：C07K1/14(20060101)

分类号：C07K1/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2017.09.29#实质审查的生效;2017.09.01#公开

摘要：本发明公开了一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其包括以下步骤：步骤一，将脱脂处理后的鲢鱼肝脏加入磷酸缓冲液进行超声预处理；超声频率24kHz，超声功率50‑100W，处理时间为3‑7min；步骤二，进行灭酶处理，之后离心制得上清液和残渣；步骤三，取上清液透析，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；步骤四，取残渣加入NaOH溶液水浴灭酶15‑25min；离心制得二次上清液；将二次上清液在pH8.0的Tris‑HCl缓冲液中透析78h，其中每8‑12h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白。本发明利用超声辅助缓冲溶液提取和碱提鲢鱼肝脏蛋白，操作简单，处理时间短，蛋白得率较高且所得两种蛋白的抗氧化活性较好。

主权项：1.一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将脱脂处理后的鲢鱼肝脏加入磷酸缓冲液进行超声预处理；超声频率24kHz，超声功率50-100W，处理时间为3-7min；步骤二，进行灭酶处理，之后离心制得上清液和残渣；步骤三，取上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；步骤四，取残渣加入残渣体积的10-20倍0.1M的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为150-300rpmmin，提取8-16h后，在90-100℃水浴锅中灭酶15-25min；之后离心制得二次上清液；将二次上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，其中每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白。

