申请/专利权人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

申请日：2017-11-06

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN107988337B

主分类号：C12Q1/686(20180101)

分类号：C12Q1/686(20180101);C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2018.06.01#实质审查的生效;2018.05.04#公开

摘要：本发明属于农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种抗稻瘟水稻鉴定方法和基因的标记方法及其应用，包括如下步骤：检测待测水稻第6号染色体中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基处SNP位点，通过PCR扩增及限制性内切酶酶切对水稻第6号染色体中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基处SNP类型进行鉴定。本发明可以准确判断所选择水稻植株是否含有抗稻瘟病基因Pid2，利用这种方法可以有效地对抗稻瘟病基因pid2基因型选择，既可以用于水稻资源的鉴定筛选，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Pid2的分子育种。

主权项：1.一种抗稻瘟水稻鉴定方法，其特征在于，通过以下步骤来实现：（1）对稻种资源Pid2编码区的等位基因进行PCR扩增及PCR产物测序；（2）在水稻第6号染色体中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基处获得两个Pid2特异性SNP位点；（3）所述两个Pid2特异性SNP位点碱基有三种情况：1）碱基类型为“AT”，2）碱基类型为“GC”，3）碱基类型为“GT”；（4）若待测水稻材料5352和5353位点碱基是“AT”，则该材料为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻；若待测水稻5352和5353位点处碱基碱基类型为“GC”或“GT”，则该水稻材料为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻。

