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【发明授权】抗Orai1抗体_第一三共株式会社_201580054267.1 

申请/专利权人:第一三共株式会社

申请日:2015-08-06

公开(公告)日:2021-04-13

公开(公告)号:CN106795512B

主分类号:C12N15/09(20060101)

分类号:C12N15/09(20060101);A61K39/395(20060101);A61P7/00(20060101);A61P29/00(20060101);A61P35/00(20060101);A61P37/00(20060101);C07K16/18(20060101);C07K16/46(20060101);C12N1/15(20060101);C12N1/21(20060101);C12N5/10(20060101);C12P21/08(20060101)

优先权:["20140807 JP 2014-161449"]

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.04.13#授权;2017.06.23#实质审查的生效;2017.05.31#公开

摘要:本发明的目的是提供用于移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓、癌症等的治疗和或预防剂,所述药剂靶向人Orai1。提供包含具有特异性识别人Orai1并抑制人T细胞活化的活性的抗体的药物组合物等。

主权项:1.抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合由SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。

全文数据:抗Orai1抗体技术领域[0001]本发明涉及提供用于治疗病症或疾病的更高度活性的抗Orail抗体。背景技术[0002]I丐释放活化的I丐(CRAC通道是I丐库操纵性I丐通道(store-operatedchannels,S0C的子集,所述钙库操纵性钙通道响应于胞内内质网中储存的钙的消耗而打开,且响应于胞外钙进入特定的非可兴奋性细胞,具体而言,免疫系统的细胞包括T细胞和肥大细胞,和细胞因此的活化。CRAC通道活性的抑制剂是本领域已知的,且其鉴定和治疗潜能已由Feske等人描述非专利文献1和2。[0003]OraiICRACM1:钙释放活化的钙调节子1,跨膜蛋白142A:TMEM142A,是由301个氨基酸残基构成的4次跨膜蛋白,已经被鉴定为通过形成同四聚体而构成CARC通道的孔形成亚基的组分专利文献1和非专利文献3-5Arai基因家族包括人Orail基因以及人0rai2和人0rai3基因,其各自与人Orail基因具有90%或更高的同源性非专利文献6。在一些情况下,形成包含0rai2和或0rai3蛋白和Orai1的异四聚体或异六聚体的可能性也已经被报道非专利文献7和8Arai1由以下构成:偶联SHM-I基质相互作用分子1或SHM-2其为感受胞内内质网中储存的钙的消耗的蛋白)的N末端和C末端胞质区、和4个跨膜结构域、由大约20个氨基酸残基构成的第一胞外环结构域、和由大约40个氨基酸残基构成的第二胞外环结构域非专利文献9Arail的DNA序列和氨基酸序列可获自公共数据库并且可以指定在例如登录号NM_032790和NP_116179NCBI下。[0004]已经发现人Orail基因功能的先天性缺陷消除了CRAC通道活性并取消了机体对免疫原的应答,导致严重的免疫缺陷病况。因此,Orail的分子功能已证实对于活化CRAC通道是必需的(非专利文献10和11。因此,靶向Orail分子的功能阻断性抗体可以用作CRAC通道活性的抑制剂。[0005]在暗示CRAC通道活性抑制剂可以用于治疗患有免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、细胞或器官的移植、血栓形成、癌症等的患者这一信息非专利文献12的教导下,已经尝试获得目标在于抑制Orail的分子功能的抗Orail抗体,并且已经研究了它们的作用(非专利文献2和3以及专利文献13和14。尽管该文献表明每一抗体单独抑制T细胞的活化,但抑制活性仍不是足够强。这些抗体作为靶向Orail的生物制剂的临床应用可能无法满足在需要高剂量或频繁施用、受限的施用方法等方面的临床需要。[0006]引用列表专利文献专利文献1:国际申请号W007081804专利文献2:国际申请号WOl1063277专利文献3:国际申请号W013091903非专利文献非专利文献I:FeskeS,NatureRev.Immunol.7,第690-702页(2007非专利文献2:DerlerI,等人,ExpertOpin.DrugDiscovery37,第787-800页(2008非专利文献3:PrakriyaΜ,等人,Nature443,第230-233页(2006非专利文献4:VigM,等人,Science312,第1220-1223页(2006非专利文献5:ParkCY,等人,Cell136,第876-890页(2008非专利文献6:MercerJC,等人,J.Biol.Chem.281,第24979-24990页(2006非专利文献7:GwackY,等人,Βίο1·αιθπι·282,第16232-16243页(2007非专利文献8:HouX,等人,Science338,第1308-1313页(2012非专利文献9:VigM,等人,Curr.Biol.16,第2073-2079页(2006非专利文献l〇:FeskeS,Nature441,第179-185页(2006非专利文献11:McCarlCA,等人,J.AllergyClin.Immunol.124,第1311-1318页2009非专利文献12:McCarlCA,等人,J.Immunol.185,第5845-5858页(2010非专利文献13:LinF,等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.345,第225-238页(2013非专利文献14:CoxJH,等人,PLOSONE812,e829442013。[0007]发明概述技术问题本发明的目标是提供用于移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成、癌症等的治疗和或预防剂。[0008]问题的解决方案本发明人出于搜寻对移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成或癌症具有治疗和或预防作用的物质的目的,已经获得大鼠抗Orail抗体。所获得的大鼠抗Orail抗体已经人源化,并且已经工程化该人源化抗体的CDR、框架和可变区。以这种方式,完成了本发明。[0009]具体而言,本发明包括以下方面:1抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合由SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:104、106、107和108中任一种代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:109或110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:93、94和95中任一种代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:96、97和98中任一种代表的氨基酸序列组成,和⑶RL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0010]2根据(1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中重链序列包含具有⑶RHl、⑶RH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和⑶RL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0011]3根据(1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中重链序列包含具有⑶RHl、⑶RH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:94代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:97代表的氨基酸序列组成,和CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0012]4根据(1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中重链序列包含具有⑶RHl、⑶RH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:95代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:98代表的氨基酸序列组成,和CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0013]5根据(1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中重链序列包含具有⑶RHl、⑶RH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:107代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和⑶RL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0014]6根据(1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中重链序列包含具有⑶RHl、⑶RH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:108代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和⑶RL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0015]7根据(1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中重链序列包含具有⑶RHl、⑶RH2和CDRH3的可变区,其中CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,CDRH2由SEQIDNO:104代表的氨基酸序列组成,和⑶RH3由SEQIDNO:109代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区,其中CDRLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,CDRL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和⑶RL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。[0016]8根据⑴或⑵的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。[0017]⑶根据8的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。[0018]10根据8的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:70代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。[0019]11根据(1或(3的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:58代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。[0020]12根据(11的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:58代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。[0021]13根据(1或4的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:60代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。[0022]14根据(13的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:60代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。[0023]15根据(1或(5的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:64代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。[0024]16根据(15的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:64代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。[0025]17根据(1或(6的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:66代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。[0026]18根据(17的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:66代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。[0027]19根据(1或(7的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:43代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。[0028]20根据(19的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:43代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-235的氨基酸残基组成。[0029]21根据(1-20中任一项的抗体的抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’)2、Fab’和Fv。[0030]22根据(1-8、(11、(13、(15、(17和(19中任一项的抗体,其中所述抗体是ScFv0[0031]23药物组合物,其包含根据(1-22的至少一种抗体或抗体的抗原结合片段。[0032]24根据(23的药物组合物,其中所述药物组合物是用于移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病或癌症的治疗和或预防剂、抗血小板或抗血栓活化剂或Orail表达细胞活化的抑制剂。[0033]25根据(24的药物组合物,其中所述移植排斥是针对移植器官或组织诸如心、肾、肝、骨髓、或皮肤的排斥反应和宿主抗移植物反应、和由移植造血细胞骨髓、外周血、脐带血等)引起的移植物抗宿主病。[0034]26根据24的药物组合物,其中所述免疫相关疾病是结缔组织或肌肉骨骼疾病类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎等)、血液病再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等)、胃肠道疾病克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、神经系统疾病多发性硬化、重症肌无力等)、眼疾病葡萄膜炎等)、血管疾病(白塞病、韦格纳肉芽肿等)、表皮疾病银肩病、天疱疮、白斑病等)、内分泌疾病(1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、桥本氏病等等,变应性性疾病是特应性皮炎、哮喘、过敏反应、类过敏反应、食物过敏、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫咬伤反应、对植物的反应、乳胶过敏、结膜炎、荨麻疹等,炎性疾病是炎症性肾病肾小球肾炎、肾病等)、炎性肺部疾病慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺炎等)、炎症性肠疾病溃疡性结肠炎、回肠炎等)、炎症性肝病(自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等)、炎性心脏病心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等)、炎症性皮肤疾病接触性皮炎、湿疹等)、炎症性眼病沙眼、眼内炎等)、炎症性中枢神经疾病脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎等)、炎症性关节疾病关节炎、骨关节炎等)、全身炎症败血症、出血、超敏反应、由癌症化疗等弓丨起的休克症状等),等等。[0035]27根据24的药物组合物,其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、皮肤癌、白血病等,和抗血小板或抗血栓活性可用于治疗和或预防的病例是心肌梗死、中风、缺血性心脏病、血栓形成等,和抑制Orail表达细胞活化可用于治疗和或预防的病例是肥大细胞白血病、月巴大细胞增多症、嗜碱细胞性白血病、子宫内膜异位症、管状聚集性肌病、Stormorken综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、特应性皮炎等等。[0036]28多核苷酸,其编码根据1-22中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。[0037]29载体,其包含根据28的多核苷酸。[0038]30转化的宿主细胞,其包含根据28的多核苷酸。[0039]31转化的宿主细胞,其包含根据29的载体。[0040]32用于产生根据(1-22中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的方法,其包括培养根据30或32的宿主细胞和从培养产物纯化抗体的步骤。[0041]33抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为80ngmL或更低。[0042]34根据(33的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为10ngmL或更低。[0043]35抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的人外周血单核细胞PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为100ngmL或更低。[0044]36根据(35的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为20ngmL或更低。[0045]37抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为800ngmL或更低。[0046]38根据(37的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为40ngmL或更低。[0047]本发明的有利效果根据本发明,可以获得基于抑制CRAC通道活性作为作用机制的用于移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成或癌症的治疗和或预防剂。[0048]附图简述[图1]图1是显示Rl18和R198各自以浓度依赖性方式结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。[0049][图2]图2是显示R118和R198各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。[0050][图3]图3是显示CR118和CR198各自以浓度依赖性方式结合PCDNA3.1-hOrail转染的HEK293T细胞的图。[0051][图4]图4是显示cR118和cR198各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。[0052][图5]图5是显示人源化抗人Orail抗体hR198_HlLl、hR198_H2L2、hR198_H3L3和hR198_H4L4如同亲本抗体cRl18或cR198各自以浓度依赖性方式结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。[0053][图6]图6是显示人源化抗人Orail抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。[0054][图7]图7是显示通过核糖体展示获得的突变的Fab克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057、HCDR046、HCDR047、HEP087、HEPl24和HEP237相比于亲本抗体FabhRl98_H4L4-Fab各自更强地结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。[0055][图8]图8是显示亲和力突变抗体hR198_H3LGl、hR198_HGlLGl、hR198_HGlLG2、hR198_HGlLG3、hR198_HG2LGl和hR198_HG3LGl以与亲本抗体hR198_H3L3或hR198_H4L4相当的或比起更强的水平各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。[0056][图9]图9是显示亲和力突变抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。[0057][图10]图10是显示10F8、14F74和17F6抗体各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。[0058][图11]图11是显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1·1和5H3·1抗体各自结合pcDNA3·1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。[0059][图12]图12是显示抗Orail单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。[0060][图13]图13是显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1·I、5H3·I、10F8、14F74和17F6针对从Jurkat细胞的IL-2释放的半最大抑制浓度(IC5q和80%抑制浓度(IC80的图。[0061][图14]图14是显示编码Rl18轻链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。[0062][图15]图15是显示编码Rl18重链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。