申请/专利权人：顾万君;钱中清

申请日：2017-09-21

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN107523626B

主分类号：C12Q1/6883(20180101)

分类号：C12Q1/6883(20180101);C12N15/113(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2020.08.28#著录事项变更;2020.08.07#专利申请权的转移;2018.06.01#专利申请权的转移;2018.01.26#实质审查的生效;2017.12.29#公开

摘要：本发明公开了一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物，并且根据该组外周血基因标记物设计引物，所设计的引物可用于活动性肺结核的无创诊断。本发明可有效区分肺结核病人与正常人群、肺结核病人与其他肺部疾病人群、肺结核病人与潜在肺结核感染个人，并可作为检测抗结核疗效的指标，其检测方便、无创、准确性高、特异性强、稳定性好，适于推广使用。

主权项：1.一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述mRNA标记物包括以下基因：ALDH1A1；ANKRD22；APOL2；BTN3A1；CD74；DDX60；EPSTI1；FAM26F；FBXO6；FCGR1A；FCGR1B；FCGR1C；FER1L3；GBP1；GBP4；GBP5；GCH1；GPBAR1；HERC5；IFI35；IFI44；IFI44L；IFI6；IFIT1；IFIT3；IFIT5；IFITM3；ISG15；LAP3；LY6E；MOV10；MT2A；MYOF；OAS1；OAS2；OAS3；PARP14；PSMB9；PSME2；RARRES3；RSAD2；RTP4；SAMD9L；SCO2；SEPT4；SOCS1；SP140；STAT1；STAT2；TRIM22；UBE2L6；VAMP5；WARS；WDFY1；XAF1和ZBP1。

全文数据：一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物技术领域[0001]本发明涉及基因检测领域，具体地说，涉及一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物及其应用。背景技术[0002]根据世界卫生组织的统计，2010年全世界新发肺结核880万；2010年我国结核病发患者数约130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位，是全球结核病流行严重的国家之一。肺结核不仅具有较高的发病率，其诊治也具有一定的困难。目前常见的肺结核的诊断办法主要基于痰结核检查结合影像学技术，如胸部X线检查、胸部CT等。然而，痰结核菌检测的敏感性不高，影像学技术在临床上很难区分肺结核和肺癌以及肺炎等其他肺部感染疾病。例如，肺结核患者通常会被诊断为肺癌，从而导致正确诊断的推迟，造成不合适的治疗。因此，在现有诊断方法基础上开发一种无创检测技术，能够在临床上区分肺结核患者和正常人群以及患有其他肺部疾病的疑似患者，具有重要的意义。[0003]对外周循环血中的核酸或者蛋白质的检测为临床提供了一种很好的无创检测技术。疾病发生的早期，机体免疫系统就可特异性识别外源细菌或者病毒，从而在免疫细胞内产生异常表达基因产物。因此，在疾病发生初期就可以在外周循环血中检测到机体对外源细菌或者病毒进行免疫作用的信号。这种方法具有易操作、检测成本低和所检测信号背景噪声小等优势，具有很好的应用前景。[0004]因此，亟待设计一种基于外周循环血中特异表达基因的肺结核检测模型。发明内容[0005]基于现有技术的不足，本发明提供一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物及其应用，其具有检测稳定性高、准确性高和特异性高的特点。[0006]本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：[0007]一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物，其特征在于:所述mRNA标记物包括以下基因：ALDH1A1;ANKRD22;AP0L2;BTN3A1;CD74;DDX60;EPSTI1;FAM26F;FBX06;FCGR1A；FCGR1B；FCGR1C；FER1L3；GBP1；GBP4；GBP5；GCH1；GPBAR1；HERC5；IFI35；IFI44；IFI44L；IFI6；IFITl；IFIT3；IFIT5；IFITM3；ISG15；LAP3；LY6E；M0V10；MT2A；MY0F；OASl；0AS2；0AS3；PARP14；PSMB9；PSME2；RARRES3；RSAD2；RTP4；SAMD9L；SC02；SEPT4；SOCSl；SP140;STATl;STAT2;TR頂22;UBE2L6;VAMP5;WARS;WDFYl;XAFl和ZBPl。