申请/专利权人：南京师范大学

申请日：2018-01-18

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN108272822B

主分类号：A61K35/20(20060101)

分类号：A61K35/20(20060101);A61K9/127(20060101);A61P9/00(20060101);A61P1/00(20060101);A61P31/00(20060101);A61P3/06(20060101);A61P37/02(20060101);A61P25/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2018.08.07#实质审查的生效;2018.07.13#公开

摘要：本发明公开了一种乳极性脂质的提取方法及其应用，其提取方法为：将酪乳粉经等电点沉淀除去酪蛋白；离心收集上层清液加入氯仿‑甲醇溶液，搅拌后离心，收集下层有机相，重复提取下层有机相合并收集后旋转蒸发除去氯仿‑甲醇，得到复合脂质；复合脂质加丙酮，过滤收集沉淀即为乳极性脂质；用酪乳粉为原料提取乳极性脂质在制备乳极性脂质体上的应用，是将提取到的乳极性脂质与胆固醇混合，旋转蒸发后先经水化再经超声处理即得乳极性脂质体。本发明采用酪乳粉为原料提取乳极性脂质，在原料选择和提取工艺上具有创新性，且流程简单，易于实现工业化，适于推广使用。

主权项：1.一种乳极性脂质的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）去除酪蛋白：将酪乳粉用蒸馏水溶解，搅拌均匀，将溶液pH调整为4.5-4.9，离心分离，取上清液备用，其中，所述酪乳粉质量与蒸馏水的体积比为1:7-10，离心时间为15-30min，转速4000-8000rmin；（2）氯仿-甲醇提取复合脂质：将步骤（1）中提取的上清液中加入氯仿-甲醇溶液，搅拌后离心，其中所述氯仿与甲醇的体积比为2:1，氯仿-甲醇混合液体积与上清液体积比为1:4-6，搅拌速率为400-600rmin，离心时间为15-30min，离心转速为6000-8000rmin；分层后，吸取下层有机相，上层水相加入氯仿-甲醇溶液按上述步骤再次提取有机相，重复两次或两次以上，收集有机相旋转蒸发除去氯仿-甲醇，得到粘稠液体后氮吹至固态，即为复合脂质；（3）丙酮沉淀乳极性脂质：在步骤（2）所得复合脂质中加入丙酮后搅拌；收集过滤后沉淀，得到乳极性脂质。