[0063][图16]图16是显示编码R198轻链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。[0064][图17]图17是显示编码R198重链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。[0065][图18]图18是显示编码人嵌合cRl18轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0066][图19]图19是显示编码人嵌合CR198轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0067][图20]图20是显示编码人嵌合cRl18重链的核苷酸序列和重轻链的氨基酸序列的图。[0068][图21]图21是显示编码人嵌合cR198重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0069][图22]图22是显示编码hR198_Ll型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0070][图23]图23是显示编码hR198_L2型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0071][图24]图24是显示编码hR198_L3型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0072][图25]图25是显示编码hR198_L4型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0073][图26]图26是显示编码hR198_Hl型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0074][图27]图27是显示编码hR198_H2型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0075][图28]图28是显示编码hR198_H3型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0076][图29]图29是显示编码hR198_H4型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0077][图30]图30是显示编码hR198_LGl型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0078][图31]图31是显示编码hR198_LG2型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0079][图32]图32是显示编码hR198_LG3型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0080][图33]图33是显示编码hR198_HGl型重链的核苷酸序列和轻重链的氨基酸序列的图。[0081][图34]图34是显示编码hR198_HG2型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0082][图35]图35是显示编码hR198_HG3型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0083][图36]图36是显示编码hR198_H4-LALA型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0084][图37]图37是显示编码hR198_HGl-LALA型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0085][图38]图38为显示对应于。1?118、。1?198、111?198_1^1至111?198_1^4和111?198_1^1至hR198_LG3轻链的每一个和。1?118、^?198、111?198_!11至111?198_!14、111?198_邪1至111?198_邪3、hR198_H4-LALA和hR198_HGl-LALA重链的每一个中包含的CDR序列的SEQIDNO的图。[0086][图39]图39是显示编码2C1.1抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0087][图40]图40是显示编码2C1.1抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0088][图41]图41是显示编码5H3.1抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0089][图42]图42是显示编码5H3.1抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0090][图43]图43是显示编码10F8抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0091][图44]图44是显示编码10F8抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0092][图45]图45是显示编码14F74抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0093][图46]图46是显示编码14F74抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0094][图47]图47是显示编码17F6抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0095][图48]图48是显示编码17F6抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。[0096][图49]图49是显示编码hR198_H0型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0097][图50]图50是显示编码hR198_H5型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。[0098][图51]图51是显示抗Orail单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IL-2释放的图。[0099][图52]图52是显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1·I、5H3·I、10F8、14F74和17F6针对从人I3BMC的IL-2释放的半最大抑制浓度(IC5q和80%抑制浓度(IC8q的图。[0100][图53]图53是显示抗Orail单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IFN-γ释放的图。[0101][图54]图54是显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1·I、5Η3·I、10F8、14F74和17F6针对从人PBMC的IFN-γ释放的半最大抑制浓度(IC5q和80%抑制浓度(IC8q的图。[0102][图55]图55是显示hR198_HGlLGl抑制与由移植人PBMC至严重联合免疫缺陷小鼠发生的移植物抗宿主病相关的体重减轻的图。[0103][图56]图56是显示hR198_HGlLGl抑制人Orail敲入小鼠中诱导的被动皮肤过敏反应的图。[0104][图57]图57是显示hR198_HGlLGl在抗原施用后的6小时A、24小时(B和48小时C的各个时间点抑制人Orail敲入小鼠中诱导的迟发性超敏反应的图。[0105][图58]图58是显示hR198_HGlLGl、hR198_H3LGl、hR198_HGl-LALALGl和2C1·1抗体以90mgmL、120mgmL和150mgmL的浓度测量的粘度。[0106]实施方案描述在本说明书中,术语“基因”不仅包括DNA,还包括mRNA、cDNA和cRNA。[0107]在本说明书中,术语“多核苷酸”用如核酸的相同含义使用且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。[0108]在本说明书中,术语“多核苷酸”和术语“蛋白”可彼此互换使用。[0109]在本说明书中,术语“RNA级分”指含有RNA的级分。[0110]在本说明书中,术语“细胞”包括个体动物和培养细胞中的细胞。[0111]在本说明书中,术语“Orail”用与Orail蛋白的相同含义使用。[0112]在本说明书中,术语“抗体的抗原结合片段”意指具有针对抗原的结合活性的抗体的部分片段且包括从抗体片段形成的Fab、Fab’)2、Fv、SCFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体等等。抗体的抗原结合片段也包括Fab’,其为通过在还原性条件下处理Fab’)2获得的抗体可变区的单价片段。然而,抗体的抗原结合片段不限于这些分子,只要抗原结合片段具有结合抗原的能力。此类抗原结合片段不仅包括通过用合适的酶处理抗体蛋白的全长分子获得的片段,还包括使用基因工程化的抗体基因在合适的宿主细胞中产生的蛋白。[0113]抗体分子的重链和轻链已知各自具有三个互补性决定区域CDR。互补性决定区域也称为高变域。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有尤其高度变化的一级结构且在重链和轻链多肽链的各一级结构上分布在三个位置。在本说明书中,抗体的互补性决定区域对于重链的互补性决定区域而言自重链氨基酸序列的氨基末端称为⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3,且对于轻链的互补性决定区域而言自轻链氨基酸序列的氨基末端称为⑶RLlXDRL2和⑶RL3。这些位点在三维结构上彼此靠近且决定针对待结合抗原的特异性。[0114]在本发明中,短语“在严格条件下杂交”意指在涉及在68°C下杂交的条件下在可商贝勾杂交溶液ExpressHybHybridizationSolutionClontechLaboratories,Inc.中的杂交,或者在0.7-1.0MNaCl存在的情况下在68°C下使用DNA固定化滤器杂交,随后在68°C下使用具有0.1-2X浓度的SSC溶液具有IX浓度的SSC由150mMNaCl和15mM柠檬酸钠组成洗涤,其允许在与其等同的条件下鉴定或杂交。[0115]在本发明中,术语“宿主抗移植物反应”指器官移植后观察到的受体的超免疫状态和由其产生的对移植器官的损伤。[0116]在本发明中,术语“移植物抗宿主病”指表现为在造血细胞移植后由移植的细胞对受体的免疫攻击的症状。[0117]I.Orail本发明中使用的Orail可以直接从人、非人哺乳动物例如,豚鼠、大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、牛或猴)、或鸡的T细胞或肥大细胞中纯化,或者可以用于从细胞制备的细胞膜级分中。可选地,Orail可以体外合成或者通过基因操作从宿主细胞中产生来获得。在此类基因操作中,具体而言,将OraiIcDNA插入允许表达的载体中,并随后在含有转录和翻译所必需的酶、底物和能量物质的溶液中合成Orail,或者通过转化不同的原核或真核生物的宿主细胞进行表达来获得蛋白。[0118]人OrailcDNA的核苷酸序列登记在GenBank中登录号:NM_032790下。小鼠OrailcDNA的核苷酸序列登记在GenBank中登录号:NM_175423下。编码人Orail的核苷酸序列显示于序列表中的SEQIDNO:1中,并且人Orail的氨基酸序列显示于序列表中的SEQIDNO:2中。Orail也称为钙释放活化钙调节子ICRACMl或跨膜蛋白142ATMEM142A,其均表不相同分子。[0119]OrailcDNA可以通过所谓的PCR方法获得,所述方法涉及进行聚合酶链反应下文中称为“PCR”)(Saiki,R.K·,等人,Science,1988239,487-49,例如,用表达OrailmRNA的器官的cDNA文库作为模板使用特异性扩增OrailcDNA的引物。[0120]术语“OrailcDNA”还包括这样的多核苷酸,其在严格条件下与由与编码人或小鼠Orail的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的的多核苷酸杂交并且编码具有与Orail等同的生物活性的蛋白。术语“OrailcDNA”进一步包括已由人或小鼠Orail基因座转录的剪接变体的cDNA或在严格条件下与其杂交且编码具有与Orail等同的生物活性的蛋白的多核苷酸。[0121]术语“Orail”还包括这样的蛋白,所述蛋白由来源于人或小鼠Orail的氨基酸序列的氨基酸序列或者其通过取代、缺失或添加1、2或3、或4或5个氨基酸而不含信号序列的氨基酸序列组成并且具有与Orail等同的生物活性。术语“Orail”还包括这样的蛋白,所述蛋白由从人或小鼠Orail基因座转录的剪接变体编码的氨基酸序列或者来源于该氨基酸序列并取代、缺失或添加1、2或3、或4或5个氨基酸的氨基酸序列组成并且具有与Orail等同的生物活性。[0122]2.抗Orail抗体的产生本发明的针对Orai1的抗体可以根据常规方法通过用Orai1或选自Orai1的氨基酸序列的任意多肽免疫动物并收集和纯化体内产生的抗体来获得。用作抗原的Orail的物种不限于人,并且可以用来源于非人动物诸如小鼠或大鼠的Orail免疫动物。在这种情况下,所获得的结合异源Orail的抗体可以用人Orail测试其交叉反应性以选择可应用于人疾病的抗体。抗原Orail可以通过基因操作通过允许宿主细胞产生Orail基因来获得。具体而言,制备允许表达Orail基因的载体并转染至宿主细胞以表达该基因。可以纯化表达的Orail。[0123]本发明针对Orail的抗体还可以通过使用DNA免疫方法来获得。DNA免疫方法是涉及用抗原表达质粒转染动物例如小鼠或大鼠)并在动物中表达抗原以诱导针对该抗原的免疫的方法。转染方法包括直接注射质粒入肌肉中的方法、注射质粒和脂质体、聚乙烯亚胺等的复合物入血管中的方法、使用病毒载体的方法、使用基因枪注射附有质粒的金颗粒、以大量快速注射质粒溶液入血管的水动力学法,等等。称为体内电穿孔的技术涉及应用电穿孔至给予肌内注射的质粒的位点,其已知是用于提高注射表达质粒至肌肉的转染方法的表达水平的方法(AiharaH,MiyazakiJ·,NatBiotechnol.1998Sep;169:867-70或MirLMjBureauMFjGehlJjRangaraRjRouyDjCaillaudJMjDelaerePjBranellecDjSchwartzBjSchermanD.,ProcNatlAcadSciUSA.1999Apr13;968:4262-7。该方法通过用透明质酸酶处理肌肉随后肌内注射质粒来进一步提高表达水平(McMahonJMl,SignoriE,WellsKE,FazioVM,WellsDJ.,GeneTher.2001Aug;816:1264-70。[0124]单克隆抗体还可以根据本领域已知的方法(例如,Kohler和Milstein,Nature1975256,ρ·495-497;和Kennet,R.编辑,MonoclonalAntibodies,p·365-367,PlenumPress,N.Y.1980通过融合产生针对Orail的抗体的产抗体细胞与骨髓瘤细胞以建立杂交瘤来获得。此类方法的具体实例描述于国际公开号W00948072公开于2009年4月16日)和W010117011公开于2010年10月14日)。[0125]因此建立的大鼠抗人Orail抗体的实际实例可以包括Rl18和R198抗体。Rl18抗体的轻链可变区的氨基酸序列显示于序列表的SEQIDNO:11中并且R118抗体的重链可变区的序列显示于序列表的SEQIDNO:13中。R198抗体的轻链可变区的氨基酸序列显示于序列表的SEQIDNO:15中并且R198抗体的重链可变区的序列显示于序列表的SEQIDNO:17中。[0126]本发明的抗体包括上文所述的针对Orai1的单克隆抗体以及对于例如减少针对人的异种抗原性的目的而人工工程化的重组抗体,例如,嵌合抗体和人源化抗体、人抗体,等等。这些抗体可以通过使用已知方法来产生。[0127]嵌合抗体的实例可以包括含有来源于不同物种的抗体的可变区和恒定区,例如,连接人来源的恒定区的小鼠或大鼠来源的抗体的可变区的嵌合抗体(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,1984〇[0128]来源于大鼠抗人Orail抗体R118的嵌合抗体的实例可以包括由包含由SEQIDNO:23的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:27的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。此类Rl18来源的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体,所述轻链由SEQIDNO:23的位置21-234处的氨基酸残基组成且所述重链由SEQIDNO:27的位置20-466处的氨基酸残基组成。在本说明书中,这种抗体称为“cRl18”或“cRl18抗体”。[0129]来源于大鼠抗人Orail抗体R198的嵌合抗体的实例可以包括由包含由SEQIDNO:25的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:29的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。此类R198来源的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体,所述轻链由SEQIDNO:25的位置21-234处的氨基酸残基组成且所述重链由SEQIDNO:29的位置20-466处的氨基酸残基组成。在本说明书中,这种抗体称为“cRl98”或“cRl98抗体”。[0130]上述针对Orai1的嵌合抗体的序列可以人工工程化以制备作为基因重组抗体的人源化抗体,用于例如降低针对人的异种抗原性的目的。本发明的抗体包括其CDR为人源化抗体的工程化的⑶R的抗体。这些抗体可以通过使用已知方法来产生。[0131]人源化抗体的实例可以包括含有单独嫁接入人来源的抗体中的互补性决定区域⑶R的抗体参见Nature1986321,第522-525页),和包含⑶R序列以及嫁接入人抗体的框架部分的氨基酸残基的抗体(国际公开号W09007861。[0132]来源于cR118或cR198的人源化抗体保留来源于cR118或cR198的所有6个⑶R序列并具有抑制T细胞活化的活性。人源化抗体的轻链可变区保留由SEQIDNO:92RASQSIGNSLS代表的氨基酸序列组成的CDRLl和由SEQIDNO:116RASQSISNSLS代表的氨基酸序列组成的⑶RLl中任一者、由SEQIDNO:96STSTLES代表的氨基酸序列组成的CDRL2、和由SEQIDNO:99LQFATFPDT代表的氨基酸序列组成的CDRL3和SEQIDNO:100LQFATYPDT中显示的CDRL3中任一者。而且,人源化抗体的重链可变区保留由SEQIDNO:102AYYIS代表的氨基酸序列组成的CDRHl和SEQIDNO:103SYYIS中显示的CDRHl中任一者、由SEQIDNO:104YIDMGNGRTNYNARFKG代表的氨基酸序列组成的CDRH2和SEQIDNO:105YVDMGNGRTNYNEKFKG中显示的CDRH2中任一者、和由SEQIDNO:109DSNWGVDY代表的氨基酸序列组成的⑶RH3。⑶R的这些氨基酸序列还显示于图38中。[0133]具有优选组合的⑶R的抗体的实例可以包括含有由SEQIDNO:92代表的氨基酸序列组成的CDRLl、由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQIDNO:100代表的氨基酸序列组成的⑶RL3、由SEQIDNO:103代表的氨基酸序列组成的⑶RHl、由SEQIDNO:105代表的氨基酸序列组成的⑶RH2和由SEQIDNO:109代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体,和含有由SEQIDNO:92代表的氨基酸序列组成的CDRLl、由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成的⑶RL2、由SEQIDNO:99代表的氨基酸序列组成的⑶RL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的⑶RHl、由SEQIDNO:104代表的氨基酸序列组成的⑶RH2和由SEQIDNO:109代表的氨基酸序列组成的⑶RH3的抗体。[0134]人源化抗体的优选实例可以包括由包含由SEQIDNO:31的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:39的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQIDNO:33的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:41的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQIDNO:35的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:43的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、和由包含由SEQIDNO:37的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:45的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。[0135]其更优选的实例可以包括由由SEQIDNO:31的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:39的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:33的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:41的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:35的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:43的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、和由由SEQIDNO:37的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:45的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体。[0136]本发明的抗体可以是通过进一步突变上述人源化抗体获得的具有结合Orai1的新兴能力的抗体。此类方法称为亲和力成熟。该方法的具体实例可以包括核糖体展示方法。核糖体展示方法是涉及使用经核糖体结合到具有其遗传信息的mRNA的蛋白的三重复合物tripartitecomplex并分离编码结合革巴分子的蛋白的基因序列的方法(StaffordRL.等人,ProteinEng.Des.Sel.2014⑷:97-109。