[0008]进一步地，如上所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。[0009]进一步地，如上所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物的引物，其特征在于:所述引物如序列表SEQIDNO.I-SEQIDNO.112所示。[0010]进一步地，如上所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物的引物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。[0011]—种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括如上所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物的引物。[0012]进一步地，所述试剂盒还包括PCR技术常用试剂，所述PCR技术常用试剂包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶。[0013]进一步地，所述试剂盒还包括标准品和或对照品。[0014]有益效果:本发明公开了一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物，并且根据该组外周血基因标记物设计引物，所设计的引物可用于活动性肺结核的无创诊断。本发明可有效区分肺结核患者与正常人群、肺结核患者与其他肺部疾患者群、肺结核患者与潜在肺结核感染个人，并可作为检测抗结核疗效的指标，其检测方便、无创、准确性高、特异性强、稳定性好，适于推广使用。附图说明[0015]图1为本发明外周血基因标记物的56个基因在不同组别中的基因表达；[0016]其中，HC为正常人群，PN为肺炎患者，LC为肺癌患者，TB为肺结核病患者；[0017]图2为与本发明外周血基因标记物的56个基因最相关的前十个GO生物过程。[0018]其中，P值是基于Fisher’s精确检验得到的P值，虚线表示经过Benjamini-Hochberg过程校正后得到的显著性水平为0.05。[0019]图3为基于发现数据集中56个基因的表达量进行的主成分分析PCA;[0020]其中，PCl和PC2分别为第一维主成分和第二维主成分;HC为正常人群，PN为肺炎患者，LC为肺癌患者，TB为肺结核病患者。[0021]图4为本发明外周血基因标记物在验证数据集中区分肺结核患者和非肺结核个体的表现；[0022]图A-D分别为本发明外周血基因标记物在BL、CA、BE和AN人群中区分肺结核患者和非肺结核个体的区分表现；在每一个人群中，左图显不了56个基因表达量的主成分分析PCA;PCl和PC2分别为第一维主成分和第二维主成分;TB为肺结核病患者，CTR为非肺结核个体;右图显示本发明外周血基因标记物区分肺结核患者和非肺结核个体的接收操作特征〇?0〇曲线。[0023]图5为本发明外周血基因标记物区分活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体的表现；[0024]图A-C分别为本发明外周血基因标记物在CA、BE和AN人群中区分活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体的区分表现；其中，左图显示了56个基因表达量的主成分分析PCA;PCl和PC2分别为第一维主成分和第二维主成分;TB为活动性肺结核病患者，LTBI为潜在肺结核感染个体;右图显示本发明外周血基因标记物区分活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体的接收操作特征ROC曲线。[0025]图6为本发明外周血基因标记物在BL人群中区分肺结核患者和肺炎患者的表现；[0026]其中，左图显示了56个基因表达量的主成分分析PCA;PC1和PC2分别为第一维主成分和第二维主成分;TB为肺结核病患者，PN为肺炎患者;右图显示本发明外周血基因标记物区分肺结核患者和肺炎患者的接收操作特征ROC曲线。