全文数据：一种乳极性脂质的提取方法及其应用技术领域[0001]本发明属于乳品加工技术领域，具体涉及一种乳极性脂质的提取方法及其应用。背景技术[0002]乳脂肪球^膜是乳中包裹在脂肪球体外部的一层膜，由中性脂质、极性脂质、膜蛋白等成分构成，其中乳极性脂质含量约占总乳脂肪含量的1%，主要分为包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和神经鞘磷脂。相较于市场上常见的蛋黄卵磷脂或大豆磷脂，因含有神经鞘磷脂，乳极性脂质具有更多的功能特性，如减少心血管疾病、降低胃肠道感染、降低胆固醇吸收、免疫调节，促进婴儿大脑发育等作用，同时由于特殊的两性分子结构，也含有起泡性、乳化性、改善质构等作用，具有一定的工业应用价值。[0003]国外报导的乳极性脂质可从酪乳buttermilk和奶油乳清butterserum中分离得到。酪乳和奶油乳清是奶油制作过程中不同阶段的副产物，含有乳脂肪球膜碎片，但通常被认为是低值产品，工业上干燥后常被用作动物饲料。[0004]目前，提取乳极性脂质的难点在于如何把极性脂质与其它成份如蛋白、乳糖、矿物质和甘油三酯分开。已报导的乳极性脂质提取方式大致可分为物理提取和化学提取，物理提取法是利用超临界萃取技术或膜技术进行分离提取;化学提取法是通过氯仿、甲醇、乙醚、乙醇等有机溶剂进行提取。[0005]GassiJY等从奶油乳清中经过脱脂、热处理、酸沉淀酪蛋白、再通过超滤和透析除去矿物质、乳糖、乳酸等得到乳极性脂质，但该工艺分离方法复杂、成本高，且由于不能完全分离蛋白（酪蛋白、乳清蛋白和脂肪球膜蛋白）、甘油三酯和一些盐类等，分离的乳极性脂质纯度不尚。[0006]WatanabeS等用十倍体积的乙醇提取奶油乳清一夜，再将乙醇提取物溶解于氯仿甲醇水混合液中，置于分液漏斗中震荡后过夜，再收集下层有机相旋转蒸发去除氯仿甲醇后，用硅胶柱层析除去非极性脂质，得到极性脂质，此方法提取耗时较长，且步骤复杂。发明内容[0007]针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种乳极性脂质的提取方法及其应用，具有提取效率高，速度快，工艺流程简单，易于推广应用的特点。'[0008]本发明解决其技术问题采用的技术方案是：[0009]—种乳极性脂质的提取方法，包括如下步骤：[0010]1去除酷蛋白：将酷乳粉用黑馈水溶解，揽祥均勾，将溶液pH调整为4.5-4.9，离、分尚，取上清液备用；[0011]2氯仿-甲醇提取复合脂质：将步骤（1中提取的上清液中加入氯仿—甲醇溶液，搅拌后离心;分层后，吸取下层有机相，上层水相加入氯仿-甲醇溶液按上述步骤再次提取有机相，重复两次或两次以上，收集有机相旋转蒸发除去氯仿-甲醇，得到粘稠液体后氮吹至固态，即为复合脂质；[0012]3丙酮沉淀乳极性脂质：在步骤2所得复合脂质中加入丙酮后搅拌;收集过滤后沉淀，得到乳极性脂质。[0013]作为本申请的优选技术方案，所述步骤1中，所述酪乳粉质量与蒸馈水的体积比为1:7-10。[0014]作为本申请的优选技术方案，所述步骤（1中，离心时间为15-30min，转速4000-8000rmin。[0015]作为本申请的优选技术方案，所述步骤⑵中，所述氯仿与甲醇的体积比为2:1。[0016]作为本申请的优选技术方案，所述步骤2中氯仿-甲醇混合液体积与上清液体积比为1:4-6。[0017]作为本申请的优选技术方案，所述步骤2中，搅拌速率为400-600rmin;离心时间为15-30min，转速6000-8000rmin。[0018]上述乳极性脂质在制备乳极性脂质体中的应用，将酪乳粉中提取的乳极性脂质和胆固醇按摩尔比1:0.5-3混合，通过薄膜分散法制得。[0019]作为本申请的优选技术方案，所述乳极性脂质和胆固醇的按摩尔比1:2混合，制备乳极性脂质体。[0020]作为本申请的优选技术方案，将乳极性脂质溶于氯仿，加入胆固醇，混合后加入反应器中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入纯水后水化，将水化后的脂质体悬浮液进行超声制得均匀的乳极性脂质体。[0021]作为本申请的优选技术方案，水化温度为37°C，时间lh;超声时间5s，超声间隙7s，80次，超声功率400W。[0022]酪乳粉首先经过等电点沉淀去除乳酪蛋白，再通过氯仿-甲醇溶液提取得到乳混合脂质，实验中采用氯仿-甲醇多次抽提，提尚提取率，在提取时通过揽摔，提_提取效率；因中性脂质溶于丙酮，极性脂质不溶于丙酮，因而在后续处理时加入丙酮使极性脂质分离开来，得到乳极性脂质。[0023]利用得到的乳极性脂质与胆固醇进行比例混合，通过薄膜分散法即可得到乳极性脂质体。脂质体具有独特的亲和性和靶向性、可降低药物毒性、提高药物稳定性。由于乳极性脂质中大量神经鞘憐脂的存在，乳脂质体在一定条件范围内比大豆脂质体更加稳定，抗氧化能力更强。[0024]有益效果[0025]本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：[0026]1采用酪乳粉为原料提取乳极性脂质，酪乳粉中甘油三酯含量较少，易于乳极性脂质的提取；[0027]2酸沉酪蛋白、氯仿-甲醇提取复合脂质、丙酮沉淀极性脂质的工艺更简单，成本低，效果好；[0028]⑶国内对于乳极性脂质的研究很少，国内市场也没有商业化的乳极性脂质，本专利提供了一种快速、高效的乳极性脂质提取方法，工艺流程简单，易于推广应用；[0029]⑷本发明采用酪乳粉提取乳极性脂质，拓宽了脂质体制备原料的来源，提髙了脂质体的稳定性和抗氧化能力；附图说明[0030]图1是磷脂含量测定的标准曲线图；[0031]图2是实施例1提取的乳极性脂质的薄层层析图；[0032]图3是实施例1制备的乳极性脂质体透射电镜图；[0033]图4是实施例1制备的乳极性脂质体粒径分布图；[0034]图5是实施例1制备的乳极性脂质体电位分布图。