[0137]通过上述方法基因工程化的抗体的轻链可变区保留由SEQIDNO:93RASQSIGGSLS代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQIDNO:94HASQNIGGSLS代表的氨基酸序列组成的⑶RLl和由SEQIDNO:95HASRNIGGSLS代表的氨基酸序列组成的CDRLl中任一种,由SEQIDNO:96STSTLES代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQIDNO:97LTSTLDW代表的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQIDNO:98LTSSLDW代表的氨基酸序列组成的⑶RL2中任一种,和由SEQIDNO:101LQFAIFPDS代表的氨基酸序列组成的⑶RL3。而且,基因工程化的抗体的重链可变区保留由SEQIDNO:102AYYIS代表的氨基酸序列组成的CDRH1,由SEQIDNO:104YIDMGNGRTNYNARFKG代表的氨基酸序列组成的CDRH2、由SEQIDNO:106YIDMGNGRTDYNARFKG代表的氨基酸序列组成的CDRH2、由SEQIDNO:107YIDMGNGRTDYNGRFKG代表的氨基酸序列组成的CDRH2和显示于SEQIDN0:108YIDMGNGRTDY匪RFKG中的CDRH2中任一种,和由SEQIDN0:109DSNWGVDY代表的氨基酸序列组成的⑶RH3或由SEQIDNO:110DSNWGADY代表的氨基酸序列组成的⑶RH3。⑶R的这些氨基酸序列还显示于图38中。[0138]具有优选组合的⑶R的抗体的实例可以包括含有由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成的CDRLl、由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成的⑶RL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的⑶RHl、由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成的⑶RH2和由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体,含有由SEQIDNO:94代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQIDNO:97代表的氨基酸序列组成的⑶RL2、由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成的⑶RL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的⑶RHl、由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成的⑶RH2和由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成的⑶RH3的抗体,含有由SEQIDNO:95代表的氨基酸序列组成的⑶RLl、由SEQIDNO:98代表的氨基酸序列组成的⑶RL2、由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成的⑶RL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的CDRHl、由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成的⑶RH3的抗体,含有由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成的⑶RL1、由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成的⑶RL2、由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的CDRHl、由SEQIDNO:107代表的氨基酸序列组成的⑶RH2和由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成的⑶RH3的抗体,含有由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成的⑶RLl、由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQIDNO:108代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成的⑶RH3的抗体,和含有由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成的CDRHl、由SEQIDNO:104代表的氨基酸序列组成的⑶RH2和由SEQIDNO:109代表的氨基酸序列组成的⑶RH3的抗体。[0139]CDR抗体的优选实例可以包括由包含由SEQIDNO:56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:62的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQIDNO:58的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:62的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQIDNO:60的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:62的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQIDNO:56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:64的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQIDNO:56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:66的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、和由包含由SEQIDNO:56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQIDNO:43的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。[0140]包含上述轻链可变区和重链可变区的抗体的优选实例可以包括由由SEQIDNO:56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:62的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:58的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:62的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:60的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:62的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:64的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:66的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、和由由SEQIDNO:56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:43的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体。[0141]为了规避针对表达人Orail的正常细胞的细胞毒性,期望抗体应具有低效应子活性。效应子活性已知在抗体亚类中是不同的。观察到以下特征,例如,IgG4具有低ADCC和CDC活性,且IgG2具有⑶C活性,但具有低ADCC活性。在这些特征的基础上,可以通过用IgG2或IgG4的恒定区置换IgGl的恒定区来制备具有降低的ADCC和CDC活性的抗体。而且,可以通过参考IgG2或IgG4部分取代IgGl的恒定区序列来制备具有降低的ADCC和CDC活性的IgGl抗体。作为一个实例,MarjanHezareh等人,JournalofVirology,7524:12161-121682001显示IgGl的ADCC和CDC活性通过用丙氨酸残基置换IgGl的位置234和235位置通过Kabat等人的EU索引来表示处的每一亮氨酸残基来降低。[0142]通过上述方法制备的抗Orail抗体的实例可以包括SEQIDNO:68或70中显示的重链序列。SEQIDNO:70或72中显示的重链可以与本说明书中描述的每一轻链序列组合并用作治疗性抗体。待组合的轻链的具体实例可以包括SEQIDNO:31、33、35、37、56、58或60中描述的抗体。具有优选组合的轻链和重链的抗体的实例可以包括由由SEQIDNO:56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:70的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQIDNO:58的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:70的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、和由由SEQIDNO:60的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQIDNO:70的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体。[0143]已知羧基末端赖氨酸残基在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链中被缺失JournalofChromatographyA,705:129-1341995。还已知两个駿基末端氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)在重链中缺失,且新位于羧基末端的一个脯氨酸残基被酰胺化AnalyticalBiochemistry,360:75-832007。然而,重链序列的此类缺失和修饰对于抗体结合抗原的能力和抗体的效应子功能补体活化和抗体依赖性细胞毒性作用等并无影响。因此,本发明的抗体还包括因此修饰的抗体。其实例可以包括通过缺失重链羧基末端处的1个2个氨基酸获得缺失突变体和该缺失突变体的酰胺化形式例如,在羧基末端位点处的脯氨酸残基处酰胺化的重链)。然而,根据本发明的抗体的重链羧基末端缺失突变体不限于上述类型,只要缺失突变体保留结合抗原的能力和效应子功能。构成根据本发明的抗体的两个重链可以是选自全长重链和上述的缺失突变体的重链的任一种类型的重链,或者可以是由其所选的任两种类型的组合。每一缺失突变体的定量比率可以受产生根据本发明的抗体的培养哺乳动物细胞的类型和培养条件所影响。根据本发明的抗体的主要组分的实例可以包括两个重链,其两者均缺少一个羧基末端氨基酸残基。具体而言,由显示于序列表的SEQIDNOs:27、29、39、41、43、45、62、64、66、68和70的每一个中的重链序列中位置20_465处的氨基酸残基组成的重链或由其中位置20-464处的氨基酸残基组成的重链也可以用于本发明的抗体中。[0144]通过这些方法获得的抗体可评价其针对抗原的结合活性以选择合适的抗体。另一个比较抗体特性的指标的一个实例可以包括抗体稳定性。差示扫描量热法DSC是能够快速且准确测量热变性中点Tm的方法,所述热变性中点Tm用作蛋白的相对结构稳定性的良好指标。Tm值可以使用DSC测量比进行比较以确定不同的热稳定性。抗体的储存稳定性已知在一些程度上与抗体的热稳定性相关(LoriBurton,等人,PharmaceuticalDevelopmentandTechnology2〇〇7I2,ρ·265-273。合适的抗体可以用热稳定性作为指标进行选择。其他选择抗体的指标实例可以包括在合适宿主细胞中的高产量和水溶液中的低聚集。例如,由于具有最高产量的抗体并不总是展示出最高的热稳定性,最适合施用于人的抗体必须基于上述指标通过综合判断来选择。[0145]通过经合适接头连接抗体的全长重链和轻链序列获得单链免疫球蛋白的方法也是已知的(Lee,H-S,等人,MolecularImmunology199936,Ρ.61_71;andShirrmann,Τ·等人,mAbs2010,21,ρ·1-4。此类单链免疫球蛋白可以二聚化以由此保持与原始为四聚体的抗体相似的结构和活性。而且,本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且没有轻链序列的抗体。此类抗体称为单域抗体sdAb或纳米抗体,已实际在胳盤和美洲盤中观察到并报道为保持结合抗原的能力MuyldemansS.等人,ProteinEng.199479,1129-35;和Hamers-CastermanC·等人,Nature19933636428,446-8。这些抗体可以解释为根据本发明的抗体的一类抗原结合片段。[0146]本发明的抗体的抗体依赖性细胞细胞毒性活性可以通过调整结合到抗体的糖链的修饰来增强。例如,W09954342、W00061739和W00231140中描述的方法已知作为调整抗体的糖链修饰的此类技术的实例,尽管该技术并不限于此。[0147]在通过暂时分离抗体基因并随后转移基因至合适宿主中制备抗体的情况下,合适宿主可以与表达载体组合使用。抗体基因的具体实例可以包括编码本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其轻链序列的基因的组合。对于转化宿主细胞,重链序列基因和轻链序列基因可以插入到相同表达载体中或可以插入不同的表达载体中。在使用宿主真核细胞的情况下,可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。动物细胞的实例可以包括⑴哺乳动物细胞,例如,猴⑶S细胞(Gluzman,Y·,Cell198123,P.175-182,ATCCCRL-1650、小鼠成纤维细胞NIH3T3ATCCNo.CRL-1658和中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞,八丁0:0^-61的二氢叶酸还原酶缺乏细胞系(1^131113,6.和0^8丨11,1^^.,?1〇3.恥七1·Acad.Sci.U.S.A.198077,p.4126-4220。在使用原核细胞的情况下,其实例可以包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌ifeciiiussubiiiis。目标抗体基因通过转换转移入这些细胞,并且经转化的细胞体外培养以获得抗体。此类培养方法可以根据抗体序列而在产量上有所不同。可以选择容易作为药物产生的抗体,这通过使用其产量作为指标从具有等同的结合活性的抗体中来选择。[0148]本发明的抗体的同种型的实例可以包括但不限于IgGIgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgM、IgAIgAl和IgA2、IgD和IgE。同种型可以优选为IgG或IgM,更优选为IgGl或IgG2。[0149]本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合位点的抗体的抗原结合片段或其修饰形式。抗体片段可以通过用蛋白水解酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体或者通过在合适培养细胞中表达基因工程化的抗体基因来获得。在此类抗体片段中,保持抗体的全长分子所具有的全部或部分功能的片段可以称为抗体的抗原结合片段。[0150]抗体的功能的实例可以通常包括抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞细胞毒性活性、补体依赖性细胞毒性活性和补体依赖性细胞细胞毒性活性。根据本发明的抗体的抗原结合片段所具有的功能为针对Orail的结合活性且优选为抑制T细胞活化的活性,更优选为抑制由T细胞产生IL-2和或干扰素γ的活性。[0151]抗体片段实例可以包括Fab、Fab’)2、Fv、包含经合适接头连接的重链和轻链Fv单链FVscFV、双抗体、线性抗体和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的片段还包括Fab’,其是在还原性条件下通过处理Fab’)2获得抗体可变区的单价片段。[0152]本发明的抗体可以是具有对至少两种不同类型的抗原的特异性的多特异性抗体。此类分子通常结合两种类型的抗原(即,双特异性抗体)。根据本发明的“多特异性抗体”包括具有多于多种类型例如3种类型抗原的特异性的抗体。[0153]本发明的多特异性抗体可以是由全长抗体组成的抗体或者可以是此类抗体的片段例如,Fab’)2双特异性抗体)。双特异性抗体可以通过连接两种类型抗体的重链和轻链HL对来制备,或者通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤以制备产生双特异性抗体的融合细胞来制备Millstein等人,Nature1983305,P.537-539。[0154]本发明的抗体可以是单链抗体单链Fv;也称为“scFv”)。通过经多肽接头连接抗体的重链可变区和轻链可变区获得scFvPluckthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113Rosenberg和Moore编辑,SpringerVerlag,NewYork,p.269-3151994;和NatureBiotechnology2005,23,p.1126-1136。此外,通过经多肽接头连接两个scFv制备的双scFv片段也可以用作双特异性抗体。[0155]制备scFv的方法是本领域所熟知的(参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030。在该scFv中,重链可变区和轻链可变区经接头连接,优选为多肽接头,其阻止其形成缀合物Huston,J.S·等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S·Α·1988,85,ρ.5879-5883^cFv中的重链可变区和轻链可变区可以来源于相同抗体或可以来源于不同抗体。例如,由12-19个残基组成的任意单链肽用作连接这些可变区的多肽接头。[0156]为了获得编码scFv的DNA,编码抗体的重链或重链可变区的DNA和编码其轻链或轻链可变区的DNA的序列中编码全部或期望的氨基酸序列的每一DNA部分用作模板并通过PCR使用侧接模板的两个末端的引物对来扩增。随后,编码多肽接头部分的DNA进一步组合侧接DNA的两个末端的引物对进行扩增,从而获得片段可以在其末端分别连接重链DNA和轻链DNA0[0157]一旦制备编码scFv的DNA,可以根据常规方法获得包含DNA的表达载体和转化有表达载体的宿主。此外,宿主可以用于获得根据常规方法的scFv。这些抗体片段可以以如上相同方式通过获得和表达该基因由宿主产生。[0158]本发明的抗体可以多聚化以由此增强其对于抗原的亲和力。相同类型的抗体可以多聚化或者分别识别相同抗原的多个表位的多种抗体可以多聚化。用于多聚化这些抗体的方法的实例可以包括结合两个scFv至IgGCH3结构域,其结合至链霉抗生物素和引入螺旋-转角-螺旋基序。[0159]本发明的抗体可以是作为氨基酸序列不同的多种类型的抗Orail抗体的混合物的多克隆抗体。多克隆抗体的一个实例可以包括CDR不同的多种类型抗体的混合物。通过培养产生不同抗体的细胞的混合物随后从培养物中纯化而获得的抗体可以用作此类多克隆抗体(参见W02004061104。[0160]缀合有多种分子的任一种诸如聚乙二醇I3EG的抗体也可以用作抗体的修饰形式。[0161]本发明的抗体可以进一步是由这些抗体与其他药物形成的缀合物免疫缀合物)的任一种。此类抗体的实例可以包括缀合有放射性材料或具有药理作用的化合物的抗体NatureBiotechnology200523,P.1137-1146。[0162]所获得的抗体可以纯化直至均质。常用的蛋白分离和纯化方法可以用于分离和纯化抗体。抗体可以通过合适选择的或组合的方法分离和纯化,例如,柱层析、经滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙稀酰胺凝胶电泳和或等电聚焦(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual,DanielR.Marshak等人编辑,ColdSpringHarborLaboratoryPress1996;和Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlow和DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory1988,尽管分离和纯化方法并不限于此。[0163]此类层析的实例可以包括亲和层析、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤层析、反向层析和吸附层析。这些层析方法可以使用液相层析诸如HPLC或FPLC进行。用于亲和层析的柱的实例可以包括蛋白A柱和蛋白G柱。蛋白A柱的实例可以包括HyperD、P0R0S和SepharoseF.F.PharmaciaCorp.。此外,抗体可以通过使用其针对抗原的结合活性使用抗原固定的载体来纯化。[0164]3.含有抗Orail抗体的药物中和Orail的生物活性的抗体可以获自通过前面段落“2.抗Orail抗体的产生”中所述的方法而获得的抗Orail抗体中。此类中和Orail的生物活性的抗体可以抑制Orail的体内活性,即以T细胞和肥大细胞为代表的表达Orail细胞的钙释放活化的钙通道CRAC通道)的活化并且因此,可以药学上用作用于由这些细胞的CRAC通道活化引起的疾病的治疗和或预防剂。[0165]由CRAC通道活化引起的疾病或病况包括移植排斥、免疫相关的疾病、变应性疾病、炎性疾病、抗血小板或抗血栓形成和癌症等。[0166]移植排斥的治疗和或预防的实例包括治疗和或预防针对移植器官或组织诸如心、肾、肝、骨髓、或皮肤的排斥反应和宿主抗移植物反应、和由移植造血细胞骨髓、外周血、脐带血等)引起的移植物抗宿主病。[0167]免疫相关疾病的实例包括结缔组织或肌肉骨骼疾病类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎等)、血液病再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等)、胃肠道疾病克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、神经系统疾病多发性硬化、重症肌无力等)、眼科疾病葡萄膜炎等)、血管疾病(贝切特氏病、韦格纳肉芽肿等)、表皮疾病银肩病、天疱疮、白斑病等)、和内分泌疾病(1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本氏病等)。[0168]变应性疾病的实例包括特应性皮炎、哮喘、过敏反应、类过敏反应、食物过敏、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫叮咬反应、对植物的反应、乳胶过敏、结膜炎和荨麻疹。[0169]炎性疾病的实例包括炎症性肾疾病肾小球性肾炎、肾病等)、炎症性肺疾病慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺炎等)、炎症性肠疾病溃疡性结肠炎、回肠炎等)、炎性肝病(自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等)、炎性心脏病心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等)、炎性皮肤疾病接触性皮炎、湿疹等)、炎性眼病沙眼、眼内炎等)、炎性中枢神经疾病脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎等)、炎症性关节疾病关节炎、骨关节炎等和全身炎症败血症、出血、超敏反应、癌症化疗引起的休克症状等,等等)。