全文数据：抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种蛋白制备方法。更具体地说，本发明涉及一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法。背景技术[0002]我国淡水水域广阔、江河纵横、湖泊密布，是世界上淡水水面最多的国家之一。作为全球淡水鱼生产消费大国，中国近几年在淡水渔业方面一直处于持续增长阶段。在淡水养殖鱼类产量中，草鱼最高为537.68万吨；鲢鱼位居第二，为422.60万吨。现有的淡水鱼加工主要集中于鱼糜及鱼糜制品，切割加工后会产生大量的副产物，如鱼腹部、鱼头以及鱼内脏，约占原料鱼的40%〜55%，其中含有丰富的蛋白质以及大量的脂肪，如果不对其进行及时有效的加工处理，会造成资源的浪费和环境的污染。目前加工副产物对鲢鱼肝脏的综合利用低且品质较差，附加产值低。并且大部分的鲢鱼肝脏被丢弃，或是加工粗糙，精深加工品相当少。鲢鱼肝脏加工程度低的主要原因是鱼体水分含量高，组织酶活跃，难储藏，并且带有浓重的鱼腥味;将鲢鱼肝脏进行大批量的深加工目前还存在技术问题。这些问题都极大地制约了鲢鱼肝脏产品的开发利用。因此，对鲢鱼肝脏进行开发利用可增加产业附加值、降低资源损耗，在我国具有十分重要的意义。发明内容[0003]本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。[0004]本发明还有一个目的是提供一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，利用超声辅助缓冲溶液提取和碱提鲢鱼肝脏蛋白，操作简单，处理时间短，蛋白得率较高且所得两种蛋白的抗氧化活性较好。[0005]为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其包括以下步骤：[0006]步骤一，将脱脂处理后的鲢鱼肝脏加入磷酸缓冲液进行超声预处理；超声频率24kHz，超声功率50-100W，处理时间为3-7min;[0007]步骤二，进行灭酶处理，之后离心制得上清液和残渣；[0008]步骤三，取上清液在PH8.0的TriS-HCl缓冲液中透析78h，每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；[0009]步骤四，取残渣加入10-20倍0.IM的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为150-300rmpmin，提取8-16h后，在90-100°C水浴锅中灭酶15-25min;之后离心制得二次上清液;将二次上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，其中每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白。[0010]优选的是，所述步骤一中脱脂处理具体为:按照体积比为1:5的比例加入10%异丙醇进行脱脂，时间为2CK24h。[0011]优选的是，所述步骤一中所述超声预处理具体为:将脱脂后的鲢鱼肝脏按照体积比1:10-20的比例加入磷酸缓冲液，pH7.0〜9.0，搅拌均匀，于超声频率24kHz下，超声功率50-100W时，预处理肝脏3-7min。[0012]优选的是，所述灭酶处理具体为：将超声预处理后的溶液密封置于集热式恒温振荡器中，转速为150-300rmpmin，提取8-16h后，在90-100°：水浴锅中灭酶15-251^11。[0013]优选的是，所述步骤三和步骤四中透析时选用的透析袋的截留分子量为300Da。[0014]优选的是，所述步骤二中，离心的转速是4000rmpmin;离心时间为10_20min。[0015]本发明至少包括以下有益效果:本发明所述抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法利用超声辅助缓冲溶液提取和碱提鲢鱼肝脏蛋白，操作简单，处理时间短，蛋白得率较高且所得两种蛋白的抗氧化活性较好。本发明利用超声波产生空穴现象而形成的剪切力使被处理的鲢鱼肝脏组织遭到破坏变的膨松，有利于后续提取的进行；利用超声适当的物理预处理能破坏蛋白质的凝聚状态、改变蛋白质分子的高级结构，使蛋白更加均匀分布于体系中，蛋白分子变得更加舒展，溶解度增加，疏水基团暴露。超声辅助提取的鲢鱼鱼肝蛋白在分子量、黏度上都小于传统缓冲和碱提方法。[0016]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式[0017]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。[0018]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。[0019]本发明提供一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其包括以下步骤：[0020]步骤一，将脱脂处理后的鲢鱼肝脏加入磷酸缓冲液进行超声预处理；超声频率24kHz，超声功率50-100W，处理时间为3-7min;[0021]步骤二，进行灭酶处理，之后离心制得上清液和残渣；[0022]步骤三，取上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；[0023]步骤四，取残渣加入10-20倍0.IM的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为150-300rmpmin，提取8-16h后，在90-100°C水浴锅中灭酶15-25min;之后离心制得二次上清液;将二次上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，其中每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白。[0024]在其中一个实施例中，所述步骤一中脱脂处理具体为:按照体积比为1:5的比例加入10%异丙醇进彳丁脱脂，时间为2〇-2411。[0025]在其中一个实施例中，所述步骤一中所述超声预处理具体为:将脱脂后的鲢鱼肝脏按照体积比1:10-20的比例加入磷酸缓冲液，pH7.0〜9.0，搅拌均匀，于超声频率24kHz下，超声功率50-100W时，预处理肝脏3-7min。[0026]在其中一个实施例中，所述灭酶处理具体为:将超声预处理后的溶液密封置于集热式恒温振荡器中，转速为150-300rmpmin，提取8-16h后，在90-100°C水浴锅中灭酶15-25min〇[0027]在其中一个实施例中，所述步骤三和步骤四中透析时选用的透析袋的截留分子量为300Da。[0028]在其中一个实施例中，所述步骤二中，离心的转速是4000rmpmin;离心时间为10-20min〇[0029]实施例1[0030]本发明所述抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：[0031]1取冷冻的鲢鱼肝脏，4°C下解冻，称取IOOg原料于500mL的锥形瓶中，加入10%的异丙醇IOOmL脱脂24h后；[0032]2再加入IOOOmL的磷酸缓冲液PBS，pH7.0〜9.0，搅拌均匀，先于超声频率24kHz下，超声功率50W时，预处理肝脏7min;[0033]3然后用保鲜膜密封置于集热式恒温振荡器中，转速为150rmpmin，提取8h后，在100°C水浴锅中灭酶15min;[0034]4然后在400〇1'11^|111；[11离心10111；[11，取上清液，在口!18.0的1'1^8-!1]1缓冲液中透析78h每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；透析袋截留分子量为300Da。[0035]5离心后的残渣再加入残渣体积的10倍0.IM的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为150rmpmin，提取8h后，在100°C水浴锅中灭酶15min，再在4000rmpmin离心IOmin，取上清液；[0036]6在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h透析袋300Da每8h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白，于_2〇°C下保存备用。[0037]实施例2[0038]本发明所述抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：[0039]1取冷冻的鲢鱼肝脏，4°C下解冻，称取IOOg原料于500mL的锥形瓶中，加入10%的异丙醇IOOmL脱脂24h后;得脱脂溶液[0040]2再加入脱脂溶液体积20倍的磷酸缓冲液PBS，pH9.0，搅拌均匀，先于超声频率24kHz下，超声功率100W时，预处理肝脏3min;[0041]3然后用保鲜膜密封置于集热式恒温振荡器中，转速为300rmpmin，提取16h后，在90°C水浴锅中灭酶25min;[0042]4然后在400〇1'11^|111；[11离心20111；[11，取上清液，在口!18.0的1'1^8-!1]1缓冲液中透析78h透析袋300Da每12h更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；[0043]5离心后的残渣再加入20倍0.IM的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为300rmpmin，提取16h后，在90°C水浴锅中灭酶15min，再在4000rmpmin离心20min，取上清液；[0044]6在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h透析袋300Da每12h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白，于_2〇°C下保存备用。[0045]实施例3[0046]本发明所述抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：[0047]1取冷冻的鲢鱼肝脏，4°C下解冻，称取IOOg原料于500mL的锥形瓶中，加入10%的异丙醇IOOmL脱脂24h后；[0048]2再加入3000mL的磷酸缓冲液PBS，pH7.0〜9.0,搅拌均匀，先于超声频率24kHz下，超声功率80W时，预处理肝脏6min;[0049]3然后用保鲜膜密封置于集热式恒温振荡器中，转速为150rmpmin，提取IOh后，在100°C水浴锅中灭酶20min;[0050]4然后在400〇1'11^|111；[11离心15111；[11，取上清液，在口!18.0的1'1^8-!1]1缓冲液中透析78h透析袋300Da每IOh更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；[0051]5离心后的残渣再加入15倍0.IM的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为150-300rmpmin，提取IOh后，在100°C水浴锅中灭酶20min，再在4000rmpmin离心15min，取上清液；[0052]6在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h透析袋300Da每IOh更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白，于_2〇°C下保存备用。[0053]对比例1[0054]采用传统的缓冲和碱提方法制备缓冲液提取蛋白和碱提蛋白。其中加入缓冲液后于恒温振荡器中，提取24_48h。[0055]将实施例1、2、3和对比例1制得的缓冲液提取蛋白和碱提蛋白，按照下面方法分别进行检测：[0056]—，按照公式⑴计算鲢鱼肝脏分离蛋白的得率，结果如下：[0057]肝脏蛋白得率1[0058]二，抗氧化测定[0059]DDPPH自由基清除率的测定[0060]蛋白水解物用去离子水溶解后配成浓度为1〜6mgmL。用95%乙醇现配0.lmmolL的DPPH，等量ImL的多肽加入ImL的乙醇，再加入ImL的DPPH溶液于比色皿中。振动混匀后在37°C水浴中避光反应0.5h。于波长517nm处测吸光度A1。乙醇作为空白测定吸光度A2JC作阳性对照。DPPH自由基清除率计算如式2所示：[0061]DPPH自由基清除率（2[0062]式中:A1为实验组吸光度;A2为空白组吸光度。[0063]2ABTS自由基清除率的测定[0064]IABTS自由基溶液的配制：取0.IgABTS和0.029g过硫酸钾溶于IOOmL磷酸钠缓冲液，混合后于25°C避光反应16h备用，实验时取2mL该反应液，加入ISmL磷酸钠缓冲液，配成ABTS储备液，避光保存当日备用。ABTS储备液再用磷酸钠缓冲液稀释，于波长734nm处测吸光度在0.85左右，即为ABTS工作液，当日现配使用。[0065]2测定方法:分别取0.ImL样品液，加入3.9mLABTS工作液，混合均匀。混合液于室温下静置l〇min，于波长734nm处测定吸光度Al，以试样溶剂代替样品溶液测定空白吸光度AO，以磷酸钠缓冲液代替ABTS工作液测得吸光度A2，实验平行做三次，VC作阳性对照。ABTS自由基清除率计算如式⑶所示：[0066]自由基清除率3[0067]式中=A1为实验组吸光度;A2为对照组吸光度;Ao为空白组吸光度。[0068]结果如下:表1，各实施例鲢鱼肝脏缓冲液蛋白的参数「00691[0070]由上表可知，本发明所述抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法中，实施例1中鲢鱼肝脏缓冲液提蛋白得率为47.6%，蛋白纯度为65.3%。其远远高于对比例1中的蛋白得率和蛋白纯度。而且本发明鲢鱼肝脏缓冲液提蛋白所用时间更短。[0071]表2，各实施例鲢鱼肝脏碱提蛋白的各参数[0073]从上表中可以看出，鲢鱼肝脏碱提蛋白得率为10.9%，蛋白纯度为56.3%。在抗氧化实验中，两种鱼肝蛋白对DPPH自由基清除率的EC5q值分别为1·18mgmL和1·49mgmL;对ABTS自由基清除率的EC5q值分别为1.21mgmL和3.74mgmL，结果表明，两种鱼肝蛋白均具有较好的抗氧化活性。[0074]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