具体实施方式[0035]以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。[0036]实施例1[0037]1沉淀酪蛋白：取酪乳粉30g，用300mL蒸馏水溶解，搅拌均匀，40°C水浴10分钟。通过乳酸将溶液pH调整为4•5_4•9，然后8000rmin转速离心30min，取上清液于烧杯中；[0038]⑵有机溶剂提取:在上清液的烧杯中加入6〇mL氯仿-甲醇混合液2:lvv，超声波搅拌器搅拌5分钟后，置于离心管中，然后8000rmin转速离心30min，用胶头滴管吸取最下层有机相，摒弃中间层的蛋白质沉淀，将上层水相倒入烧杯中，继续加入60mL氯仿-甲醇混合液提取脂质，搅拌离心后收集下层有机相，如此重复三次。混合三次有机相，在真空度-0.9MPa条件下，水浴35°C旋转蒸发，蒸发至粘稠液体时，倒出至烧杯中，氮吹至氯仿全部挥发，得到混合极性脂质；[0039]3丙酮沉淀极性脂质:在混合脂质中加入10mL丙酮，充分搅拌。将贴壁沉淀刮下，所有沉淀过滤，收集滤纸上的沉淀，得到极性脂质。称取lmg极性脂质样品溶于lmL氯仿中制成样品溶液，可用于后续检测。[0040]⑷极性脂质含量的测定[0041]大豆磷脂标准溶液的配制：精密称取大豆磷脂5mg，至25mL容量瓶中，加氯仿使溶解并加至刻度，摇匀，制成0•2mgmL的大豆磷脂标准溶液，4。：保存，备用。[0042]显色剂的配制:准确称取2.7〇叱三氯化铁和3.04g硫氰酸铵至lOOmL容量瓶中，力口双蒸水使溶II并加至刻度，摇匀，制成显色剂溶液，室温保存。[0043]大豆磷脂标准曲线的绘制:精密称取〇•2mgmL的大豆磷脂标准溶液〇.2、〇.4、0.8、1.2、1.6和2mL于具塞禺心管中，加氯仿至4此，加硫氰酸按溶液4此，漩祸混匀丨111丨11，2〇〇〇1'min呙心lOmin，取下层。以氣仿为空白，在分光光度计485nm处测定吸光值△，以△对浓度cmgmL进行线性回归，得标准曲线方程。图丨为磷脂含量测定标准曲线。[00=]极性脂质含量的测定:准确称取稀释过两百倍的样品溶液10llL，三份做平行，于具塞离心管中，按大豆磷脂标准曲线方法测定，最后根据标准曲线方程计算样品中极性脂质含重，可测得氯仿甲醇提取有机相中磷脂浓度为37•7mgmL。[OO45]⑸薄层层析[0046]溶液配制:将提取的乳极性脂质样品、磷脂酰胆碱PC标准品，购于sigma公司）、磷脂酰乙醇胺PE标准品，购于sigma公司）、磷脂酰肌醇PI标准品，购于sigma公司）、磷脂酰丝氨酸ps标准品，购于sigma公司）、神经鞘磷脂SM标准品，购于sigma公司）溶解于氯仿，配置成lmgmL的溶液。[0047]点样:在硅胶板下端lcm左右画上横线，并在横线上均匀画上刻度，两边保持间距，用毛细管吸取一定量样品和标准品在刻度上点样，吹风机吹干。[0048]展开剂配制：用氯仿-甲醇-水-氨水混合液3:2:0•3:0•1，vvvv制成展开剂，倒入层析缸中。[0049]将点完样的硅胶板放入层析缸中，40分钟后吹千硅胶板，置于碘缸中显色。[0050]图2为乳极性脂质的薄层层析图，由图中可以看出乳极性脂质成份包括磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰肌醇PI、磷脂酰丝氨酸PS和神经鞘磷脂SM。[0051]⑹脂质体制备:取样品溶液5mL，按极性脂质与胆固醇的摩尔比1:2来称取相应的胆固醇量，混合后加入圆底烧瓶中，55°C减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂质体以薄膜的形式贴于瓶壁。[0052]⑺乳极性脂质体性状观测t〇〇53]采用透射电子显微镜观察乳极性脂质体形态:将水化后的脂质体悬浮液超声均质超声时间5s，超声间隙7s，80次），然后在高速冷冻离心机下离心，（10000rmin，30min，弃去上清液，吸取2mL纯水将贴壁的脂质体吹散，成悬浮液，冷藏待电镜下观察。透射电子显微镜采用负染法，滴两滴制备好的脂质体于专用铜网上，自然晾干，再用2.5%的磷钨酸进行负染，自然挥干，使粒子在铜网上浓缩沉积，用透射电子显微镜观察并照相。图3为lOOnm下的脂质体的透射电镜图，脂质体为球形结构，形态较为圆整，脂质体分散较为均匀；[0054]纳米粒度ZETA电位仪测定粒径及电位:吸取少量乳脂质体悬浮液，稀释，用纳米激光粒度电位分析仪进行粒径及电位的测定，图4为脂质体的粒径分布图，粒径平均在324mn左右，粒度分布较为均匀。另外，图5为脂质体的电位分布图，脂质体Zeta电位为-48.3mV，该脂质体为阴离子脂质体。[0055]实施例2[0056]与实施例1的区别在于，步骤（2用75mL氯仿-甲醇（2:1，vv洗下旋转蒸发所得物，置于分液漏斗中，静置过夜。测得氯仿-甲醇提取有机相中极性脂质含量31.9mgmL。[0057]实施例3[0058]与实施例1的区别在于，步骤（2用50mL氯仿-甲醇（2:1，vv洗下旋转蒸发所得物，置于分液漏斗中，静置过夜。测得氯仿-甲醇提取有机相中极性脂质含量22.9mgmL。[0059]实施例4[0060]与实施例1的区别在于，步骤⑹取样品溶液5mL，按极性脂质与胆固醇的摩尔比1:1•5来称取相应的胆固醇量，混合后加入圆底烧瓶中，55°C减压旋转蒸发除去有机溶剂。测得乳脂质体粒径为391•4nm，电位为-42•6mv。[0061]实施例5[0062]与实施例1的区别在于，步骤⑹取样品溶液5mL，按极性脂质与胆固醇的摩尔比1:3来称取相应的胆固醇量，混合后加入圆底烧瓶中，55°C减压旋转蒸发除去有机溶剂。测得乳脂质体粒径为434•3nm，电位为-44.lmv。[0063]本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