[0170]其中抗血小板或抗血栓形成活性可用于治疗和或预防的病例的实例是心肌梗塞、中风、缺血性心脏病和血栓形成。[0171]癌症治疗的实例包括乳腺癌、肺癌、皮肤癌和白血病。[0172]可以由本发明的抗体治疗的疾病的其他实例包括:涉及肥大细胞和嗜碱粒细胞的病理状况,诸如肥大细胞白血病、肥大细胞增多症、嗜碱粒细胞白血病和子宫内膜异位;和管状聚集性肌病、Stormorken综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和特应性皮炎,所述疾病由于CRAC通道的遗传机能亢进发生或者其发生风险由于CRAC通道的遗传机能亢进而增加。[0173]作为药物的抗Orai1抗体的实例可以包括从Rl18抗体和或Rl98抗体制备的人源化抗体及其⑶R工程化形式。[0174]抗Orai1抗体针对Orai1的生物活性的体外中和活性可以在例如针对表达Orai1的T细胞的活化的抑制活性基础上进行测量。例如,将抗Orai1抗体以不同浓度添加至人T细胞来源的细胞系Jurkat细胞,并且可以测量针对从用PMA和A23187刺激的Jurkat细胞的IL-2释放的抑制活性。此外,将抗Orail抗体以不同浓度添加至人外周血单核细胞PBMC,并且可以测量针对从用PM和A23187刺激的PBMC的IL-2和干扰素γ释放的抑制活性。[0175]负责发生移植物抗宿主病的细胞是T细胞是经实验证实的事实且广为承认。当移植的T细胞识别受体为外来物质时,基于由其自身产生的白细胞介素2IL-2的自繁殖和通过活化的炎性细胞因子诸如干扰素γIFN-γ释放引起全身性免疫炎症反应,导致发生移植物抗宿主病。因此,抑制这些细胞因子的产生可以预防或治疗移植物抗宿主病,而Orail抗体作为治疗药物的使用可以通过使用其抑制活性作为指标来确定。[0176]根据本发明的抗体的优选实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和Α23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为80ngmL或更低。该抗体更优选的实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为10ngmL或更低。本发明的抗体还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为60000ngmL或更低,以及这样的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为200ngmL或更低。[0177]根据本发明的抗体的可选的优选实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为100ngmL或更低。该抗体更优选的实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为20ngmL或更低。本发明的抗体还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为17000ngmL或更低,以及这样的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为400ngmL或更低。[0178]根据本发明的抗体的进一步的优选实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为800ngmL或更低。该抗体更优选的实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为40ngmL或更低。本发明的抗体还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制80%的浓度为300000ngmL或更低,以及这样的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人I3BMC释放的IFN-γ的量被抑制80%的浓度为2000ngmL或更低。[0179]抗Orai1抗体在实验室动物中对移植物抗宿主病的体内治疗或预防作用可以例如通过测量人I3BMC移植的小鼠移植物抗宿主病模型中的体重减轻来证实。具体而言,NOG或NSG小鼠,其为严重联合免疫缺陷小鼠,用2.0Gy的X射线照射。在第二天,将200yL含有15,000,000-50,000,000个细胞的人PBMCmL的I3BS溶液经尾静脉移植入每只小鼠中。未接受人PBMC的X射线照射的小鼠组用作非移植物抗宿主病组,和仅给予抗体的媒介物溶液的人PBMC移植的组用作移植物抗宿主病组。在人PBMC移植之前或之后,将抗Orail抗体静脉内施用至尾部或腹膜内施用以测量对移植物抗宿主病组中体重减轻的抑制作用。[0180]此外,抗Orail抗体对各种疾病的治疗或预防作用还可以通过以下体内评价系统使用人Orai1敲入小鼠来验证。[0181]对于对皮炎的作用,将蛋白抗原溶液腹膜内或静脉内施用给小鼠,并在2周后,对其注射抗原作为加强剂。随后,将如上的相同蛋白抗原溶液以3天至2周的时间间隔重复应用至耳部或背部3-6次,以引起皮炎。对皮炎的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间的耳廓厚度、背部皮炎的宏观评分,血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度和获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原来评价。[0182]对于对瘙痒的作用,将螨抗原霜剂(cream以3天至2周的时间间隔重复应用至耳廓或背部,或者将半抗原每天至每周一次应用至耳廓、腹部或背部,或将瘙痒诱导物质皮内施用至耳廓,皮下施用至背部或通过鞘内途径施用。由此类方法诱导的瘙痒动作通过使用连接至小鼠两只脚背的磁铁和瘙痒动作测量仪器来测量瘙痒事件的数目来量化,或者通过检查皮肤、外周血或脊髓组织中的病理体征来量化。对瘙痒的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间获得的结果来评价。[0183]对于对银肩病的作用,将咪喹莫特应用至耳廓和剃毛的背部的两侧或一侧,或者将酵母聚糖悬浮液腹膜内施用,或将细胞因子诸如IL-23皮内施用至小鼠耳廓的一侧。由此类方法诱导的银肩病性皮炎通过检查炎症部位的重量和厚度、浸润入部位的中性粒细胞的髓过氧物酶活性、浸润细胞的流式细胞术分析、基因分析、细胞因子浓度测量等来量化。对银肩病的作用通过比较在抗Orail抗体组和非施用组之间所获得的结果来评价。[0184]对于对多发性硬化的作用,通过与等量的弗氏完全佐剂的水溶液混合,将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白或其部分肽抗原的溶液乳化。将该乳状液皮内施用至小鼠的侧腹或腹部。随后,将百日咳毒素水溶液施用至尾静脉。几日后,将百日咳毒素溶液进一步再次施用至尾静脉以诱导实验性脑脊髓炎。实验1周或2周后发生且从尾部扩展至后肢和前肢的麻痹症状通过肉眼观察来评分。对多发性硬化的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间获得的结果来评价。[0185]对于对关节炎的作用,将通过混合牛II型胶原和弗氏完全佐剂获得的乳状液皮内施用至小鼠尾根部。2-3周后,进行如上相同施用。随后,对关节炎的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间的关节肿胀评分,血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度,获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓等的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原来评价。[0186]对于对结肠炎的作用,将三硝基苯磺酸施用入禁食24小时的小鼠的肠道内,或者允许小鼠从喂水瓶中自由饮用含有1-10%硫酸葡聚糖钠的水溶液持续4天至2周,或将从人Orail敲入小鼠的淋巴结和脾中收集并纯化的⑶4+⑶25-CD45RBhiT细胞腹膜内移植入Rag2-_小鼠。通过此类方法诱导的对结肠炎的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间在观察期过程中的体重、肠道的增厚程度、息肉的数目和大小、和测试完成后通过尸体解剖检查的病理体征,血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度,获自肠道、夕卜周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓等的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原来评价。[0187]对于对系统性红斑狼疮的作用,将卵白蛋白或另一非刺激性抗原以5-10天的时间间隔最大15次腹膜内或皮下施用以诱导系统性红斑狼疮样症状。对系统性红斑狼疮的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间在观察期过程中随时间收集的血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度,尿液中的抗体效价或生物标志物浓度、通过移植从测试完成后收集的器官诸如脾或淋巴结制备的细胞在未处理小鼠中诱导的症状等等来评价。[0188]对于对肝炎的作用,将D-半乳糖胺单独或与脂多糖组合腹膜内施用至小鼠,或者将伴刀豆球蛋白A单独静脉内施用至尾部。通过此类方法诱导的对肝炎的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间在施用致病物质后1小时至1周收集的血液中的GOT和GPT浓度和肝损伤的组织病理学状况来评价。[0189]对于对骨髓细胞移植中的移植物存活率的作用或者对移植物抗宿主病的预防作用,将从人Orail敲入小鼠的股骨或胫骨收集的骨髓中的细胞单独或与收集自人Orail敲入小鼠的脾的脾细胞组合移植至X射线照射的受体小鼠中。对移植物存活率的作用或者预防作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间4-16周的体重改变或存活率,测试完成时血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度,获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的表面抗原、生长活性或细胞因子产生能力来评价。[0190]对于对移植器官的移植物存活率的作用,将从宿主小鼠的尾根部收集的皮肤固定到通过切割人Orail敲入小鼠的背部皮肤暴露的肉膜。移植物的大小及其移植状态在移植后4-16周进行评分。对移植物存活率的作用通过比较抗Orail抗体组和非施用组之间获得的结果来评价。[0191]因此获得的中和Orail生物活性的抗体可用作药物,具体而言,用作用于预防或治疗移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病、抗血小板或抗血栓形成或癌症等的抗体。[0192]作为一个实例,抗Orail抗体可以单独或与用于治疗或预防移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病、抗血小板或抗血栓形成或癌症的至少一种另外的治疗剂组合施用。可以与抗Orail抗体组合施用的另外的治疗剂的实例可以包括但不限于抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂和靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂。[0193]这些治疗剂的具体实例可以包括:作为抗叶酸剂的甲氨蝶呤;作为钙依赖磷酸酶抑制剂的环孢霉素和他克莫司;作为肾上腺皮质类固醇的甲泼尼龙;作为核酸合成抑制剂的环磷酰胺;作为抗胸腺细胞球蛋白的Zetbulin、淋巴球蛋白和胸腺球蛋白;作为核酸抗代谢物的吗替麦考酚酯;作为靶向细胞表面抗原的生物制剂的阿仑单抗和利妥昔单抗;和作为靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂的英利昔单抗、依那西普和利妥昔单抗。[0194]取决于移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病、抗血小板或抗血栓形成、或癌症的病况或其治疗和或预防的目标,可以施用2、3或更多种类型的另外的治疗剂,并且这些另外的治疗剂可以包封在相同制剂中并同时施用。另外的治疗剂和抗Orail抗体可以包封在相同制剂中并同时施用。可选地,抗Orail抗体和另外的治疗剂可以包封在不同制剂中并同时施用。此外,另外的治疗剂和抗Orail抗体可以以交替方式分开施用。具体而言,包含抗Orail抗体或抗体的抗原结合片段作为活性成分的治疗剂可以在施用另外的治疗剂之后施用,或者另外的治疗剂可以在施用包含抗Orail抗体或抗体的抗原结合片段作为活性成分的治疗剂之后施用。在施用基因疗法的情况下,蛋白治疗剂的基因和抗Orail抗体的基因可以插入不同启动子区或相同启动子区的下游并引入不同载体或相同载体中。[0195]抗Orail抗体或其片段可以与治疗剂缀合以产生以下中描述的靶向药物缀合物:M.C.Garnet,"Targeteddrugconjugates:principlesandprogress”,AdvancedDrugDeliveryReviews,200153,171-216。为此目的,抗体分子以及任何抗体片段可以应用,只要抗体片段不完全丧失识别T细胞的特性。片段的实例可以包括Fab、Fab’)2和Fv片段。因此,抗体和片段可以用于本发明中。抗Orail抗体或抗体的片段和治疗剂之间的缀合模式可以是以下中描述的多种方式的任一种:M.C.Garnet,"Targeteddrugconjugates:principlesandprogress”,AdvancedDrugDeliveryReviews,200153,171-216,G.T.Hermanson,’’BioconjugateTechniques”,AcademicPress,California1996,Putnam和J.Kopecek,’’PolymerConjugateswithAnticancerActivity”,AdvancesinPolymerScience1995122,55-123,等。其具体实例可以包括其中抗Orail抗体和治疗剂以化学方式直接或经间隔基诸如寡核苷酸缀合的模式,和其中抗Orail抗体和治疗剂经合适的药物载体缀合的模式。药物载体的实例可以包括脂质体和水溶性聚合物。由这些药物载体介导的此类模式的实例可以更具体而言包括其中抗体和治疗剂通过缀合脂质体和抗体而包封在脂质体中的模式,和其中治疗剂以化学方式直接或经间隔基诸如寡核苷酸缀合水溶性聚合物具有1000-100,〇〇〇数量级的分子量的化合物)同时抗体也缀合水溶性聚合物的模式。抗体或片段与治疗剂或药物载体例如脂质体和水溶性聚合物)的缀合可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行,例如以下中描述的方法:G·T·Hermanson,’’BioconjugateTechniques”,AcademicPress,California1996和Putnam和J.Kopecek,"PolymerConjugateswithAnticancerActivity",AdvancesinPolymerScience1995122,55-123。治疗剂在脂质体中的包封可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行,例如以下中描述的方法:D.D.Lasic,"Liposomes:FromPhysicstoApplications",ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam1993,等。治疗剂与水溶性聚合物的缀合可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行,例如以下中描述的方法:D.Putnam和JKopecek,’’PolymerConjugateswithAnticancerActivity”,AdvancesinPolymerScience1995122,55-123。抗体(或片段)和蛋白治疗剂或片段)的缀合物可以通过上述任一种方法以及本领域技术人员熟知的遗传工程方法来制备。[0196]本发明还提供药物组合物,其包含治疗和或预防有效量的抗Orail抗体和药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和或添加剂。[0197]本发明还提供药物组合物,其包含治疗和或预防有效量的抗Orail抗体、治疗和或预防有效量的至少一种治疗剂和药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和或添加剂。治疗剂的实例可以包括但不限于上述的抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂和靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂。[0198]优选本发明的药物组合物中使用的药学上可接受的物质应该对于药物组合物的受体是无毒的,优选在剂量或施用浓度方面。[0199]本发明的药物组合物可以包含用于改变或维持PH、渗透压、粘度、透明性、颜色、等渗性、无菌性、稳定性、溶解性、持续释放、可吸收性或透性的药物材料。药物材料的实例可以包括但不限于以下:氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸;抗微生物剂;抗氧化剂诸如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠;缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐、或硼酸盐缓冲液、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液;填充物诸如甘露醇和甘氨酸;螯合剂诸如乙二胺四乙酸EDTA;络合剂如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精;填充剂如葡萄糖、甘露糖和糊精;其它碳水化合物如单糖和二糖;着色剂;矫正剂;稀释剂;乳化剂;亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;低分子量多肽;成盐抗衡离子;防腐剂如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢;溶剂如甘油、丙二醇和聚乙二醇;糖醇如甘露醇和山梨醇;悬浮剂;表面活性剂如脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20和聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇;稳定性增强剂如鹿糖和山梨醇;弹性增强剂elasticityenhancers如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨醇;转运剂;赋形剂;和或药物添加剂。添加的这些药物材料的量优选为抗Orai1抗体重量的0.01-100倍,尤其是0.1-10倍。制剂中药物组合物的合适处方可以由本领域技术人员根据可应用的疾病、可应用的施用途径等合适地确定。[0200]药物组合物中的赋形剂或媒介物可以是液体或固体。合适的赋形剂或媒介物可以是通常用于可注射水、生理盐水、人工脑脊液和肠胃外施用中的其他材料。中性生理盐水或含有血清白蛋白的生理盐水可用作媒介物。药物组合物可以包含pH7.0-8.5的Tris缓冲液、pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液或pH3.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液。这些缓冲液还包含山梨醇或其他化合物。本发明的药物组合物的实例可以包括含有抗Orail抗体的药物组合物和含有抗Orail抗体和至少一种治疗剂的药物组合物。本发明的药物组合物以冻干产物或液体的形式作为具有所选处方和所需纯度的药物来制备。含有抗Orail抗体的药物组合物或含有抗Orail抗体和至少一种用于异常骨代谢的治疗剂的药物组合物也可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖作为冻干产物来形成。[0201]本发明的药物组合物可以制备用于肠胃外施用或可以制备用于经口服途径在消化道中吸收。制剂的处方和浓度可以根据施用方法来决定。本发明的药物组合物中包含的抗Orai1抗体对于Orail的亲和力越高,即对Orai1的更低的解离常数Kd值),在人中可能显示效力的抗Orai1抗体的剂量越低。因此,本发明的药物组合物对于人的剂量也可以基于该结果来确定。施用人类型抗Orail抗体至人的剂量为约0.1-100mgkg,其可以每1-180天施用一次。[0202]本发明的药物组合物的实例可以包括包括静脉点滴的注射剂、栓剂、经鼻制剂、舌下制剂和经皮吸收制剂。[0203]尽管大部分批准的抗体制剂静脉内施用,但皮下施用经常在医疗实践中是更优选的。在这种情况下,体积限于1.0-1.5mL。因此,具有高浓度的抗体溶液根据剂量而需要。然而,由于更高浓度增加药物溶液的粘度,因此可能存在这样的情况,即药物溶液因为其高粘度而无法通过具有通常使用的粗细thickness的注射针来进行注射。简言之,在选择注射剂作为药物组合物的形式的情况下,低粘度是应该给予最高优先级的重要特性。因此,合适的抗体可以用粘度作为指标进行选择。实施例[0204]下文中,本发明将参考实施例来具体描述。然而,本发明不旨在受其所限。关于以下实施例中基因操作的每一程序根据〃MolecularCloning"Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T·,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的方法或使用可商购的试剂或试剂盒根据市售产品的说明手册来进行,除非另有说明。[0205][实施例1]制备大鼠抗人Orail抗体1-1免疫1-1-1构建人Orai1表达载体pcDNA3·1-hOrai1购买克隆于PD0NR221LifeTechnologiesCorp.中的UltimateORF克隆(克隆编号I0H40869,LifeTechnologiesCorp.并用作人Orail的基因序列。基因序列显示于序列表中的SEQIDNO:1中,并且氨基酸序列显示于序列表中的SEQIDNO:2中。此外,用GatewayVectorConversionSystemLifeTechnologiesCorp.将pcDNA3.1+修饰入目的载体中以制备pcDNA3.1-DEST。将基因序列与pcDNA3.1-DEST在att序列内使用GatewayLRClonaseEnzymemixLifeTechnologiesCorp.重组以制备人Orail表达载体pcDNA3.1_h0rail。在人Orail表达载体的大规模制备中使用EndoFreePlasmidGigaKitQiagenN.V.〇[0206]1-1-2大鼠免疫将雌性WKYIzm大鼠(JapanSLC,Inc.用于免疫。首先,将每只大鼠的两个后肢用透明质酸酶(Sigma-AldrichCorp.进行预处理,并随后,肌内注射pcDNA3.1-hOrail至这些部位。