[0027]图7为本发明外周血基因标记物在BL人群中区分肺结核患者和肺癌患者的表现；[0028]其中，左图显示了56个基因表达量的主成分分析PCA;PC1和PC2分别为第一维主成分和第二维主成分;TB为肺结核病患者，LC为肺癌患者;右图显示本发明外周血基因标记物区分肺结核患者和肺癌患者的接收操作特征ROC曲线。[0029]图8为本发明外周血基因标记物监测肺结核治疗效果的表现；[0030]图A和B分别为CA和BE人群中活动性肺结核患者接受抗结核药物治疗后肺结核得分的变化。[0031]图9为本发明外周血基因标记物与随机基因集合的预测区分能力；[0032]其中，深灰色区间表示从全基因组中随机挑选56个基因1000次在BL、CA、BE和AN人群中进行活动性肺结核诊断所得到的AUC均值的分布；[0033]浅灰色区间表示从393个基因中随机挑选56个基因1000次在BL、CA、BE和AN人群中进行活动性肺结核诊断所得到的AUC均值的分布；[0034]黑色三角点表示本发明外周血基因标记物集合在BL、CA、BE和AN人群中进行活动性肺结核诊断所得到的AUC均值;图中显示了样本右侧检验得到的P值。具体实施方式[0035]下面结合实施例对本发明作进一步详述：[0036]实施例1:一组包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物的筛选[0037]为了筛选肺结核诊断标记物，本发明先对一个用于发现肺结核诊断标记物人群外周循环血的全基因表达数据进行分析。其中，用来发现基因标记物的人群包括38个正常人、8个患有肺炎的患者、8个患有肺癌的患者和16个患有肺结核病的患者。[0038]首先，本发明对肺结核患者和正常人群的外周血全基因表达进行比较，筛选出肺结核患者和正常人群的外周血中出现差异表达的基因，利用SAM算法实现两个人群中的基因表达差异分析，并利用q值方法控制所找到差异表达基因的假阳性率FalseDiscoveryRate，FDR。比较过程中，选取表达水平倍数变化大于2倍同时HR小于0.05作为筛选差异表达基因的标准。通过比较发现，与正常人群相比，肺结核患者的外周循环血中有292个基因表达上调。[0039]另外，对肺结核患者和肺炎患者外周循环血的全基因表达水平进行比较，发现肺结核患者中有217个基因的表达出现上调。[0040]进一步地，对肺结核患者和肺癌患者外周循环血中的基因表达水平进行比较，发现肺结核患者的外周循环血中有114个基因的表达出现上调。[0041]根据上述肺结核患者和其它人群外周循环血的基因表达水平的两两比较结果，进一步筛选在上述肺结核患者和其他三种人群间比较中同时出现的差异表达基因。通过筛选，共发现56个基因在上述三组不同人群的比较中同时出现了差异表达。[0042]将56个基因作为一组诊断肺结核的标记物，各基因信息见表1，各基因在四组不同人群外周循环血中的基因表达量见图1。[0043]表1[0044][0046][0047]如图2所示，对本发明所筛选出的包含56个基因的标记物进行基因本体（GeneOntology，GO分析，其主要包含与免疫应答相关的功能基因。由此可见，这些功能基因的差异表达可能与机体对肺结核的免疫应答相关。[0048]如图3所示，对发现人群外周循环血中56个基因的表达量进行主成分分析PrincipalComponentAnalysis，PCA，结果显示第一维主成分PCl能够很好的区分肺结核患者与正常人群以及其它肺部疾病患者。由此可见，本发明所筛选出的外周血基因标记物能够很好的区分肺结核患者和非肺结核个体。[0049]实施例2:—组包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物在独立人群中的验证[0050]本发明获取了另外多个人群个体的外周血中所有56个基因标记物的基因表达数据，以验证包含56个基因的外周血基因标记物区分肺结核患者和非肺结核个体、活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体、肺结核患者和肺炎患者以及肺结核患者和肺癌患者的有效性。[0051]从公共数据库GEO中（http:www.ncbi.nih.nlm.govgeo下载了BL人群GE0编号：GSE42826、CA人群GE0编号：GSE54992、BE人群GE0编号：GSE19491和AN人群GE0编号:GSE39939相关个体外周血中所有基因的表达数据。上述新下载的不同人群与用于标记物发现的人群完全独立。[0052]为了更好地估计56个基因标记物在不同验证人群中区分肺结核患者和非肺结核个体的能力，本发明提出一种基于待诊断个体外周血中56个基因标记物的表达水平计算个体肺结核风险值的方法。