全文数据：一种抗稻瘟水稻鉴定方法和基因的标记方法及其应用技术领域[0001]本发明属于农作物分子遗传育种学领域，涉及一种抗稻瘟水稻鉴定方法和基因的标记方法及其应用。背景技术[0002]水稻是世界上重要的粮食作物，稻瘟病是世界各稻区最为严重的病害之一，严重影响了水稻的产量。由于稻瘟病菌的高度变异性和不稳定性，致使新育成的具有单一抗性基因的抗性品种在推广种植几年后就成为感病品种，这已成为水稻生产可持续发展的重要障碍，挖掘水稻抗性基因资源是抗稻瘟病育种的基础。通过广泛的遗传分析，目前己经鉴定和定位了84个稻瘟病抗性基因，至少24个主效基因已相继被分离克隆。随着水稻DNA测序技术的广泛应用，不同抗性表型）品种来源的同源序列比较将成为确定新功能基因的方法YudaiOkuyamaetal.，2011，水稻基因组重测序工作的开展将极大地推动包括稻瘟病抗性基因在内的基因分离克隆进程Xuetal.，2011。[0003]Pid2位于水稻第6染色体的近着丝粒区域，克隆于我国籼稻品种“地谷”的为主效抗稻瘟病基因，对我国稻瘟病生理小种ZB15表现较高的叶瘟抗性，是我国南方稻瘟病育种的重要抗源。从已克隆的稻瘟病抗性基因结构来看，Pi-d2不同于传统的“R”基因。主效抗稻瘟病基因Pi-d2源自籼稻品种〃地谷〃，对我国稻瘟病生理小种ZB15表现较高的叶瘟抗性Chen,20101-12定位于水稻第6染色体的近着丝粒区域，为单拷贝基因，编码一长度为825个氨基酸的跨膜受体蛋白激酶RLK，该激酶氨基端含有疏水性信号肽、B-lectin结构域、PAN域和TM域，羧基端是个典型的丝氨酸苏氨酸激酶结构域STK。由于以前在水稻中未发现RLK含膜外B-lectin结构，因此Pi-d2属于新的抗病基因类型。[0004]酶切扩增多态性序列（CleavedAmplifiedPolymorphicSequences，CAPS是一类以PCR为基础的共显性的分子标记，它的基本原理是先用已知位点的DNA序列去设计一套特异性的PCR引物（19〜27bp，然后应用这些引物去扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增带并进行RFLP分析。它揭示了特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，既能检出DNA多态性的方式，同时还具有快速、简捷、高效等优点。[0005]传统常规田间表型鉴定对抗稻瘟病基因的选择效率低，准确性差；急需一种抗稻瘟病水稻的高效育种方法。发明内容[0006]为了解决上述问题，本发明提供一种抗稻瘟水稻鉴定方法和基因的标记方法及其应用。利用这种方法可以有效地对抗稻瘟病基因Pid2基因型选择，既可以用于水稻资源的鉴定筛选，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Pid2的分子育种。[0007]具体技术方案为：一种抗稻瘟水稻鉴定方法，通过以下步骤来实现：1对稻种资源Pid2编码区的等位基因进行PCR扩增及PCR产物测序；2在水稻第6号染色体中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基处获得两个Pid2特异性SNP位点；3所述两个Pid2特异性SNP位点碱基有三种情况：1碱基类型为“AT”，2碱基类型为卞^，3碱基类型为“0丁”；4若待测水稻材料5352和5353位点碱基是“AT”，则该材料为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻;若待测水稻5352和5353位点处碱基碱基类型为“GT或“GT”，则该水稻材料为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻。[0008]优选的，所述抗稻瘟水稻基因的标记方法，即检测水稻Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基的方法如下：1以待测水稻的基因组DNA为模板，以稻瘟病抗性基因Pid2基因的分子标记引物为引物，进行PCR扩增，得到700bp大小的PCR扩增产物；2用限制性内切酶Faul和Mlul分别对所述PCR扩增产物进行酶切，其结果有以下几种情况：1所述PCR扩增产物被两种限制性内切酶酶切后电泳均只显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“AT”；2所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示两条DNA条带，而被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“GC”；3所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示两条DNA条带，而被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“GT”；4所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示三条DNA条带，而被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合碱基“ATGC”；5如果所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示3条DNA条带，而被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合碱基“ATGT”；6所述PCR扩增产物被两种限制性内切酶酶切后电泳均显示3条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合“GCGT”；优选的，所述引物为能扩增稻瘟病抗性基因Pid2的分子标记的引物，其序列为：DF:5，_MGCTTGGTCAGGGAGGGTT-3,；Pid2DR:5’-TGTCATTGTACTTCAGCTTGGC-3’。[0009]优选的，所述稻瘟病抗病基因Pid2分子标记的核苷酸序列位于FJ915121.1及其同源序列5’末端起第4870和5570核苷酸所示的序列内。[0010]优选的，应用所述的引物及方法进行鉴定、筛选抗稻瘟病水稻。[0011]优选的，应用所述的引物及方法进行水稻抗稻瘟病基因分子育种。[0012]与现有技术相比，本发明具有下列优点：1与传统的利用接种不同的稻瘟病生理小种鉴定稻瘟病抗性等位基因不同，本发明提供的分子标记Pid2CAPS位于Pid2基因的编码区，在遗传上与Pid2抗病性呈共分离，选择效率可以达到100%，不仅可以判断目标材料是否含有Pid2基因，还可检测出目标材料的Pid2基因型是杂合还是纯合，与已有的通过unevenPCR对Pid2连锁标记进行检测的方法相比更为高效。[0013]⑵本发明提供的分子标记可以通过限制性内切酶Fau1和Mlu1酶切进行区分，总共有700bp、425bp和225bp三种带型，可以利用丨.5%的琼脂糖凝胶电泳直接检测，可以广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的UnevenPCR对Pid2进行检测的方法只是针对同一群体两个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体适用性有限。[0014]3利用本方法对水稻种质资源中抗稻瘟病基因Pid2等位基因型进行快速鉴定。利用本发明的方法无需重复进行亲本多态性的筛选，可加快抗稻瘟病水稻品种的选育进度，适用于我国大面积应用的水稻恢复系与不育系骨干亲本材料的转基因育种、基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种。