随后,使用ECM830BTX和两针电极在所述部位进行体内电穿孔。每两周一次重复类似的体内电穿孔之后,将大鼠的淋巴结收集并用于杂交瘤制备中。[0207]1-2杂交瘤制备使用HybrimuneHybridomaProductionSystemCytoPulseSciencesInc.将淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤SP20-agl4细胞电融合。将融合细胞用ClonaCell-HYSelectionMediumDStemCellTechnologiesInc.稀释并培养。出现的杂交瘤集落回收以制备单克隆杂交瘤。将回收的每一杂交瘤集落培养,并将所获的杂交瘤培养上清液用于筛选产生抗人Orail抗体的杂交瘤。[0208]1-3通过细胞-ELISA的一级筛选1-3-1制备用于细胞-ELISA的表达抗原基因的细胞将HEK293细胞以7.5XIO5细胞mL在含有10%FBS的DMEM培养基中制备。用pcDNA3·1-hOrai1或pcDNA3·I-DEST作为对照根据转染程序使用Lipofectamine2000进行转染,以50μΐ孔分配至96孔板CorningInc.,并在37°C下在5%CO2条件下在含有10%FBS的DMEM培养基中培养两夜。将所获的转染细胞以贴壁状态用于细胞-ELISA中。[0209]1-3-2细胞-ELISA从实施例1-1-1中制备的转染有表达载体的HEK293细胞中去除培养上清液后,将每一杂交瘤培养上清液添加至pcDNA3.1-hOrai1或pcDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞中,并将板在4°C下孵育1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的I3BS洗涤一次。随后,用含有5%FBS的PBS稀释500倍的兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体Sigma-AldrichCorp.加入其中,并将板在4°C下孵育1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤6次。随后,将OPD发色溶液在0.05M柠檬酸三钠和0.1M磷酸氢二钠十二水合物中分别以0.4mgmL和0.6%vv的浓度溶解的OPD溶液邻苯二胺二盐酸盐WakoPureChemicalsIndustries,Ltd.和H2O2,pH4.5以25μ!7孔向其添加。用偶尔搅拌并通过以25μ!7孔添加IMHCl来终止来进行颜色反应。随后,在490nm处使用板读数器ENVISI0N;PerkinElmer,Inc.测量吸光度。为了选择产生特异性结合表达于细胞膜表面上的人Orail的抗体的杂交瘤,选择相比于对照pcDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞产生对于pcDNA3.1-hOrai1表达载体转染的HEK293细胞展示更高吸光度的培养上清液的杂交瘤作为抗人Orail抗体阳性杂交瘤。[0210]1-4通过流式细胞术的二级筛选1-4-1制备用于流式细胞术分析的表达抗原基因的细胞将HKE293细胞以5XIO4细胞cm2接种到225cm2烧瓶中并在37°C和5%CO2条件下在含有10%FBS的DMEM培养基中培养。第二天,将HEK293细胞用作为对照的pcDNA3.1-hOrail或pcDNA3.1-DEST使用Lipofectamine2000转染并在37°C和5%CO2条件下再培养两夜。第二天,将转染表达载体的HEK293细胞用TrypLEExpressLifeTechnologiesCorp.处理,用含有10%FBS的DMEM洗涤,并随后悬浮于含5%FBS的I3BS中。将所获的细胞悬液用于流式细胞术分析。[0211]1-4-2流式细胞术分析通过实施例1-3中的细胞-ELISA证实为阳性的每一杂交瘤产生的抗体的人Orail结合特异性进一步通过流式细胞术来验证。实施例1-4-1中制备的每一HEK293细胞悬液离心以去除上清液。随后,将pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞通过添加杂交瘤培养上清液来悬浮并在4°C下孵育1小时。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤一次,随后通过添加用含有5%FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgGFITC缀合物Sigma-AldrichCorp.悬浮,并置于4°C下静置1小时。将细胞用含5%FBS的I3BS洗涤3次并随后重悬于含5%FBS和2ygmL7-氨基放线菌素DMolecularProbes,Inc中,随后使用流式细胞仪FC500;BeckmanCoulterInc.进行检测。使用FlowjoTreeStarInc.分析数据。通过门控排除7-氨基放线菌素D阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图。产生展示出相比于对照PCDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞的荧光强度直方图在pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293细胞的直方图中更强荧光强度偏移的样品的杂交瘤获得作为产生抗人Orai1抗体的杂交瘤。结果是,获得225个展示显著偏移的杂交瘤。[0212]1-5抗体分型将抗体Rl18和Rl98其表明强烈结合人Orai1从由1-4中获得的杂交瘤产生的大鼠抗人Orail抗体中选择出来,并进行分型。它们的同种型使用大鼠单克隆分型测试试剂盒AbDSerotec来确定。结果是,大鼠抗人Orail单克隆抗体Rl18和R198的同种型均发现为IgG2a和κ链。[0213]1-6制备大鼠抗人Orail抗体将每一大鼠抗人Orail单克隆抗体从杂交瘤培养上清液中纯化。[0214]首先,将产生R118或R198的杂交瘤用ClonaCell-HYSelectionMediumE生长至足够量。随后,将培养基用补充有20%的UltraLowIgGFBSLifeTechnologiesCorp.的HybridomaSFMLifeTechnologiesCorp.替换,随后培养5天。收集该培养上清液并经0.45μπι滤器灭菌。[0215]通过蛋白G亲和层析在4_6°C在一步中从杂交瘤上清液中纯化抗体。通过蛋白G亲和层析纯化后的缓冲液置换步骤在4-6°C下进行。首先,将杂交瘤培养上清液应用至用PBS平衡的填充有蛋白GGEHealthcareBio-SciencesCorp.的柱。整个培养上清液进入柱后,将柱用2倍或更多倍柱体积的PBS洗涤。随后,通过用0.1M的甘氨酸盐酸盐水溶液pH2.7洗脱收集含抗体的级分。收集的级分通过添加IMTris-HClpH9.0在pH7.0-7.5制备,并随后使用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分子量截止:UF30K,SartoriusJapanK.K·,4_6°C用PBS进行缓冲液置换,同时浓缩至0.2mgmL或更高的抗体浓度。最后,将抗体溶液经Minisart-Plus滤器SartoriusJapanΚ·Κ·过滤并用作经纯化的样品。[0216][实施例2]体外评价大鼠抗人Orail抗体2-1通过流式细胞术评价大鼠抗人Orail抗体结合的能力为了评价Orai1结合特异性,将通过1-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的ΗΕΚ293Τ细胞悬液或pcDNA3.1-h0rail转染的ΗΕΚ293Τ细胞悬液离心以去除上清液。随后,通过添加在1-6中制备的大鼠抗人Orai1单克隆抗体Rl18或Rl98或大鼠IgG对照抗体BeckmanCoulterInc.悬浮HEK293细胞,并在4°C下孵育30分钟。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次,随后通过添加用含有5%FBS的PBS稀释320倍的抗大鼠IgGFITC缀合物悬浮,并置于4°C下孵育30分钟。将细胞用含5%FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5%FBS和IygmL碘化丙啶(LifeTechnologiesCorp.的PBS中,随后使用流式细胞仪FC500进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度MFI。1?118和R198不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,并且如图1中所示,各自以浓度依赖性方式仅结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞,表明这些抗体各自特异性结合人Orai1。另一方面,此类结合在大鼠IgG对照抗体中未观察到。[0217]2-2大鼠抗人Orail抗体的T细胞活化抑制作用人T细胞系Jurkat细胞以1.5XIO6细胞mL的浓度在含有10%FBS、100UmL青霉素和100ygmL链霉素(LifeTechnologiesCorp.的RPMI1640LifeTechnologiesCorp.制备,并以80μίν孔接种至96孔细胞培养板,并用以10μίν孔添加的大鼠抗人Orail单克隆抗体Rl18或R198或大鼠IgG对照抗体在37°C和5%CO2条件下预处理60分钟。随后,将100ngmLPMSigma-AldrichCorp·和IygmLA23187Sigma-AldrichCorp·以10yL孔终浓度:10ngmLPMA和100ngmLA23187添加并充分搅拌,随后在37°C和5%CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600g离心3分钟。上清液中包含的白细胞介素-2IL-2浓度通过ELISARDsystems,Inc.测量。图2显示获得的大鼠抗人Orail单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。R118和R198各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放。另一方面,此类抑制在大鼠IgG对照抗体中未观察到。[0218][实施例3]测定编码大鼠抗人Orail抗体的可变区的cDNA的核苷酸序列3-1cDNA合成产生各抗体R118或R198的杂交瘤的细胞裂解物(50mMTris-HClpH7.5、250mMLiCl、5mMEDTApH8、0.5%十二烷基硫酸锂LiDS、2.5mM二硫苏糖醇DTT与结合有寡dT25的磁珠(DynabeadsmRNADIRECTKit,InvitrogenCorp.混合,使得mRNA结合到磁珠上。随后,将磁珠用mRNA洗涤溶液A10mMTris-HClpH7.5、0.15MLiCKlmMEDTA、0.1%LiDS、0.1%TritonX-100和cDNA合成的溶液(50mMTris-HClpH8.3、75mMKC1、3mMMgCl2、5mMDTT、0.5mMdNTP、0.2%TritonΧ-100、1·2单位的RNA酶抑制剂LifeTechnologiesCorp.各洗涤一次,随后使用添加有12单位的SuperscriptIIIReverseTranscriptaseLifeTechnologiesCorp.的cDNA合成溶液进行cDNA合成。随后,将磁珠用3’加尾反应溶液(50mM磷酸钾、4mMMgCl2、0.5mMdGTP、0.2%TritonX-100、1.2单位的RNA酶抑制剂LifeTechnologiesCorp.洗涤,随后使用添加有48单位的重组末端转移酶F.Hoffmann-LaRoche,Ltd.的反应溶液进行3’加尾反应。[0219]3-2扩增和测序大鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因片段将磁珠用TE溶液(10mMTris-HClpH7.5、ImMEDTA、0.1%TritonX-100洗涤,并随后通过5’-RACEPCR扩增大鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。具体而言,将磁珠转移至PCR反应溶液(0.2μΜ引物、0.2mMdNTP、0.25单位的PrimeSTARHSDNAPolymeraseTakaraBioInc.并进行35个循环的反应,每一循环涉及94°C持续30秒-68°C持续90秒。所用的引物组如下:[0221]通过PCR反应扩增的片段进行测序以分析其核苷酸序列。将具有核苷酸序列5’_CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3’(rlgy-seqSEQIDN0:8的寡核苷酸用作重链的测序引物,并将具有核苷酸序列5’-TCCAGTTGCTAACTGTTCC-3’(rIgK-seqSEQIDN0:9的寡核苷酸用作轻链的测序引物。[0222]使用基因序列分析仪器(〃ABIPRISM3700DNAAnalyzer;AppliedBiosystems,Inc.〃或〃AppliedBiosystems3730x1Analyzer;AppliedBiosystems,Inc,进行测序分析。将具有AmpliTaqDNA聚合酶的DyeTerminatorCycleSequencingSystemLifeTechnologiesCorp·和GeneAmp9700AppliedBiosystems,Inc.用于测序反应中。[0223]编码Rl18和R198的重链和轻链可变区的测定的核苷酸序列分别显示于序列表的SEQIDNOs:10Rll8轻链)和I2Rll8重链)以及SEQIDNOs:14Rl98轻链)和I6R198重链)中。可变区的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNOs:11R118轻链和13R118重链)以及SEQIDNOs:15R198轻链)和17R198重链)中。SEQIDNO:10和11显示于图14中。SEQIDNO:12和13显示于图15中。SEQIDNO:14和15显示于图16中。SEQIDNO:16和17显示于图17中。[0224][实施例4]制备人嵌合抗人Orail抗体4-1构建嵌合和人源化轻链表达载体pCMA-LK将通过用限制酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3_T0P0LacZLifeTechnologiesCorp.获得的大约5.4kb的片段与包含编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的DNA片段(显示于序列表的SEQIDNO:18中)使用In-FusionAdvantagePCR克隆试剂盒ClontechLaboratories,Inc.连接以制备pcDNA3.3LK。[0225]将pcDNA3.3LK用作使用下文给出的引物组的PCR中的模板。将所获的大约3.8kb的片段磷酸化并随后自连接以构建具有信号序列、克隆位点和CMV启动子下游的人κ链恒定区编码序列的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK。[0226]引物组[0227]4-2构建嵌合和人源化IgGl型重链表达载体pCMA-Gl使用In-FusionAdvantagePCR克隆试剂盒将通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列获得的DNA片段与包含编码人重链信号序列和人IgGl恒定区的氨基酸的序列的DNA片段(显示于序列表的SEQIDNO:21中)连接以构建具有信号序列、克隆位点和CMV启动子下游的人IgGl重链恒定区编码序列的嵌合和人源化抗体IgGl型重链表达载体pCMA-Gl。[0228]4-3构建人嵌合抗人Orail抗体轻链表达载体4-3-1构建人嵌合Rl18轻链cRl18_1^表达载体合成实施例3-2中获得的包含Rl18轻链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificialGeneSynthesisservice〇使用LigationHigh版本2ToyoboCo.,Ltd.将通过用限制酶XbaI和PmeI切割包含R118轻链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.7kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割用于嵌合和人源化抗体轻链表达的一般目的载体PCMA-LK获得的大约3.4kb的DNA片段以构建人嵌合Rl18轻链cR118_L表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA-LKcR118_L〃。编码人嵌合cR118轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNO:22和23图18中。[0229]4-3-2构建人嵌合R198轻链〇1?198_1^表达载体合成实施例3-2中获得的包含R198轻链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificialGeneSynthesisservice〇使用LigationHigh版本2ToyoboCo.,Ltd.将通过用限制酶XbaI和PmeI切割包含R198轻链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.7kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割用于嵌合和人源化抗体轻链表达的一般目的载体PCMA-LK获得的大约3.4kb的DNA片段以构建人嵌合R198轻链cR198_L表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA-LKcR198_L〃。编码人嵌合cR198轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNO:24和25图19中。[0230]4-4构建人嵌合抗人Orail抗体重链表达载体4-4-1构建人嵌合Rl18重链cRl18_!1表达载体合成实施例3-2中获得的包含Rl18重链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。使用LigationHigh版本2将通过用限制酶BlpI切割包含Rl18重链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.3kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1获得的大约4.5kb的DNA片段以构建人嵌合1?118重链(^118_!1表达载体。所获得的表达载体命名为"?01^-61CR118_H〃。编码人嵌合CR118重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNO:26和27图20中。[0231]4-4-2构建人嵌合R198重链cR198_H表达载体合成实施例3-2中获得的包含R198重链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。使用LigationHigh版本2将通过用限制酶BlpI切割包含R198重链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.3kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1获得的大约4.5kb的DNA片段以构建人嵌合R198重链(cR198_H表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-GlCR198_H〃。编码人嵌合cR198重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNO:28和29图21中。[0232]4-5制备人嵌合抗人Orail抗体4-5-1产生人嵌合抗人Orail抗体根据手册继代培养和培养FreeStyle293F细胞LifeTechnologiesCorp.。[0233]将处于对数生长期的IO7个FreeStyle293F细胞LifeTechnologiesCorp.接种到30mL瓶(ThermoFisherScientificInc.,用FreeStyle293表达培养基(LifeTechnologiesCorp.通过稀释以9mL制备,并随后在37°C下在8%C〇2培养箱中以135rpm摇动1小时。将30yg的聚乙烯亚胺(Polysciences#24765溶解在500yL的Opti-ProSFMLifeTechnologiesCorp.中。随后,将使用QIAGENPlasmidMaxiKitQiagenN.V.制备的每一人嵌合抗人Orail抗体重链表达载体4yg和每一人嵌合抗人Orail抗体轻链表达载体6yg悬浮在500yL的Opti-ProSFM中。将500yL的表达载体Opti-ProSFM混合的溶液加入500yL的聚乙烯亚胺Opti-ProSFM混合的溶液中,并将混合物轻柔搅拌,进一步放置5分钟,并随后加入到FreeStyle293F细胞中。将细胞以95rpm在37°C下在8%CO2培养箱中摇动培养5-7天,并将所获的培养上清液经0.22μπιMillexFilterMilliporeCorp.进行过滤。[0234]将通过组合?01^-61八1?118_!1和?01^-〇八1?118_1^获得的人嵌合1?118称为〃cR118〃。类似地,将通过组合pCMA-GlcR198_H和pCMA-LKcR198_H获得的人嵌合R198称为〃cR198〃。[0235]4-5-2纯化人嵌合抗人Orail抗体在4-5-1中获得的每一培养上清液通过rProteinA亲和层析在一步中纯化。首先,将10mL用PBS平衡的培养上清液应用到MabSelectSuReGEHealthcareBio-SciencesCorp.。在所有培养溶液进入柱后,将柱用7mL的I3BS洗涤。随后,用5mL的2M精氨酸-HC1,pH4.0进行洗脱,并将洗脱液用4mL的组氨酸缓冲液25mM组氨酸、5%山梨醇,pH6.0使用F1D-IO脱盐柱^GEHealthcareBio-SciencesCorp.进行缓冲液置换。最后,使用AmiconUltracel30K分子量截止值:30K,MilliporeCorp.将溶液浓缩至大约100yL并用作纯化样品。[0236][实施例5]人嵌合抗人Orail抗体的体外活性5-1通过流式细胞术的人嵌合抗人Orail抗体的抗原结合活性为了评价人Orai1结合特异性,将通过I-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后,通过添加在4-5中制备的人嵌合抗人Orail抗体cRl18或cR198或人IgG对照抗体JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.悬浮HEK293T细胞,并在4°C下孵育30分钟。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次,随后通过添加用含有5%FBS的PBS稀释100倍的抗人IgGFITC缀合物(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.悬浮,并置于4°C下解育30分钟。将细胞用含5%FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5%FBS和IygmL碘化丙啶InvitrogenCorp.的PBS中,随后使用流式细胞仪FC500进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度MFI。