肺结核风险值的计算如公式1所示。[0053][0054]公式1中，S为最终得到的个体患肺结核的风险值;η为56个基因标记物中基因个数，这里等于56;ei为基因i在所测个体中的表达量;μθΡη分别为基因i在所有检测个体中表达量的均值和标准差。[0055]个体的高肺结核风险值代表该检测个体具有较高的患有肺结核的可能性。基于上述肺结核风险值计算方法和不同验证人群的每一个个体外周血中56个基因标记物的基因表达量，对不同人群中所有个体的肺结核风险值进行计算。[0056]1包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物区分肺结核患者和非肺结核个体[0057]如图4所示，对上述四种不同验证人群的外周循环血中56个基因标记物的基因表达量进行主成分分析，结果表明第一维主成分能较好的区分肺结核患者和其他种类的检测个体。比较不同验证人群中所有个体的肺结核风险值发现，肺结核患者的肺结核风险值明显比非肺结核个体的肺结核风险值高t检验:BL验证人群，P值=4.;CA验证人群，P值=7.0*10—4;BE验证人群，P值=8.4*10—14;AN验证人群，P值=7.7*10—5。基于肺结核风险值的预测ROCReceiverOperatingCharacteristic曲线下的面积为0.998BL人群）、0·963CA人群）、0.897BE人群和0.710AN人群），可见本发明所提供的56个基因肺结核标志物在不同独立人群中能够较好区分肺结核患者和非肺结核个体。[0058]2包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物区分活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体[0059]如图5所示，对上述三种不同验证人群CA人群、BE人群和AN人群）的外周循环血中56个基因标记物的基因表达量进行主成分分析，结果表明第一维主成分能较好的区分活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体。比较不同验证人群中所有个体的肺结核风险值发现，活动性肺结核患者的肺结核风险值明显比潜在肺结核感染个体的肺结核风险值高t检验:CA验证人群，P值=2.7*10—2;BE验证人群，P值=1.6*10—8;AN验证人群，P值=1.2*10—5。[0060]基于肺结核风险值的预测ROCReceiverOperatingCharacteristic曲线下的面积为0.833CA人群）、0.776BE人群和0.791AN人群），可见本发明所提供的56个基因肺结核标志物在不同独立人群中能够较好区分活动性肺结核患者和潜在肺结核感染个体。[0061]3包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物区分肺结核患者和肺炎患者[0062]如图6所示，对上述一种验证人群BL人群）的外周循环血中56个基因标记物的基因表达量进行主成分分析，结果表明第一维主成分能较好的区分肺结核患者和肺炎患者。[0063]比较该验证人群中所有个体的肺结核风险值发现，肺结核患者的肺结核风险值明显比肺炎患者的肺结核风险值高（t检验，P值=4.6*10,。基于肺结核风险值的预测ROCReceiverOperatingCharacteristic曲线下的面积为0.985,可见本发明所提供的56个基因肺结核标志物在独立人群中能够较好区分肺结核患者和肺炎患者。[0064]⑷包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物区分肺结核患者和肺癌患者[0065]如图7所示，对上述一种验证人群BL人群）的外周循环血中56个基因标记物的基因表达量进行了主成分分析，结果表明第一维主成分能较好的区分肺结核患者和肺癌患者。比较该验证人群中所有个体的肺结核风险值发现，肺结核患者的肺结核风险值明显比肺癌患者的肺结核风险值高（t检验，P值=3.8*1Γ3。基于肺结核风险值的预测ROCReceiverOperatingCharacteristic曲线下的面积为0.886,可见本发明所提供的56个基因肺结核标志物在独立人群中能够较好区分肺结核患者和肺癌患者。[0066]5包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物评价抗结核药物的治疗效果[0067]上述两个验证人群CA人群和BE人群）中具有接受抗结核治疗的肺结核患者的外周循环血中基因表达数据。