权利要求：1.一种乳极性脂质的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：⑴去除酪蛋白：将酪乳粉用蒸馈水溶解，搅拌均勾，将溶液pH调整为4.5_4.9，离心分离，取上清液备用；^^’2氯仿-甲醇提取复合脂质：将步骤（1中提取的上清液中加入氯仿—甲醇溶液，搅拌后离心;分层后，吸取下层有机相，上层水相加入氯仿-甲醇溶液按上述步骤再次提取有机相，重复两次或两次以上，收集有机相旋转蒸发除去氯仿-甲醇，得到粘稠液体后氮吹至固态，即为复合脂质；⑶丙酮沉淀乳极性脂质:在步骤⑵所得复合脂质中加入丙酮后搅拌;收集过滤后沉淀，得到乳极性脂质。^2.根据权利要求1所述的乳极性脂质的提取方法，其特征在于，所述步骤（D中，所述酪乳粉质量与蒸馏水的体积比为1:7-10。3.根据权利要求1所述的乳极性脂质的提取方法，其特征在于，所述步骤⑴中，离心时间为15-30min，转速4000_8000rmin。4.根据权利要求1所述的乳极性脂质的提取方法，其特征在于，所述步骤2中，所述氯仿与甲醇的体积比为2:1。5.根据权利要求1所述的乳极性脂质的提取方法，其特征在于，所述步骤⑵中氯仿-甲醇混合液体积与上清液体积比为1:4_6。6.根据权利要求1所述的乳极性脂质的提取方法，其特征在于，所述步骤⑵中，搅拌速率为400-600rmin;离心时间为15_30min，转速6000-8000rmin。7.权利要求1所得乳极性脂质在制备乳极性脂质体中的应用，其特征在于，将酪乳粉中提取的乳极性脂质和胆固醇按摩尔比1:0.5-3混合，通过薄膜分散法制得乳极性脂质体。8.权利要求7所述的乳极性脂质在制备乳极性脂质体中的应用，其特征在于，所述乳极性脂质和胆固醇的按摩尔比1:2混合，制备乳极性脂质体。9.根据权利要求7所述的乳极性脂质在制备乳极性脂质体中的应用，其特征在于，将乳极性脂质溶于氯仿，加入胆固醇，混合后加入反应器中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入纯水后水化，将水化后的脂质体悬浮液进行超声制得均匀的乳极性脂质体。10.根据权利要求9所述的乳极性脂质在制备乳极性脂质体中的应用，其特征在于，水化温度为37。：，时间lh;超声时间5s，超声间隙7s，S0次，超声功率4〇〇1

百度查询： 南京师范大学 一种乳极性脂质的提取方法及其应用

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