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【发明授权】一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记_华中农业大学_201711255123.X 

申请/专利权人:华中农业大学

申请日:2017-12-02

公开(公告)日:2021-04-13

公开(公告)号:CN107723286B

主分类号:C12N15/11(20060101)

分类号:C12N15/11(20060101);C12Q1/6888(20180101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.04.13#授权;2018.03.20#实质审查的生效;2018.02.23#公开

摘要:本发明属于家畜分子标记筛选技术领域,具体涉及一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记。该标记从水牛ACAA1基因中筛选得到,其序列如SEQIDNO:1所示,在该序列776位碱基处发生一个AT碱基突变,导致ACAA1基因多态性。筛选方法为:从水牛血液中提取基因组DNA,设计引物,PCR扩增,PCR产物克隆、测序,序列比较分析,SNP检测,质谱分型,标记与泌乳性状间相关性分析。公开了地中海水牛ACAA1基因promoter区的SNP分型检测技术,发现该AT突变位点与305d乳脂量、306d乳蛋白量、305乳脂率、305乳蛋白量等产奶性状显著相关。本发明为水牛标记辅助选择提供了新的遗传标记资源。

主权项:1.一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记在地中海水牛产奶性能辅助选择中的应用,所述遗传标记的核苷酸序列如下所示:GCCCTGGGATTTCTTTGGAAGGAATGATGCTAAAGCTGAAACTCCAGTACTTTGGCCACCTCATGCGAAGAGTTGACTCATTGGAAAAGCCTCTGATGCTGGGAGGGATTGGGGGCAGGAGGAGAAGGGGACGACAGAGGATGAGATGGCTGGATGGCATCACCAACTCGATGGACGTGAGTTTGAGTGAACTCCGGGAGATGGTGATGGACAGGGAGGCCTGGCGTGCTGCGATTCATGGGGTCGCAAAGAGTCGGACACGACTGAGCGACTGAACTGAACTGAACTGAACTGATGCATGTATACGGCTCTTTCTCCAGATAGGGAGTCCCGTCACATCTCGGCCACTTTGTATAATCCGTTCTCCTGCCACCCCAGAATCCCAGATTCCCTCAGTCTTCTCGAAAGACTTCCCAGGAGAGCCCAAACACGTCAAGGTAGGCTCTGGGGCATCTCGGAATTATCTCGGTCTCCCAGCCTGGGGGAGACAGCAGAGAAGGTTAGGAAGGGAGAAGAGGAACGAGAGGCCCCGGCGCCTCTTTCCCGGCTAAGAAACTGTAGGCAGCGCTCCTGACAATTCGCCATGTGTTTGGTGGCGGGCAGTGGGCAGGGTTGTAGGGAAAGGGACCCCTGGCAATAGTGAAATTTTCTTCAAGAAACGAAAGGTGCTCCTGCAAACCCGCCTGCGGTTTGGCAGTAGGTAGGGCTGCAAGTGCAAAGAATTCCTGTCTGCGTTTCTGCGCGAGGCTTCAGAAAAGTCCACCTCCCGGTTGGCRGGCGTAGGCTACTGTAGGCGGGGCTTTGAGTAAAAAGACTCTCTGAGGTCTAACTTTGGGAAGCTCGGTTTGCGGATTGGGGCGGGACCTCAGGCAGGCTCGCCAACCAGAGGTTGGCTGAGGTGGGGAGATGGGCGGGACTTTTAGAGGGAAAGGCCAGTCAGACCAGTAGGTCTGTGGGTGGGACTTAGATATCCGTGGGTCAGAGGTAAGGTCCCGTGCCTGCGTGGGCCACGGCCT,上述序列的第776位碱基处的R是A或T,导致ACAA1基因的多态性。