附图说明[0015]图1为从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pid2基因及测序水稻品种93-11、日本晴及其余41个品种的Pid2等位基因序列特异性SNP位点分析，深色块为3种类型基因片段碱基相同部分;浅色为两种类型碱基相同；图2为使用限制性内切酶Mlul和Faul依次对PCR产物进行酶切，再将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测图；图3为转基因水稻和日本晴的基因组DNA进行PCR扩增，所得PCR产物分别用限制性内切酶Faul进行酶切，将各酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测图。具体实施方式[0016]—种抗稻瘟水稻鉴定方法，通过以下步骤来实现：1对稻种资源Pid2编码区的等位基因进行PCR扩增及PCR产物测序；2在水稻第6号染色体中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基处获得两个Pid2特异性SNP位点；3所述两个Pid2特异性SNP位点碱基有三种情况：1碱基类型为“AT”，2碱基类型为“60；’，3碱基类型为“01'”；4若待测水稻材料5：352和5353位点碱基是“AT”，则该材料为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻;若待测水稻5352和5353位点处碱基碱基类型为“GC”或“GT”，则该水稻材料为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻。[0017]优选的，所述抗稻瘟水稻基因的标记方法，即检测水稻Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基的方法如下：1以待测水稻的基因组DNA为模板，以稻瘟病抗性基因Pid2基因的分子标记引物为引物，进行PCR扩增，得到700bp大小的PCR扩增产物；2用限制性内切酶Fau1和Mlu1分别对所述PCR扩增产物进行酶切，其结果有以下几种情况：1所述PCR扩增产物被两种限制性内切酶酶切后电泳均只显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第53M和5353碱基是纯合的“AT”；2所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示两条DNA条带，而被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“GC”；3所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示两条DNA条带，而被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“GT”；4所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示三条DNA条带，而被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合碱基“ATGC”；5如果所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示3条DNA条带，而被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合碱基“ATGT”；6所述PCR扩增产物被两种限制性内切酶酶切后电泳均显示3条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合“GCGT”；优选的，所述引物为能扩增稻瘟病抗性基因Pid2的分子标记的引物，其序列为：DF:5，_AAGCTTGGTCAGGGAGGGTT-3,；Pid2DR:5’-TGTCATTGTACTTCAGCTTGGC-3’。[0018]优选的，所述稻瘟病抗病基因Pid2分子标记的核苷酸序列位于FJ915121.1及其同源序列5’末端起第4870和5570核苷酸所示的序列内。[0019]优选的，应用所述的引物及方法进行鉴定、筛选抗稻瘟病水稻。[0020]优选的，应用所述的引物及方法进行水稻抗稻瘟病基因分子育种。[0021]实施例1、抗稻瘟病基因Pid2特异性CAPS标记Pid2caps的引物设计与检测一、Pid2基因序列特异性SNP位点分析从公共数据库中下载得到己经公开发表的Pid2基因及测序水稻品种93-11、日本晴及其余41个品种的Pid2等位基因序列，对这些序列进行比对，筛查Pid2特异的、能区别于该位点等位基因的SNP。如图1所述，其中位于Pid2基因起始密码子后+2057及+2058位点的碱基为“AT”，其余所有品种的基因型有两种类型，类型一为碱基“Gc”，类型二为碱基“GT”。而这两个位点的SNP变化刚好导致类型一的Pid2等位基因型可在该位置被限制性内切酶Mlul识别并在+2〇51处切开，类型二的Pid2等位基因型可在该位置被限制性内切酶Faul识别并在+2〇51处切开，Pid2基因则不能被这两种限制性内切酶识别并切开。这两个SNP位点与Pid2及其等位基因型中其余Mlul及Faul位点中的序列空间大于700bp，满足CAPS标记开发的条件。[0022]二、引物设计和合成在Pid2基因+2057bp位点上游480bp处级下游219bp处设计配对引物Pid2DF:5’_AAGCTTGGTCAGGGAGGGTT-3,；Pid2DR:5’-TGTCATTGTACTTCAGCTTGGC-3’。[0023]一选择水稻材料云南地方稻种及公共数据库中下载得到的相关稻种资源Pid2基因序列。[0024]二PCR扩增及酶切检测提取步骤三中的各水稻材料基因组DNA，分别以其为模板，以步骤二的引物为扩增引物进行PCR扩增，所得片段大小为7〇0bp，该片段即为Pid2caps标记。本发明扩增得到的Pid2caps标记的序列有三种，第一种在4幻及482bp处碱基为“AT”，第二种481及482bp处碱基为“GC”，第三种在481及482bp处碱基为“GT”。[0025]使用限制性内切酶Mlul和Faul分别对PCR产物进行酶切，再将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1显示。[0026]PCR扩增体系为25此：1仙2〇15.75此，0财1此，1〇11„11〇1几引物各1此，10〆PCRbuffer2•5yL，dNTP2•5mmo1L2yL，Mgc1225ramo1L1•5uL，DNA聚合酶（5Uy10•25uUPCR扩增程序为95°C预变性5min;94°C变性45s，57°CSFL或53°CBar退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环;72°C延伸lOmin。[0027]使用限制性内切酶Mlu1和Fau1依次对PCR产物进行酶切，再将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。[0028]图2中，1、2、4、7、9号材料可被Faul切开，而不能被Mlul切开，这些材料经测序后在481及482bp处碱基为“GC”；3、5、6、8号材料可被Mlul切开，而不能被Faul切开，这些材料经测序后在481及482bp处碱基为“GT”；10号材料不能被Faul和Mlul切开，经测序后其481及482bp处碱基为“AT”。[0029]实施例2、抗稻瘟病基因Pid2特异性CAPS标记在转Pid2基因编码区的水稻中的验证及应用一）、以不含抗稻瘟病基因Pid2的水稻品种日本晴为转基因受体，将抗稻瘟病基因Pid2的CDS区域在日本晴背景下高表达，制备成转Pid2基因编码区的水稻。_〇]二）、提取步骤一得到的转基因水稻和曰本晴的基因组DNA，分别以其为模板，使用实施例1的引物进行PCR扩增，所得PCR产物分别用限制性内切酶]?£1111进行酶切，将各酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。[0031]结果如图3所示，1号泳道为日本晴非转基因植株，可被Faul酶切，显示255bp及475bp的两条条带;2号泳道为Pid2转基因植株，经过Faul酶切后具有3条条带。