其中，CA人群中包含9个跟踪肺结核治疗过程的患者信息，BE人群中包含7个跟踪肺结核治疗过程的患者信息。[0068]进一步地，对这部分患者随着抗结核治疗的过程中通过外周血56个基因表达得到的肺结核风险值的变化进行计算。如图8所示，这两个人群中相关肺结核患者基于外周血56个基因标记物得到的个体肺结核风险值随着抗结核药物的治疗过程逐渐降低。[0069]在CA人群中，肺结核患者接受三个月的抗结核药物治疗后肺结核风险值低于未接受治疗时的肺结核风险值pairedt检验，P值=8.8*1Γ2。同时，肺结核患者接受六个月抗结核药物治疗后肺结核风险值显著低于接受三个月抗结核药物治疗后的肺结核风险值pairedt检验，P值=7.3*10—4。[0070]在BE人群中发现了类似的结果。肺结核患者接受两个月的抗结核药物治疗后肺结核风险值低于未接受治疗时的肺结核风险值pairedt检验，P值=3.6*1Γ3。同时，肺结核患者接受十二个月抗结核药物治疗后肺结核风险值显著低于接受两个月抗结核药物治疗后的肺结核风险值pairedt检验，P值=3.3*1Γ2。上述结果表明，本发明发现的基于56个基因标记物的外周血肺结核风险值能够作为检测抗结核疗效的指标。[0071]6包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物与随机挑选的基因标记物的区分度比较[0072]—些研究表明，很多基因标记物对于疾病的诊断能力并不比随机挑选的一些由同样个数基因组成的标记物的区分度好。为了验证本发明外周血基因标记物比其它随机挑选的56个基因诊断标记物具有更好的区分度，从人类基因组中随机选取56个基因，根据随机选择出的56个基因的表达量计算肺结核风险值，然后比较随机选择的56个基因标记物的肺结核诊断能力。[0073]重复上述随机选择和肺结核诊断过程共1000次，并记录每次肺结核诊断的AUCAreaUnderROCCurve值。如图9所示，本发明外周血基因标记物的AUC值显著大于1000次随机选择的56个基因的肺结核诊断标记物的AUC值右侧P值〈0.001。可见，本发明所选取的包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物具有很好的特异性。[0074]7包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物与现有肺结核基因标记物的区分度比较[0075]Berry等人（Berryetal·,Nature2010,466:973-977发表了一组包含393个转录本的肺结核诊断标记物。为了验证本发明外周血基因标记物比Berry等人发表的基因诊断标记物具有更好的区分度，从Berry等人发表的393个转录本中随机选取56个基因转录本，根据随机选择出的56个基因的表达量计算肺结核风险值，然后比较随机选择的56个基因标记物的肺结核诊断能力。[0076]重复上述随机选择和肺结核诊断过程共1000次，并记录每次肺结核诊断的AUCAreaUnderROCCurve值。如图9所示，本发明外周血基因标记物的AUC值显著大于1000次从Berry等人发表的393个转录本中随机选择的56个基因转录本的肺结核诊断标记物的AUC值右侧P值〈0.001。由此可见，本发明所选取的包含56个基因的肺结核诊断外周血基因标记物比Berry等人所发表的393个转录本标记物具有更好的区分度。[0077]实施例3:基于56个基因标记物的肺结核诊断试剂盒[0078]基于本发明鉴定和验证的用于外周血肺结核诊断的56个基因标记物，设计用于扩增每一个基因的正向和逆向引物，如序列表SEQIDNO.I-SEQIDNO.112所示，其中：[0079]SEQIDNO.1与SEQIDNO.2分别为ALDH1A1的正向引物和逆向引物；[0080]SEQIDNO.3与SEQIDNO.4分别为ANKRD22的正向引物和逆向引物；[0081]SEQIDNO.5与SEQIDNO.6分别为AP0L2的正向引物和逆向引物；[0082]SEQIDNO.7与SEQIDNO.8分别为BTN3A1的正向引物和逆向引物；[0083]SEQIDNO.9与SEQIDNO.10分别为CD74的正向引物和逆向引物；[0084]SEQIDNO.11与SEQIDNO.12分别为DDX60的正向引物和逆向引物；[0085]SEQIDNO.13与SEQIDNO.14分别为EPSTIl的正向引物和逆向引物；[0086]SEQIDNO.15与SEQIDNO.16分别为FAM26F的正向引物和逆向引物；[0087]SEQIDNO.17与SEQIDNO.18分别为FBX06的正向引物和逆向引物；[0088]SEQIDNO.19与SEQIDNO.20分别为FCGRlA的正向引物和逆向引物；[0089]SEQIDNO.21与SEQIDNO.22分别为FCGRlB的正向引物和逆向引物；[0090]SEQIDNO.23与SEQIDNO.24分别为FCGRlC的正向引物和逆向引物；[0091]SEQIDNO.25与SEQIDNO.26分别为FER1L3的正向引物和逆向引物；[0092]SEQIDNO.27与SEQIDNO.28分别为GBPl的正向引物和逆向引物；[0093]SEQIDNO.29与SEQIDNO.30分别为GBP4的正向引物和逆向引物；[0094]SEQIDNO.31与SEQIDNO.32分别为GBP5的正向引物和逆向引物；[0095]SEQIDNO.33与SEQIDNO.34分别为GCHl的正向引物和逆向引物；[0096]SEQIDNO.35与SEQIDNO.36分别为GPBARl的正向引物和逆向引物；[0097]SEQIDNO.37与SEQIDNO.38分别为HERC5的正向引物和逆向引物；[0098]SEQIDNO.39与SEQIDNO.40分别为IFI35的正向引物和逆向引物；[0099]SEQIDNO.41与SEQIDNO.42分别为IFI44的正向引物和逆向引物；[0100]SEQIDNO.43与SEQIDNO.44分别为IFI44L的正向引物和逆向引物；[0101]SEQIDNO.45与SEQIDNO.46分别为IFI6的正向引物和逆向引物；[0102]SEQIDNO.47与SEQIDNO.48分别为IFITl的正向引物和逆向引物；[0103]SEQIDNO.49与SEQIDNO.50分别为IFIT3的正向引物和逆向引物；[0104]SEQIDNO.51与SEQIDNO.52分别为IFIT5的正向引物和逆向引物；[0105]SEQIDNO.53与SEQIDNO.54分别为IFITM3的正向引物和逆向引物；[0106]SEQIDNO.55与SEQIDNO.56分别为ISG15的正向引物和逆向引物；[0107]SEQIDNO.57与SEQIDNO.58分别为LAP3的正向引物和逆向引物；[0108]SEQIDNO.59与SEQIDNO.60分别为LY6E的正向引物和逆向引物；[0109]SEQIDNO.61与SEQIDNO.62分别为M0V10的正向引物和逆向引物；[0110]SEQIDNO.63与SEQIDNO.64分别为MT2A的正向引物和逆向引物；[0111]SEQIDNO.65与SEQIDNO.66分别为MYOF的正向引物和逆向引物；[0112]SEQIDNO.67与SEQIDNO.68分别为OASl的正向引物和逆向引物；[0113]SEQIDNO.69与SEQIDNO.70分别为0AS2的正向引物和逆向引物；[0114]SEQIDNO.71与SEQIDNO.72分别为0AS3的正向引物和逆向引物；[0115]SEQIDNO.73与SEQIDNO.74分别为PARP14的正向引物和逆向引物；[0116]SEQIDNO.75与SEQIDNO.76分别为PSMB9的正向引物和逆向引物；[0117]SEQIDNO.77与SEQIDNO.78分别为PSME2的正向引物和逆向引物；[0118]SEQIDNO.79与SEQIDNO.80分别为RARRES3的正向引物和逆向引物；[0119]SEQIDNO.81与SEQIDNO.82分别为RSAD2的正向引物和逆向引物；[0120]SEQIDNO.83与SEQIDNO.84分别为RTP4的正向引物和逆向引物；[0121]SEQIDNO.85与SEQIDNO.86分别为SAMD9L的正向引物和逆向引物；[0122]SEQIDNO.87与SEQIDNO.88分别为SC02的正向引物和逆向引物；[0123]SEQIDNO.89与SEQIDNO.90分别为SEPT4的正向引物和逆向引物；[0124]SEQIDNO.91与SEQIDNO.92分别为S0CS1的正向引物和逆向引物；[0125]SEQIDNO.93与SEQIDNO.94分别为SP140的正向引物和逆向引物；[0126]SEQIDNO.95与SEQIDNO.96分别为STATl的正向引物和逆向引物；[0127]SEQIDNO.97与SEQIDNO.98分别为STAT2的正向引物和逆向引物；[0128]SEQIDNO.99与SEQIDNO.100分别为TRIM22的正向引物和逆向引物；[0129]SEQIDNO.101与SEQIDNO.102分别为UBE2L6的正向引物和逆向引物；[0130]SEQIDNO.103与SEQIDNO.104分别为VAMP5的正向引物和逆向引物；[0131]SEQIDNO.105与SEQIDNO.106分别为WARS的正向引物和逆向引物；[0132]SEQIDNO.107与SEQIDNO.108分别为WDFYl的正向引物和逆向引物；[0133]SEQIDNO.109与SEQIDNO.110分别为XAFl的正向引物和逆向引物；[0134]SEQIDNO.Ill与SEQIDNO.112分别为ZBPl的正向引物和逆向引物。