全文数据:一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记技术领域[0001]本发明属于水牛的标记辅助选择技术领域,具体涉及一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记。所述的遗传标记分离自ACAAl基因的启动子promoter区域即该基因的部分核苷酸序列)。本发明还包括该遗传标记在水牛标记辅助选择关联分析中的应用。背景技术[0002]水牛主要分布于热带与亚热带地区,是全球第二大产奶家畜。水牛奶被誉为“奶中之王”,乳脂肪、乳糖、乳蛋白含量高,同时富含锌、铁等矿物元素,且易于吸收,奶质佳,香味浓,营养价值远高于荷斯坦奶牛所产的牛奶。产奶性状是水牛的重要经济性状,主要包括产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳脂量和乳蛋白量等,是典型的由微效多基因控制的数量性状,并且受环境影响。利用分子标记辅助选择MarkerAssistedSelection,MAS技术,通过对产奶性状基因或与之连锁的遗传标记的选择,实现对控制性状的数量性状基因座位QuantitativeTraitLoci,QTL的选择,寻找对产奶性状有明显效应的主效基因,进而应用于水牛产奶性状的改良,对于培养专门化乳用品种具有重要的意义。[0003]水牛分子育种的研究和应用也在快速的发展,发现了一些与生产性状有关联的功能基因和基因类型。Freitas等对136头摩拉水牛A2M基因进行了多态性研究,结果共发现3个SNP位点,其中,A2M-ex〇n29g.241AG位点与乳脂量、乳脂率和乳蛋白率显著相关,GG基因型个体乳脂量、乳脂率和乳蛋白率较高。Ozdi1等利用PCR-RFLP和PCR产物直接测序技术对Anatolian水牛DGATl基因第8外显子的多态性进行了研究,结果表明,所有水牛群体的DGATl基因已固定,均为K232A等位基因型,且其与高乳脂量相关。[0004]ACAAlacetyl-CoenzymeAacyltransferase1,乙酰辅酶A酰基转移酶1主要分布在过氧化物酶体,为酰基转移酶。其在脂肪分解代谢中起着重要的作用,多种与脂肪代谢有关的药物通过影响乙酰辅酶A酰基转移酶mRNA的合成调节脂类代谢。ACAAl的缺乏可引起酮症,甚至导致死亡。李恒德等研究表明黄牛ACAAl基因A1066G突变位点的3种基因型间眼肌面积差异显著P〈〇.05,AA型最高,AG型次之,GG型最低;ACAAl基因A1452G突变位点的3种基因型间眼肌面积差异显著P〈〇.05,GG型最高,AG型次之,AA型最低。目前ACAAl基因与泌乳水平的研究较少,实验室前期RNAseq的结果表明:ACAAl基因在泌乳期高表达,故检测水牛ACAAl基因多态性,进而筛选与产奶性状相关的分子标记很有必要。发明内容[0005]本发明的目的是筛选一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记。通过克隆水牛ACAA1基因的启动子promoter区的序列,运用直接测序法寻找SNP位点,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法MALDI-T0F-MS进行基因分型,分析该突变位点与水牛泌乳性状的关联性。从而为水牛的泌乳性状建立新的标记辅助选择位点。[0006]本发明通过以下技术方案实现:[0007]本发明获得了地中海水牛ACAAl基因启动子序列片段S卩ACAAl基因的部分核苷酸序列),该片段长度为l〇16bp,其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1所述,通过在NCBI网站对上述序列进行blast比对,在该扩增片段内发现一处核苷酸多态性SNP位点,该SNP位点如图2所示。其突变位点具体在翻译起始密码子TAG之前第298bp处,(即在该序列的第776位碱基处,发生一个等位基因的突变)。申请人将在本说明书中涉及到该突变的位点都命名为A298T〇[0008]选择地中海水牛为试验材料,从水牛血液中提取全基因组DNA,根据NCBI数据库公布的水牛ACAAl基因序列基因登陆号见实施例1所述设计引物对,该引物对的序列如下所示:[0009]正向引物:[0010]反向引物:[0011]上述引物对可对SEQIDNO:1所述的遗传标记和对ACAAl基因片段该片段的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示进行分型。[0012]利用该引物对进行PCR扩增、PCR产物的纯化、克隆测序和序列比对分析。[0013]筛选得到一种与水牛生长性状关联的遗传标记,该遗传标记的核苷酸序列如下所示R旁的括号内为突变位点):[0015]上述序列中776位碱基处的R是A或T,该突变导致ACAAl基因多态性。[0016]本发明提供了一种筛选水牛泌乳性状相关联的遗传标记方法,所述的方法包括以下步骤:[0017]从地中海纯种水牛血液中提取基因组DNA,根据水牛ACAAl基因基因组序列设计引物,该引物的序列如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示,用所述的引物对在水牛基因组DNA中进行PCR扩增,通过直接测序法,得到导致ACAAl多态性的核苷酸序列;利用飞行时间质谱法对样本进行分型,ACAAl基因的部分核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示,在序列表SEQID:1所示碱基的第776bp处存在一个AT碱基突变即等位基因突变),利用该突变位点作为遗传标记对地中海水牛泌乳性状进行关联分析。[0018]本发明提供了检测上述序列A298T变异的基因型分型方法。[0019]进一步,本发明提供了利用飞行时间质谱法确定不同基因型个体与泌乳性状之间关联分析的应用。[0020]更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。附图说明[0021]序列表SEQIDNO:1是地中海水牛ACAAl基因的部分核苷酸序列(序列表SEQIDNO:1的776bp处的碱基是突变替换)后的碱基“T”),即作为本发明的遗传标记的核苷酸序列。