cRl18和cR198不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,并且如图3中所示,各自以浓度依赖性方式仅结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞,表明这些抗体各自特异性结合人Orai1。另一方面,此类结合在人IgG对照抗体中未观察到。[0237]5-2人嵌合抗人Orail抗体的人T细胞系活化抑制作用人T细胞系Jurkat细胞以1.5XIO6细胞mL的浓度在含有10%FBS、100UmL青霉素和100ygmL链霉素的RPMI1640中制备,并以80μ!7孔接种至96孔细胞培养板,并用以10μ!7孔添加的人嵌合抗人Orail抗体cR198或cR118、亲本抗体R198或R118或人IgG对照抗体在37°:和5%CO2条件下预处理60分钟。随后,将100ngmLPMA和IygmLΑ23187以10μ!7孔添加并充分搅拌,随后在37°C和5%CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图4显示制备的人嵌合抗人Orail抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。cR118和cR198各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放,且其抑制强度等于亲本抗体R198的抑制强度。另一方面,此类抑制在人IgG对照抗体中未观察到。[0238][实施例6]设计人嵌合抗人Orail抗体cR198的人源化形式hR1986-1R198的可变区的分子建模cR198的可变区的分子建模通过一般已知为同源性建模的方法来进行MethodsinEnzymology,203,121-153,(1991。上面测定的R198的可变区与蛋白数据库中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(衍生于X射线晶体结构的三维结构可获得)进行比较Nuc.AcidRes.28,235-2422000。结果是,选择1AJ7作为与cR198的轻链可变区具有最高序列同源性的那个。而且,选择IXGY作为与cR198的重链可变区具有最高序列同源性的那个。将框架区的三维结构制备为“框架模型”,这通过组合对应于cR198的轻链和重链的1AJ7和IXGY的坐标。将cR198的CDR对于0乩1、0乩2、0乩3、0冊1和0冊2分别指定为簇11八、74、9六、1^和1^,这根据111〇^^〇11等人的分类〇.]\1〇1.8丨〇1.,263,800-815,1996。其CDRH3根据H3规则分类为k6_FEBSletter,399,1-81996。随后,将每一CDR的典型构象并入框架模型中。[0239]最后,进行能量计算用于排除不利的原子间接触以在能量方面获得CR198可变区的可能的分子模型。使用可商购的蛋白三维结构预测程序Prime和构象搜索程序MacroModelSchrodinger,LLC进行这些程序。[0240]6-2设计人源化R198的氨基酸序列将人源化的R198抗体通过通常已知为CDR移植的方法来构建Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029-100331989。基于框架区中氨基酸的同源性选择受体抗体。[0241]将CR198框架区的序列与在抗体氨基酸序列的Kabat数据库(Nuc.AcidRes.,29,205-2062001中登记的所有人框架序列进行比较。结果是,选择lClO’CL抗体作为受体,这是由于其与框架区的71%序列同源性。将lClO’CL中框架区的氨基酸残基与cR198框架区的氨基酸残基进行比对以鉴定它们之间不匹配的氨基酸位置。这些残基的位置使用上面构建的cR198的三维模型来分析。随后,根据由Queen等人提供的标准选择供体残基嫁接至受体上Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029-100331989。[0242]因此选择的一些供体残基转移至受体抗体以构建如以下实施例中所述的人源化R198序列。[0243]此外,将CR198的各⑶R或FR中的1-5个氨基酸残基用CR118的氨基酸残基替换以构建如以下实施例中所述的CDR工程化的人源化R198序列。[0244]6-3设计人源化R198轻链hR198_L6-3-1hR198_Ll型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_Ll型轻链”:用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置64处的缬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。[0245]编码hR198_Ll型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDNO:30中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_Ll型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:31中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:30和31的序列两者也显示于图22中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0246]6-3-2hR198_L2型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L2型轻链”:用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。[0247]编码hR198_L2型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDNO:32中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L2型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:33中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:32和33的序列两者也显示于图23中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0248]6-3-3hR198_L3型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L3型轻链”:用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置64处的缬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用苯丙氨酸残基替换氨基酸位置114处的酪氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。[0249]编码hR198_L3型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDNO:34中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L3型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:35中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:34和35的序列两者也显示于图24中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0250]6-3-4hR198_L4型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L4型轻链”:用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用苯丙氨酸残基替换氨基酸位置114处的酪氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。[0251]编码hR198_L4型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDNO:36中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L4型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:37中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:36和37的序列两者也显示于图25中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0252]6-4设计人源化R198重链hR198_H6-4-1hR198_Hl型重链:将关于序列表中SEQIDNO:29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_Hl型重链”:用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。[0253]编码hR198_Hl型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDNO:38中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_Hl型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:39中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQIDNOs:38和39的序列两者也显示于图26中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0254]6-4-2hR198_H2型重链:将关于序列表中SEQIDNO:29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H2型重链”:用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。[0255]编码hR198_H2型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:40中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H2型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:41中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQIDNOs:40和41的序列两者也显示于图27中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0256]6-4-3hR198_H3型重链:将关于序列表中SEQIDNO:29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H3型重链”:用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置50处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置67处的异亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的缬氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置81处的谷氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置82处的赖氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。[0257]编码hR198_H3型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:42中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H3型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:43中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQIDNOs:42和43的序列两者也显示于图28中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0258]6-4-4hR198_H4型重链:将关于序列表中SEQIDNO:29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H4型重链”:用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置50处的丝氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置67处的异亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的缬氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置81处的谷氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置82处的赖氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。[0259]编码hR198_H4型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:44中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H4型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:45中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQIDNOs:44和45的序列两者也显示于图29中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0260][实施例7]制备人源化抗人Orail抗体7-1构建人源化抗人Orail抗体轻链111?198_1^表达载体7-1-1构建hR198_Ll表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:30代表的hR198_Ll的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_Ll可变区编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。将合成的DNA片段用限制酶Aval和EcoRV切割并插入用如上同样的限制酶切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体PCMA-LK的对应位点中以构建hR198_Ll表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA-LKhR198_LΓ。[0261]7-1-2构建hR198_L2表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:32代表的hR198_L2的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_L2可变区编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。将包含hR198_L2可变区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD-Plus-ToyoboCo.,Ltd.进行扩增,用限制酶BsiWI切割,并插入用限制酶BsiWI切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体PCMA-LK的对应位点中以构建hR198_L2表达载体。所获得的表达载体命名为"PCMA-LKL2"。[0262]7-1-3构建hR198_L3和hR198_L4表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:36代表的hR198_L4的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_L4可变区编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。通过实施例7-1-2中相同的方法构建hR198_L4表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LKhR198_L4"。[0263]使用QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKitStratageneCorp.用pCMA-GlhR198_L4作为模板引入用脯氨酸残基替换氨基酸位置64处的缬氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:34所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-GlhR198_L3〃。[0264]7-2构建人源化抗人Orai1抗体重链hR198_H表达载体7-2-1构建hR198_Hl和hR198_H2表达载体合成包含编码序列表的SEQIDNO:111代表的hR198_H0核苷酸序列中核苷酸位置36-425中显示的序列的hR198_H0可变区的DNA片段作为人源化抗Orail抗体重链hR198的候选GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。将包含hR198_H0可变区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD-Plus-扩增并使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒ClontechLaboratories,Inc.插入用限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgGl型重链表达载体PCMA-Gl的对应位点以构建hR198_H0表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-61Κ198_Η0〃ΑΚ198_Η0的氨基酸序列显示在SEQIDN0:112。[0265]随后,使用KOD-Plus-诱变试剂盒(ToyoboCo.,Ltd.用pCMA-GlR198_H0作为模板引入用酪氨酸残基替换氨基酸位置66处的色氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:40所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-GIhRl98_H2〃。[0266]随后,使用QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKitStratageneCorp.和下文给出的引物组用pCMA_GlR198_H2作为模板引入用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:38所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为〃pCMA-GlhR198_Hl〃。[0267]7-2-2构建hR198_H3和hR198_H4表达载体合成包含编码序列表的SEQIDNO:113代表的hR198_H5核苷酸序列中核苷酸位置36-425中显示的序列的hR198_H5可变区的DNA片段作为人源化抗Orail抗体重链hR198的候选GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。通过实施例7-2-1中相同的方法构建hR198_H5表达载体。所获得的表达载体命名为〃ρ0ΜΑ-6ΐΛΚ198_Η5〃ΑΚ198_Η5的氨基酸序列显示在SEQIDNO:114。[0268]随后,使用KOD-Plus-诱变试剂盒用pCMA-GlH5作为模板引入分别用酪氨酸残基和缬氨酸残基替换氨基酸位置66处的色氨酸残基和氨基酸位置67处的异亮氨酸残基的突变。将包含SEQIDNO:44所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为〃pCMA-GlhR198_H4"。[0269]随后,通过实施例7-2-1中相同的方法用?01^-611^198」14作为模板引入用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:44所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为〃pCMA-GlhR198_H3〃。[0270]7-3制备人源化抗人Orail抗体hR198通过如4-5-1中的相同方法用每一人源化抗人Orai1抗体重链表达载体和每一人源化抗人Orail抗体轻链表达载体转染Freestyle293F细胞以获得含有抗体的培养上清液。[0271]通过组合pCMA-GlhR198_Hl和pCMA-LKhR198_Ll、组合pCMA-GlhR198_H2和pCMA-LKhR198_L2、组合pCMA-GlhR198_H3和pCMA-LKhR198_L3和组合pCMA-GlhR198_H4和pCMA-LKhR198_L4获得人源化抗人Orail抗体分别命名为〃hR198_HlLl〃、〃hR198_H2L2'〃hR198_H3L3〃和〃hRlQSJMLf。[0272]通过rProteinA亲和层析通过如4-5-2中的相同方法纯化各自获得的培养上清液以获得纯化的抗体样品。[0273][实施例8]人源化抗人Orail抗体的体外活性8-1通过流式细胞术的人源化抗人Orai1抗体的抗原结合活性为了评价人Orail结合特异性,将通过1-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后,通过添加在7-5中制备的人源化抗0抑丨1抗体1^198_!1111、111?198_!1212、111?198_!1313或hR198_H4L4或亲本抗体cR118或cR198悬浮HEK293T细胞,并在4°C下孵育30分钟。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次,随后通过添加用含有5%FBS的PBS稀释100倍的抗人IgGFITC缀合物悬浮,并置于4°C下孵育30分钟。将细胞用含5%FBS的I3BS洗涤2次并随后重悬于含5%FBS和IygmL碘化丙啶的PBS中,随后使用流式细胞仪FC500进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度MFI。人源化的抗人Orail抗体hR198_HlLl、hR198_H2L2、hR198_H3L3和hR198_H4L4不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,并且如图5中所示,各自以浓度依赖性方式仅结合pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞,如同亲本抗体cR118或cR198,表明这些抗体各自特异性结合人Orai1。