[0135]进一步地，开发包含56个基因所有正向和逆向引物的诊断试剂盒，用于获取外周血样本中56个基因的表达水平。[0136]本发明试剂盒可用于肺结核的无创诊断，其中包括肺结核的早期筛查、肺结核的疗效判断、肺结核的复发监测等。具体实施步骤如下：[0137]1取待测个体的外周循环血，提取全血RNA;[0138]2肺结核诊断试剂盒检测步骤⑴获取的每个待测个体外周血RNA样本中所涉及的56个基因的基因表达量；[0139]3根据步骤2中得到的所有待测个体外周血中56个基因的基因表达量，通过公式1所述的计算方法，计算每个待测个体的肺结核诊断值；[0140]⑷将待测个体的肺结核诊断值用于肺结核诊断。[0141]人全血RNA提取的常用试剂如Trizol，三氯甲烷，异丙醇，糖原，75%DEPC乙醇，0.01%DEPC水等。肺结核诊断试剂盒利用qRT-PCR技术检测外周血RNA样本中所涉及的56个基因的基因表达量，qRT-PCR的常用试剂如随机引物、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、0.01%DEPC水、RNA酶抑制剂、MgCl2、Taq酶、SYBRGreen、Roxtm参比染料等。此外，试剂盒还包括标准品和或对照品。本试剂盒选择β-actin作为内参基因，其上游引物序列为TGACGTGGACATCCGCAAAG;下游引物序列为:CTGGAAGGTGGACAGCGAGG。另外，试剂盒还包括包装材料、印刷的或电子的说明书。说明书包含试剂盒使用操作流程及风险值计算方法。[0142]以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物，其特征在于：所述mRNA标记物包括以下基因：ALDH1A1;ANKRD22;AP0L2;BTN3A1;CD74;DDX60;EPSTI1;FAM26F;FBX06;FCGR1A；FCGR1B；FCGR1C；FER1L3；GBP1；GBP4；GBP5；GCH1；GPBAR1；HERC5；IFI35；IFI44；IFI44L；IFI6；IFITl；IFIT3；IFIT5；IFITM3；ISG15；LAP3；LY6E；M0V10；MT2A；MY0F；OASl；0AS2；0AS3；PARP14；PSMB9；PSME2；RARRES3；RSAD2；RTP4；SAMD9L；SC02；SEPT4；SOCSl；SP140;STATl;STAT2;TR頂22;UBE2L6;VAMP5;WARS;WDFYl;XAFl和ZBPl。2.根据权利要求1所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。3.根据权利要求1所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物的引物，其特征在于:所述引物如序列表SEQIDNO.I-SEQIDNO.112所示。4.根据权利要求3所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物的引物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。5.—种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括权利要求3所述的一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血mRNA标记物的引物。6.根据权利要求5所述的一种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括PCR技术常用试剂，所述PCR技术常用试剂包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶。7.根据权利要求5或6所述的一种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括标准品和或对照品。

百度查询： 顾万君;钱中清 一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物

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