在该序列的第776位碱基处产生一个等位基因的突变位点,即由“A”突变为“T”。[0022]序列表SEQIDN0:2和SEQIDN0:3是扩增ACAAl基因的引物对的序列,该引物对的序列也是检测本发明遗传标记的引物。[0023]图1:本发明的技术流程图。[0024]图2:地中海水牛ACAAl基因的核苷酸序列和突变位点示意图。在序列的第776位碱基处R的括号内的AT突变位点是导致ACAAl基因多态性的特异性位点。[0025]图3:本发明对ACAAl基因的直接测序检测结果1。[0026]图4:本发明对ACAAl基因的直接测序检测结果2。根据测序结果可知,该序列存在AT突变序列分别为TTGGCAGGCTTGGCTGGC。具体实施方式[0027]实施例1:牛ACAAl基因promoter区域DNA片段的获得及SNP检测方法的建立[0028]试验选择地中海河流型水牛,根据水牛ACAAl基因组序列(登陆号GeneID:102396359设计如下引物对,具体序列如下:[0029]正向引物:[0030]反向引物:[0031]利用上述引物对在“地中海水牛”基因组DNA中进行PCR扩增。[0032]PCR反应体系见表1所示。[0033]表IPCR反应体系[0036]PCR反应条件见表2所示。[0037]表2PCR反应条件[0039]将所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行序列测定,测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经blast比对分析,发现在该序列中第776位碱基处存在一个AT碱基突变碱基替换),该突变引起ACAAl基因多态性。[0040]实施例2:本发明的遗传标记与水牛泌乳性状的关联分析及应用[0041]为了确定水牛ACAAl基因promoter区域内的SNP与水牛表型差异是否相关,选择地中海纯种水牛381头为试验材料,所有数据资料均由意大利育种协会AIA和意大利农业研究委员会CAR提供。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法MALDI-T0F-MS进行多态性检测,并分析水牛ACAAl基因promoter区域不同基因型与水牛泌乳性状的相关性。采用R语言统计软件中的混合线性模型Mixed进行基因型和表型值之间的关联分析,分析模型为:[0042]Yijki=u+Gi+Pj+Sk+Fi+PSjk+PFji+SFki+e[0043]式中,Yijki为性状观察值;u为性状总平均值;Gi为基因型效应;Pj为胎次效应;Sk为季节效应;Fi为场次效应;PSjk、PFji和SFki表示二因素互作效应;e为随机误差,假定服从0,σ2分布。[0044]对地中海水牛ACAAl基因promoter区域Α298Τ位点的多态性检测,在这个群体中均检测到三种基因型,基因型频率及分布情况如表3所示。[0045]表3地中海水牛ACAAl基因基因型频率和等位基因频率[0047]表3说明:表1括号外的为个体数,括号内的为基因型频率。[0048]表4地中海水牛ACAAl基因A298T位点的多态性与泌乳性状的关联分析高峰奶量(kg15.61±0:.4015.31±0.3715.51±0,4:0305产奶量(kg2956.46+34:.182898.20+23.392921.67+30.37305乳脂量(kg242.92+3.08a232,51+2.Ilb236.79+2.Ti[0050]^abh乳脂率(%8.25+0.06a8.04+0.0418.13+0.06"3:05乳蛋白量(kg134.96*1.60Γ3Θ.59+1.1132.58+1.U乳蛋白率(%4.58+0.Q2453+0,.Ol64.56+0:.03b[0051]表4说明:1、以上数值为最小二乘均值±标准误;同行含有相同字母表示差异不显著,字母不同时表示差异显著P〈〇.05,未标注者表示差异不显著P0.05。[0052]由表4可以看出,ACAAl基因启动子区域A298T位点的多态性在意大利地中海水牛中与305乳脂量、乳脂率、305乳蛋白量、乳蛋白率具有显著相关性(P〈0.05,且AA基因型305d乳脂量、乳脂率、乳蛋白量、乳蛋白率均显著高于其他基因型。高峰奶量与305d产奶量与A298T位点虽无显著性,但AA基因型也在一定水平上代表了产奶的最高水平,具有一定的研究价值。从遗传稳定性和遗传进展方面来讲,AA基因型对于增加产奶量、乳品质具有明显优势。综合以上结果,该位点可作为增加地中海水牛泌乳性状的潜在遗传标记。[0053]主要参考文献[0054][1]杜超,魏鹏飞,郭妮妮,等.水牛产奶性状分子标记研究进展[J].中国畜牧杂志,2017,535:10-16·[0055][2]李恒德,王淑辉,许尚忠,等.牛ACAAl和ACAA2基因多态性及其与生产性状的关联分析[J].畜牧兽医学报,2008,396:696-700.[0056][3]Cobanoglu0,ZaitounI,ChangYM,etal·EffectsofthesignaltransducerandactivatoroftranscriptionISTATlgeneonmilkproductiontraitsinHolsteindairycattle.[J].JournalofDairyScience,2006,89II:4433-7.[0057][4]YangS,GaoY1ZhangS,etal.IdentificationofGeneticAssociationsandFunctionalPolymorphismsofSAAlGeneAffectingMilkProductionTraitsinDairyCattle[J].PlosOne,2016,119.[0058][5]BrymP1KamiAskiS1WojcikE.Nucleotidesequencepolymorphismwithinexon4ofthebovineprolactingeneanditsassociationswithmilkperformancetraits.[J].JournalofAppliedGenetics,2005,462:179-85〇