[0274]8-2人源化抗人Orail抗体的人T细胞系活化抑制作用人T细胞系Jurkat细胞以1.5XIO6细胞mL的浓度在含有10%FBS、100UmL青霉素和100ygmL链霉素的RPMI1640中制备,并以80μ!7孔接种至96孔细胞培养板,并用以10μ!7孔添加的人源化抗人Orail抗体11!1111、11!12凡2、11!13凡3或11!1414或人嵌合抗人0瓜;[1抗体cR118或cR198在37°C和5%CO2条件下预处理60分钟。随后,将100ngmLPMA和IygmLA23187以10μ!7孔添加并充分搅拌,随后在37°C和5%CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图6显示人源化抗人Orail抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。人源化抗人Orail抗体各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放,并且hHlLl和hH2L2的抑制活性等于人嵌合抗人Orail抗体cR118和cR198的抑制活性。另一方面,hH3L3和hH4L4展示出比cR118和cR198的更低的浓度下的抑制活性。[0275][实施例9]通过核糖体展示鉴定增强活性的突变9-1制备H链和L链文库用人源化抗人Orail抗体hR198_H4L4作为模板构建含有突变的H链或L链的文库并进行通过核糖体展示鉴定增强活性的突变。[0276]9-1-1制备H链文库用hR198_H4基因作为模板使用下文给出的引物组和rTaqDNA聚合酶ToyoboCo.,Ltd.进行80个循环的PCR以随机突变基因区。[0277]引物组[0278]随后,用随机突变的H链基因、包含T7启动子的5’UTR位点、包含5’添加的c-Myc和3’添加的SecM序列的TolA基因片段作为模板使用下文给出的引物组进行重叠PCR以制备H链文库。[0279]引物组[0280]9-1-2制备L链文库用hR198_L4基因作为模板使用下文给出的引物组和rTaqDNA聚合酶进行80个循环的PCR以随机突变基因区。[0281]弓丨物组[0282]以如9-1-1的描述中相同的方式,使用各随机突变的L链基因和上文描述的两个基因片段作为模板进行重叠PCR以制备L链文库。[0283]9-1-3制备H链基因片段通过PCR用hR198_H4基因作为模板使用下文给出的引物组和KOD-Plus-扩增H链基因区。[0284]引物组[0285]随后,用基因片段和包含T7启动子的5’UTR作为模板使用下文给出的引物组进行重叠PCR以制备H链基因片段。[0286]引物组[0287]9-1-4制备L链基因片段通过PCR用hR198_L4基因作为模板使用下文给出的引物组和KOD-Plus-扩增L链基因区。[0288]引物组[0289]随后,以如9-1-1中描述的相同方式,进行重叠PCR以制备L链基因片段。[0290]引物组[0291]9-1-5制备mRNA用实施例9-1-1至9-1-4制备的文库和基因片段作为模板使用T7RiboMaxExpressLargeScaleRNAProductionSystemPromegaCorp·合成各mRNA〇[0292]9-2通过核糖体展示筛选通过组合H链文库和L链基因片段制备H链核糖体展示Fab,并且通过组合L链文库和H链基因片段制备L链核糖体展示Fab。将20pmo1的H链或L链文库mRNA和100pmo1的核糖体添加至PUREfrex反应溶液GeneFrontierCorp.,并将混合物在30°C下孵育45分钟。类似地,将40pmo1的L链或H链mRNA和200pmo1的核糖体添加至PUREfrex反应溶液,并将混合物在30°C下孵育45分钟。随后,将H链或L链文库和L链或H链)的翻译后反应溶液混合并进一步在30°C下孵育90分钟以制备H链或L链核糖体展示Fab。随后,通过冷却至4°C终止反应。随后,将抗原添加至反应溶液,并将混合物在4°C下轻柔搅拌1小时使得每一Fab结合至抗原。所用抗原为通过使用1-1-1中制备的pcDNA3.1-hOrai1或下文显示的生物素-PEG化的人Orail环区肽Sigma-AldrichCorp.建立的组成型表达人Orail的CHO细胞的福尔马林固定样品。[0293]生物素-PEG化的人Orail环区肽[0294]使用NonolinkStreptavidin磁珠SoluLink,Inc.回收结合有抗原的核糖体展示Fab。随后,将抗原用50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、15mMMg0Ac2、0.05%Tween20和ImgmL酵母RNA和用50mMTris-HClpH7·4、150mMNaCl、15mMMg0Ac2和0.05%Tween20洗涤。随后,将50mMTris-HClpH7·4、150mMNaCl、15mMMgOAc2和50mMEDTA添加至抗原,并将混合物在室温下保持静置10分钟,随后通过离心回收含有mRNA的上清液。使用TranscriptorHighFidelitycDNASynthesisKitF.Hoffmann-LaRoche,Ltd.从回收的mRNA中形成cDNA,并随后通过PCR使用下文给出的引物组和KOD-Plus-扩增为DNA。用DNA作为模板合成mRNA并以如上相同方式进一步筛选。将筛选循环进行多次以选择强烈结合抗原的抗体的基因。[0295]引物组[0296]9-3制备Fab蛋白将所选的基因亚克隆至载体中用于在大肠杆菌中表达,并通过细胞ELISA筛选具有针对组成型表达人Orail的CHO细胞改善的结合活性的克隆。首先,用限制酶EcoRV和XhoI切割每一所选的DNA并插入用如上相同的酶切割的用于Fab表达的载体GeneFrontierCorp.,将所述载体随后转化入大肠杆菌BL21DE3中。将因此获得的转化子在37°C下在圆底96孔板的150yL羧苄青霉素0.1%葡萄糖2XYT孔中孵育4-5小时。随后,将板冷却至4°C,并随后,以终浓度0.5mM向其加入IPTG,随后在30°C下过夜摇动培养。随后,通过离心回收细菌细胞,并随后向其加入裂解缓冲液2.5mgmL溶菌酶,100UDNaseI,随后在室温下摇动60分钟。随后,通过离心回收上清液以制备Fab样品。[0297]9-4通过细胞ELISA筛选将表达人Orail的细胞在384孔板中培养直至成为汇合片(confluentsheet。随后,将板用洗涤缓冲液PBS㈠、20mMMgS〇4、2.5%FBS洗涤。随后,将Fab样品加入到板中,并将板在4°C下摇动1小时。用洗涤缓冲液洗涤四次后,向其加入过氧化物酶标记的抗人Fab’)2山羊抗体JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,并将板在4°C下摇动30分钟。用洗涤缓冲液将板洗涤三次,并随后用I3BS-和20mMMgSO4洗涤三次。随后,向其添加生色试剂0.4mgmL四甲基联苯胺、200mM乙酸钠pH3.4、0.01%过氧化氢水溶液),并将板在室温下摇动15分钟。随后,向其加入2NHCl,随后测量0D45Q。选择相比于对照CHO细胞针对组成型表达人Orail的CHO细胞展示出更高的0D45Q的Fab样品。[0298]9-5通过流式细胞术的抗人Orail抗体Fab的抗原结合活性为了评价人Orail结合特异性,将通过1-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后,通过添加在9-4中选择的轻链突变的克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151或PE057或者重链突变的克隆肊01?046、!^01?047、冊?087、冊?124或冊?237或者亲本抗体?313111?198_!1414-Fab悬浮HEK293T细胞,并在4°C下保持静置30分钟。将细胞用含有5%FBS的I3BS洗涤两次,随后通过添加用含有5%FBS的I3BS稀释100倍的抗人IgGFITC缀合物悬浮,并置于4°C下保持静置30分钟。将细胞用含5%FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5%FBS和IygmL碘化丙啶的PBS中,随后使用流式细胞仪FC500进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控去除碘化丙啶阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度MFI。轻链突变的克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151和PE057和重链突变的克隆HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124和HEP237不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,如同亲本抗体FabhRl98_H4L4-Fab,并且,如图7中所示,各自倾向于以与亲本抗体Fab的等同的或比其更强的水平结合pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞中的人Orail。[0299][实施例10]制备人源化抗人Orail抗体的亲和力成熟抗体通过转移实施例9中所选的轻链突变的克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151和PE057和重链突变的克隆!10«046、!^01?047、册13087、册?124和册?237中发现的增强活性的突变中的一些至hR198_H3L3来制备100种或更多种类型的工程化的hR198_H3L3抗体,并且从结合亲和力、体外活性、生产力和针对人的异质抗原性的观点来评估。结果是,选择下文显示的抗体。[0300]10-1设计人源化抗人Orail抗体的亲和力成熟抗体10-1-1hR198_LGl型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:35所示的hRl98_L3轻链通过以下设计的人源化Rl98轻链命名为“hR198_LGl型轻链”:用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基、和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基。[0301]编码hR198_LGl型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:55中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_LGl型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:56中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:55和56的序列两者也显示于图30中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0302]10-1-2hR198_LG2型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:35所示的hR198_L3轻链通过以下设计的人源化Rl98轻链命名为“hR198_LG2型轻链”:用组氨酸残基替换氨基酸位置44处的精氨酸残基、用天冬酰胺残基替换氨基酸位置48处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的丝氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置75处的谷氨酸残基、用色氨酸残基替换氨基酸位置76处的丝氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基。[0303]编码hR198_LG2型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:57中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_LG2型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:58中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:57和58的序列两者也显示于图31中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0304]10-1-3hR198_LG3型轻链:将关于序列表中SEQIDNO:35所示的hR198_L3轻链通过以下设计的人源化Rl98轻链命名为“hR198_LG3型轻链”:用组氨酸残基替换氨基酸位置44处的精氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置47处的谷氨酰胺残基、用天冬酰胺残基替换氨基酸位置48处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置73处的苏氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置75处的谷氨酸残基、用色氨酸残基替换氨基酸位置76处的丝氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基。[0305]编码hR198_LG3型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:59中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_LG3型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:60中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQIDNOs:59和60的序列两者也显示于图32中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0306]10-1-4hR198_HGl型重链:将关于序列表中SEQIDNO:43所示的hR198_H3重链通过以下设计的人源化Rl98重链命名为“hR198_HGl型轻链”:用天冬氨酸残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基。[0307]编码hR198_HGl型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:61中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_HGl型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:62中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-135代表可变区。SEQIDNOs:61和62的序列两者也显示于图33中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0308]10-1-5hR198_HG2型重链:将关于序列表中SEQIDNO:43所示的hR198_H3重链通过以下设计的人源化Rl98重链命名为“hR198_HG2型轻链”:用异亮氨酸残基替换氨基酸位置48处的缬氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置81处的丙氨酸残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基。[0309]编码hR198_HG2型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:63中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_HG2型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:64中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-135代表可变区。SEQIDNOs:63和64的序列两者也显示于图34中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0310]10-1-6hR198_HG3型重链:将关于序列表中SEQIDNO:43所示的hR198_H3重链通过以下设计的人源化Rl98重链命名为“hR198_HG3型轻链”:用异亮氨酸残基替换氨基酸位置48处的缬氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基、用甲硫氨酸残基替换氨基酸位置81处的丙氨酸残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基。[0311]编码hR198_HG3型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQIDN0:65中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_HG3型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDNO:66中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-135代表可变区。SEQIDNOs:65和66的序列两者也显示于图35中。每一⑶R序列及其对应的SEQIDNO显示于图38中。[0312]10-2制备人源化抗人Orail抗体的亲和力成熟抗体表达载体10-2-1构建hR198_LGl型轻链表达载体使用KOD-Plus-诱变用pCMA-LKhR198_L3作为模板引入用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:55所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为〃pCMA-LKhR198_LGl〃。[0313]10-2-2构建hR198_LG2和LG3型轻链表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:59代表的hR198_LG3的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_LG3可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。用限制酶EcoRV和Aval切割合成的DNA片段并插入到用如上同样的限制酶切割的pCMA-LKhR198_LGl中以构建hR198_LG3表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA-LKhR198_LG3〃。[0314]使用KOD-Plus-诱变用pCMA-LKhR198_LG3作为模板引入用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置47处的精氨酸残基和用苏氨酸残基替换氨基酸位置73处的丝氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:57所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-LKhR198_LG2〃。[0315]10-2-3构建hR198_HGl型重链表达载体使用KOD-Plus-诱变用pCMA-GlhR198_H3作为模板引入用天冬氨酸胺残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:61所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-GlhR198_HGl〃。[0316]10-2-4构建hR198_HG2型重链表达载体使用KOD-Plus-诱变用pCMA-GlhR198_HGl作为模板引入用异亮氨酸胺残基替换氨基酸位置48处的缬氨酸残基和用甘氨酸残基替换氨基酸位置81处的丙氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:63所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-GlhR198_HG2〃。[0317]10-2-5构建hR198_HG3型重链表达载体使用KOD-Plus-诱变用pCMA-GlhR198_HG2作为模板引入用甲硫氨酸残基替换氨基酸位置81处的甘氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQIDNO:65所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-GIhR198_HG3〃。[0318]10-3制备人源化抗人Orail抗体的亲和力成熟抗体通过如4-5-1中的相同方法用10-2中制备的每一人源化抗人Orail抗体重链表达载体和每一人源化抗人Orail抗体轻链表达载体转染FreeStyle293F细胞以获得含有抗体的培养上清液。[0319]将通过组合含有突变的作为模板的pCMA-GlhR198_H3或pCMA-GlhR198_HGl、pCMA-GlhR198_HG2或pCMA-GlhR198_HG3与pCMA-LKhR198_LGl、pCMA-LKhR198_LG2或pCMA-LKhR198_LG3获得的人源化抗人Orail抗体分别命名为〃hR198_H3LGl〃、〃hR198_HGlLGr、"hR198_HGlLG2"、"hR198_HGlLG3"、"hR198_HG2LGr和"hR198_HG3LGl"。[0320]通过rProteinA亲和层析通过如4-5-2中的相同方法纯化各自获得的培养上清液以获得纯化的抗体样品。[0321][实施例11]亲和力成熟抗体的体外活性11-1通过流式细胞术评价亲和力成熟抗体结合的能力为了评价人Orail结合特异性,将通过1-4-1中所示的方法制备的PCDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后,通过添加在1〇-3中制备的亲和力成熟抗体1^198_!131^1、111?198_邪11^1、111?198_邪1LG2、hR198_HGlLG3、hR198_HG2LGl或hR198_HG3LGl或亲本抗体hR198_H3L3或hR198_H4L4悬浮HEK293T细胞,并在4°C下孵育30分钟。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次,随后通过添加用含有5%FBS的I3BS稀释100倍的抗人IgGFITC缀合物悬浮,并置于4°C下孵育30分钟。将细胞用含5%FBS的I3BS洗涤2次并随后重悬于含5%FBS和IygmL碘化丙啶的PBS中,随后使用流式细胞仪FC500进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度MFI。亲和力成熟抗体hR198_H3LGl、hR198_HGlLGl、hR198_HGlLG2、hR198_HGlLG3、hR198_HG2LGl和hR198_HG3LGl不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,如同亲本抗体hR198_H3L3或hRl98_H4L4,并且,如图8中所示,各自倾向于以与亲本抗体的等同的或比其更强的水平结合pcDNA3.1-h0rail转染的HEK293T细胞中的人Orail。