权利要求：1.一种抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将脱脂处理后的鲢鱼肝脏加入磷酸缓冲液进行超声预处理;超声频率24kHz，超声功率50-100W，处理时间为3-7min;步骤二，进行灭酶处理，之后离心制得上清液和残渣；步骤三，取上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得缓冲液提取蛋白；步骤四，取残渣加入10-20倍O.IM的NaOH溶液，置于水浴摇床中恒温振荡，转速为150-300rmpmin，提取8-16h后，在90-100°C水浴锅中灭酶15-25min;之后离心制得二次上清液；将二次上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析78h，其中每8-12h更换一次透析液，冷冻干燥得碱提蛋白。2.如权利要求1所述的抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一中脱脂处理具体为:按照体积比为1:5的比例加入10%异丙醇进行脱脂，时间为20-24h。3.如权利要求1所述的抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一中所述超声预处理具体为:将脱脂后的鲢鱼肝脏按照体积比1:10-20的比例加入磷酸缓冲液，pH7.0〜9.0，搅拌均匀，于超声频率24kHz下，超声功率50-100W时，预处理肝脏3-7min。4.如权利要求1所述的抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，所述灭酶处理具体为:将超声预处理后的溶液密封置于集热式恒温振荡器中，转速为150-300rmpmin，提取8-16h后，在90-100°：水浴锅中灭酶15-2511^11。5.如权利要求1所述的抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四中透析时选用的透析袋的截留分子量为300Da。6.如权利要求1所述的抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，离心的转速是4000rmpmin;离心的时间为10_20min。

百度查询： 江苏省农业科学院 抗氧化鲢鱼肝脏蛋白的制备方法

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