权利要求:1.一种与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记,其特征在于它的核苷酸序列如下所示:GCCCTGGGATTTCTTTGGAAGGAATGATGCTAAAGCTGAAACTCCAGTACTTTGGCCACCTCATGCGAAGAGTTGACTCATTGGAAAAGCCTCTGATGCTGGGAGGGATTGGGGGCAGGAGGAGAAGGGGACGACAGAGGATGAGATGGCTGGATGGCATCACCAACTCGATGGACGTGAGTTTGAGTGAACTCCGGGAGATGGTGATGGACAGGGAGGCCTGGCGTGCTGCGATTCATGGGGTCGCAAAGAGTCGGACACGACTGAGCGACTGAACTGAACTGAACTGAACTGATGCATGTATACGGCTCTTTCTCCAGATAGGGAGTCCCGTCACATCTCGGCCACTTTGTATAATCCGTTCTCCTGCCACCCCAGAATCCCAGATTCCCTCAGTCTTCTCGAAAGACTTCCCAGGAGAGCCCAAACACGTCAAGGTAGGCTCTGGGGCATCTCGGAATTATCTCGGTCTCCCAGCCTGGGGGAGACAGCAGAGAAGGTTAGGAAGGGAGAAGAGGAACGAGAGGCCCCGGCGCCTCTTTCCCGGCTAAGAAACTGTAGGCAGCGCTCCTGACAATTCGCCATGTGTTTGGTGGCGGGCAGTGGGCAGGGTTGTAGGGAAAGGGACCCCTGGCAATAGTGAAATTTTCTTCAAGAAACGAAAGGTGCTCCTGCAAACCCGCCTGCGGTTTGGCAGTAGGTAGGGCTGCAAGTGCAAAGAATTCCTGTCTGCGTTTCTGCGCGAGGCTTCAGAAAAGTCCACCTCCCGGTTGGCRGGCGTAGGCTACTGTAGGCGGGGCTTTGAGTAAAAAGACTCTCTGAGGTCTAACTTTGGGAAGCTCGGTTTGCGGATTGGGGCGGGACCTCAGGCAGGCTCGCCAACCAGAGGTTGGCTGAGGTGGGGAGATGGGCGGGACTTTTAGAGGGAAAGGCCAGTCAGACCAGTAGGTCTGTGGGTGGGACTTAGATATCCGTGGGTCAGAGGTAAGGTCCCGTGCCTGCGTGGGCCACGGCCT上述776位碱基处的R是A或T,导致ACAAl基因的多态性。2.—种扩增如权利要求1所述的遗传标记和对ACAAl基因片段进行分型的引物对,其核苷酸序列如下所述:正向引物:CCCCTGGCAATAGTGAAAT,反向引物:TTACCTCTGACCCACGGATA;所述的ACAAl基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.—种筛选与地中海水牛泌乳性状关联的遗传标记的方法,其特征在于以下步骤:从地中海纯种水牛血液中提取基因组DNA,根据水牛ACAAl基因基因组序列设计引物,该引物的序列如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示,用所述的引物对在水牛基因组DNA中进行PCR扩增,通过直接测序法,得到导致ACAAl基因多态性的核苷酸序列,利用飞行时间质谱法对样本进行分型,该序列如权利要求1所示,其中在SEQID:1所示碱基位的第776位碱基处有一个AT碱基突变,利用该突变位点作为遗传标记对地中海水牛泌乳性状进行关联分析。4.权利要求1所述的遗传标记在水牛产奶性能辅助选择中的应用。5.权利要求2所述的引物对在水牛产奶性能辅助选择中的应用。

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