权利要求：1.一种抗稻瘟水稻鉴定方法，其特征在于，通过以下步骤来实现：1对稻种资源Pid2编码区的等位基因进行PCR扩增及PCR产物测序；2在水稻第6号染色体中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基处获得两个Pid2特异性SNP位点；3所述两个Pid2特异性SNP位点碱基有三种情况：1碱基类型为“AT”，2碱基类型为如^’⑶碱基类型为‘饥”；4若待测水稻材料5352和5353位点碱基是“AT”，则该材料为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻;若待测水稻5352和5353位点处碱基碱基类型为“GC”或“GT”，则该水稻材料为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻。2.根据权利要求1所述的一种抗稻瘟水稻鉴定方法，其特征在于，所述抗稻瘟水稻基因的标记方法，即检测水稻Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第53M和5353碱基的方法如下：1以待测水稻的基因组DNA为模板，以稻瘟病抗性基因Pid2基因的分子标记引物为引物，进行PCR扩增，得到700bp大小的PCR扩增产物；2用限制性内切酶Faul和Mlul分别对所述PCR扩增产物进行酶切，其结果有以下几种情况：1所述PCR扩增产物被两种限制性内切酶酶切后电泳均只显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“AT”；2所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示两条DNA条带，而被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“GC”；3所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示两条DNA条带，而被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353碱基是纯合的“GT”；4所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Faul酶切后电泳显示三条DNA条带，而被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合碱基“ATGC”；5如果所述PCR扩增产物能被限制性内切酶Mlul酶切后电泳显示3条DNA条带，而被限制性内切酶Fau1酶切后电泳显示1条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121•1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合碱基“ATGT”；6所述PCR扩增产物被两种限制性内切酶酶切后电泳均显示3条DNA条带，则待测水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353碱基是杂合“GCGT”。3.根据权利要求2所述的所述一种抗稻瘟水稻基因的标记方法，其特征在于，所述引物为能扩增稻瘟病抗性基因Pid2的分子标记的引物，其序列为：DF:5，_AAGCTTGGTCAGGGAGGGTT-3,；Pid2DR:5’-TGTCATTGTACTTCAGCTTGGC-3’。4.根据权利要求2所述的所述一种抗稻瘟水稻基因的标记方法，其特征在于，所述稻瘟病抗病基因Pid2分子标记的核苷酸序列位于FJ91S121•1及其同源序列5’末端起第4870和5570核苷酸所示的序列内。5.根据权利要求3所述的所述一种能扩增稻瘟病抗性基因Pid2的分子标记的引物，其特征在于，应用所述的引物及方法进行鉴定、筛选抗稻瘟病水稻。6.根据权利要求3所述的所述一种能扩增稻瘟病抗性基因Pid2的分子标记的引物，其特征在于，应用所述的引物及方法进行水稻抗稻瘟病基因分子育种。

百度查询： 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种抗稻瘟水稻鉴定方法和基因的标记方法及其应用

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