[0322]11-2亲和力成熟抗体的T细胞活化抑制作用人T细胞系Jurkat细胞以1.5XIO6细胞mL的浓度在含有10%FBS、100UmL青霉素和100ygmL链霉素的RPMI1640中制备,并以80μ!7孔接种至96孔细胞培养板,并用以10μ!7孔添加的亲和力成熟抗体hR198_H3LGl,hR198_HGlLGl,hR198_HGlLG2,hR198_HGlLG3,hR198_HG2LGl或hR198_HG3LGl或人源化抗人0抑丨1抗体111?198_!1313或111?198_!14L4在37°C和5%CO2条件下预处理60分钟。随后,将100ngmLPMA和IygmLA23187以10μL孔添加并充分搅拌,随后在37°C和5%CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图9显示亲和力成熟抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。亲和力成熟抗体各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放并且在抑制活性上均优于人源化抗人Orail抗体hH3L3和hH4L4其为亲本抗体)。[0323][实施例12]制备亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式如下文实施例中所述通过取代恒定区中的两个氨基酸残基构建来源于hR198_HGl的恒定区工程化的hRl98_HGI-LALA序列。[0324]12-1设计LALA型重链表达载体为了规避针对表达人Orail的正常细胞的细胞毒性,期望抗体应具有低效应子活性。效应子活性已知在抗体亚类中是不同的。观察到以下特征,例如,IgG4具有低ADCC和CDC活性,且IgG2具有⑶C活性,但具有低ADCC活性。在这些特征的基础上,可以通过参考IgG2或IgG4部分取代IgGl的恒定区序列来制备具有降低的ADCC和CDC活性的IgGl抗体。作为一个实例,MarjanHezareh等人,JournalofVirology,7524:12161-121682001显不IgGl的ADCC和CDC活性通过用丙氨酸残基置换IgGl的位置234和235位置通过Kabat等人的EU索弓丨来表示处的每一亮氨酸残基来降低。因此,将关于10-1中制备的hR198_HGl型重链通过用丙氨酸残基替代氨基酸位置253处的亮氨酸残基和用丙氨酸残基替代氨基酸位置254处的亮氨酸残基设计的人源化抗人Orai1抗体重链命名为“hRl98_HGI-LALA型重链”。[0325]12-2构建LALA型重链表达载体12-2-1构建hR198_HGl-LALA型重链表达载体使用KOD-Plus-诱变试剂盒用7-2中制备的hR198_H4型重链pCMA-GlhR198_H4作为模板引入突变,以构建hR198_H4-LALA型重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-Gl-LALAhR198_H4〃。编码hR198_H4-LALA型重链的核苷酸序列和所述重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNO:67和68图36中。[0326]通过用限制酶Ps11和XbaI消化10-2中制备的pCMA-GIhRl98_HG1获得包含抗体可变区编码序列的约0.6kb的DNA片段,并使用LigationHigh版本2将其插入到通过用如上同样的限制酶消化pCMA-Gl-LALAhR198_H4获得的约4.2kb的DNA片段中,以构建hR198_HGl-LALA型重链表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA-Gl-LALAhR198_HGl〃。编码hR198_HGl-LALA型重链的核苷酸序列和所述重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQIDNO:69和70图37中。[0327]12-3制备亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式12-3-1产生亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式根据手册继代培养和培养FreeStyle293F细胞LifeTechnologiesCorp.。将处于对数生长期的1.2XIO9个FreeStyle293F细胞(LifeTechnologiesCorp.接种到3LFernbachErlenmeyerFlaskCorningInc·,用FreeStyle293表达培养基(InvitrogenCorp.通过稀释以1.0XIO6细胞mL制备,并随后在37°C下在8%CO2培养箱中以90rpm摇动培养1小时。将3.6mg的聚乙稀亚胺Polysciences#24765溶解在20mL的Opti-ProSFMLifeTechnologiesCorp.中。随后,将使用PureLinkHiPurePlasmid试剂盒LifeTechnologiesCorp.制备的每一轻链表达载体0.8mg和每一重链表达载体0.4mg加入到20mL的Opti-ProSFMLifeTechnologiesCorp.中。将20mL的表达载体Opti-ProSFM混合的溶液加入20ml的聚乙烯亚胺Opti-ProSFM混合的溶液中,并将混合物轻柔搅拌,进一步放置5分钟,并随后加入到Freestyle293F细胞中。将细胞以90rpm在37°C下在8%C〇2培养箱中摇动培养7天,并将所获的培养上清液经DisposableCapsuleFilterADVANTEC#CCS-045_E1H进行过滤。通过组合pCMA-GlhR198_HGl和pCMA-LKhR198_LGl产生hR198_HGlLGl,并且通过组合pCMA-Gl-LALAhR198_HGl和pCMA-LKhR198_LGl产生hR198_HGl-LALALGl〇[0328]12-3-2亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式的两步纯化使用rProteinA亲和层析在4-6°C和陶瓷羟磷灰石在室温)以两步从实施例12-3-1中获得的培养上清液中纯化每一抗体。通过rProteinA亲和层析纯化后和通过陶瓷羟磷灰石纯化后的缓冲液置换步骤在4-6°C下进行。将培养上清液应用到用PBS平衡的MabSelectSuRe^GEHealthcareBio-SciencesCorp.,HiTrap柱)。整个培养上清液进入柱后,将柱用2倍或更多倍柱体积的PBS洗涤。随后,通过用2M的精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0洗脱收集含抗体的级分。将级分的缓冲液用PBS通过透析ThermoFisherScientificInc.,Slide-A-LyzerDialysisCassette置换并随后用5mM磷酸钠50mMMESpH7.0的缓冲液稀释5倍。将所得的抗体溶液应用至用5mMNaPi50mMMES30mMNaClpH7.0的缓冲液平衡的陶瓷轻磷灰石柱Bio-RadLaboratories,Inc.,Bio-ScaleCHTType-1HydroxyapatiteColumn。通过用氯化钠线性浓度梯度洗脱收集含抗体的级分。通过透析ThermoFisherScientificInc.,Slide-A-LyzerDialysisCassette用HBSor25mM组氨酸5%山梨糖醇,pH6.0置换级分的缓冲液。使用CentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分子量截止:UF10K,SartoriusJapanK.K·,4。〇将溶液浓缩至5mgmL或更高的IgG浓度。最后,将抗体溶液经Minisart-Plus滤器(SartoriusJapanΚ·Κ·过滤并用作经纯化的样品。[0329][实施例13]制备人抗人Orail抗体2C1.1和5Η3.1表达载体在TO2011063277A1中描述的轻链和重链的氨基酸序列的基础上制备2C1.1和5Η3.1抗体。[0330]13-1构建嵌合和人源化IgG2型重链表达载体pCMA-G2使用In-FusionAdvantagePCR克隆试剂盒将通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列获得的DNA片段与包含编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的氨基酸的序列的DNA片段(显示于序列表的SEQIDNO:71中)连接以构建具有信号序列、克隆位点和CMV启动子下游的人IgG2重链恒定区编码序列的嵌合和人源化抗体IgG2型重链表达载体pCMA-G2。[0331]13-2构建2C1.1抗体重链表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:72代表的2C1.1抗体重链编码核苷酸序列中核苷酸位置36-434中的2C1.1抗体重链可变区编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。将包含2C1.1抗体重链可变区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD-Plus-扩增并使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒插入用限制酶BIpI切割的嵌合和人源化抗体IgG2型重链表达载体pCMA-G2的对应位点以构建2C1.1抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为"PCMA-G22C1.1"。[0332]2C1.1抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:73中。[0333]13-3构建2C1.1抗体轻链表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:74代表的2C1.1抗体轻链编码核苷酸序列中核苷酸位置38-739中的2C1.1抗体轻链可变区和恒定区(λ链编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。将包含2C1.1抗体轻链可变区和恒定区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD-Plus-扩增并使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒插入用限制酶BsiWI和PmeI切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的对应位点以构建2C1.1抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-L2Cl.1"。[0334]2C1.1抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:75中。[0335]13-4构建5H3.1抗体重链表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:76代表的5H3.1抗体重链编码核苷酸序列中核苷酸位置36-434中的5H3.1抗体重链可变区编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。通过实施例13-2中相同的方法构建5H3.1抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为〃PCMA-G25H3.1〃。[0336]5H3.1抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:77中。[0337]13-5构建5H3.1抗体轻链表达载体合成包含显示于序列表的SEQIDNO:78代表的5H3.1抗体轻链编码核苷酸序列中核苷酸位置38-742中显示的5H3.1抗体轻链可变区和恒定区编码序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。通过实施例13-3中相同的方法构建5H3.1抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"PCMA-L5H3.Γ。[0338]5H3.1抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:79中。[0339]13-6制备2C1.1和5H3.1抗体13-6-1产生2C1.1和5H3.1抗体通过实施例12-3-1中相同的方法产生每一抗体。通过组合pCMA-G22Cl.GPpCMA-L2C1·1产生2C1·1抗体,和通过组合pCMA-G25H3·1和pCMA-L5H3·1产生5H3·1抗体。[0340]13-6-22C1.1和5H3.1抗体的两步纯化通过如实施例12-3-2的相同方法从实施例13-6-1中产生的培养上清液两步纯化每一抗体。[0341][实施例14]制备小鼠抗人Orail抗体10F8、14F74和17F6在W02013091903A1中描述的轻链和重链的氨基酸序列的基础上制备10F8、14F74和17F6抗体。[0342]14-1构建10F8抗体重链表达载体合成包含序列表的SEQIDNO:80代表的10F8抗体重链编码核苷酸序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。用合成的DNA片段作为模板使用KOD-Plus-扩增包含10F8抗体重链编码序列的DNA片段,并使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒插入到其中通过用限制酶XbaI和PmeI消化嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的位点,以构建10F8抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA10F8H〃。[0343]10F8抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:81中。[0344]14-2构建10F8抗体轻链表达载体合成包含序列表的SEQIDNO:82代表的10F8抗体轻链编码核苷酸序列的DNA片段GeneArtStringsDNAFragments。使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒将合成的DNA片段插入到其中通过用限制酶XbaI和PmeI消化嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的位点,以构建10F8抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA10F8L〃。[0345]10F8抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:83中。[0346]14-3构建14F74抗体重链表达载体合成包含序列表的SEQIDNO:84代表的14F74抗体重链编码核苷酸序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。通过实施例14-1中相同的方法构建14F74抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA14F74H〃。[0347]14F74抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:85中。[0348]14-4构建14F74抗体轻链表达载体合成包含序列表的SEQIDNO:86代表的14F74抗体轻链编码核苷酸序列的DNA片段GeneArtStringsDNAFragments。通过实施例14-2中相同的方法构建14F74抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"PCMA14F74L"。[0349]14F74抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:87中。[0350]14-5构建17F6抗体重链表达载体合成包含序列表的SEQIDNO:88代表的17F6抗体重链编码核苷酸序列的DNA片段GeneArtArtificialGeneSynthesisservice。通过实施例14-1中相同的方法构建17F6抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为〃pCMA17F6H〃。[0351]17F6抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:89中。[0352]14-6构建17F6抗体轻链表达载体合成包含序列表的SEQIDNO:90代表的17F6抗体轻链编码核苷酸序列的DNA片段GeneArtStringsDNAFragments。通过实施例14-2中相同的方法构建17F6抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"PCMA17F6L"。[0353]17F6抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQIDN0:91中。[0354]14-7制备10F8、14F74和17F6抗体14-7-1产生10F8、14F74和17F6抗体通过实施例12-3-1中相同的方法产生每一抗体。通过组合pCMA10F8H和pCMA10F8L产生10F8抗体。通过组合pCMA14F74H和pCMA14F74L产生14F74抗体。通过组合pCMA17F6H和PCMA17F6L产生17F6抗体。[0355]14-7-210F8、14F74和17F6抗体的两步纯化通过如实施例12-3-2的相同方法从实施例14-7-1中获得的培养上清液两步纯化每一抗体。[0356][实施例15]亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式与其他抗人Orail抗体的体外活性比较15-1通过流式细胞术的抗人Orail抗体的抗原结合活性将通过1-4-2中显示的方法用1-1-1中构建的每一人Orail表达载体转染的HEK293T细胞的细胞悬浮液离心以去除上清液。随后,通过添加12-3中制备的111?198_邪11^1或hRl98_HGILGI-LALA、13-6中制备的2C1·1或5H3·1、14-7中制备的10F8、14F74或17F6、或人IgG对照抗体或小鼠IgG对照抗体作为对照)悬浮pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞或pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,并且在4°C下孵育30分钟。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次,随后通过添加用含有5%FBS的PBS稀释100倍的抗人IgGFITC缀合物对于人抗体或抗小鼠IgGFITC缀合物CappelLaboratories,Inc.对于小鼠抗体悬浮,并在4°C下孵育30分钟。将细胞用含5%FBS的I3BS洗涤2次并随后重悬于含5%FBS和IygmL碘化丙啶的PBS中,随后使用流式细胞仪FC500进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后,将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度MFI。111?198_邢11^1、hR198_HGl-LALALGl、2C1·I、5H3·I、10F8、14F74和17F6不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞,并且,如图10人抗体和图11小鼠抗体)中所示,各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞,表明所有这些抗体特异性结合人Orai1。另一方面,此类结合在小鼠IgG对照抗体中未观察到。[0357]15-2抗人Orail抗体的人T细胞系活化抑制作用人T细胞系Jurkat细胞以1.5XIO6细胞mL的浓度在RPMI1640含有10%FBS、100UmL青霉素和100ygmL链霉素)中制备,并以80μ!7孔接种至96孔细胞培养板,并用以10μL孔添加的hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1·I、5Η3·I、10F8、14F74或17F6在37°C和5%CO2条件下预处理60分钟。随后,将100ngmLPMA和IygmLA23187以10μ!7孔终浓度:10ngmLPMA和100ngmLΑ23187添加并充分搅拌,随后在37°C和5%CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图12显示抗人Orail抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。图13显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1·I、5H3·1、10F8、14F74和17F6的半最大抑制浓度(IC5Q和80%抑制浓度(IC8q,且不存在抗体的情况下的IL-2浓度定义为100%。现有技术的抗体的IC5q为80ngmL或更高,而本发明的典型抗体的IC5Q为10ngmL或更低。现有技术的抗体的ICso为60000ngmL或更高,而本发明的典型抗体的IC8q为200ngmL或更低。[0358]15-3亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式和其他抗人Orail抗体的人外周血单核细胞活化抑制作用人外周血单核细胞PBMC作为冷冻产品购自CellularTechnologyLtd.并在根据说明书手册融化后使用。将在含有10%FBS、100UmL青霉素和100ygmL链霉素的RPMI1640中以2.0XIO6细胞mL的浓度制备的PBMC以80μ!7孔接种在96孔细胞培养板上,并用以10μ!7孔添加的各抗人Orail抗体在37°C下培养箱中预处理60分钟。随后,将100ngmLPMA和IygmLA23187以10μ!7孔添加并充分搅拌,随后在37°C和5%CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600g离心3分钟。上清液中含有的IL-2浓度和干扰素γIFN-γ浓度MabtechAB通过ELISA测量。图51显示抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PM和A23187处理的人PBMC的IL-2释放。图52显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6的半最大抑制浓度(IC5Q和80%抑制浓度(IC8Q,且不存在抗体的情况下的IL-2浓度定义为100%。现有技术的抗体的IC5q为100ngmL或更高,而本发明的典型抗体的IC5q为20ngmL或更低。现有技术的抗体的IC8q为17000ngmL或更高,而本发明的典型抗体的ICso为400ngmL或更低。图53显示抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IFN-γ释放。图54显示hR198_HGlLGl、hR198_HGl-LALALGl、2Cl.l、5H3.1、10F8、14F74和17F6的半最大抑制浓度(IC5Q和80%抑制浓度(IC8q,且不存在抗体的情况下的IFN-γ浓度定义为100%。现有技术的抗体的1:50为800ngmL或更高,而本发明的典型抗体的IC5Q为40ngmL或更低。现有技术的抗体的ICso为300000ngmL或更高,而本发明的典型抗体的IC8q为2000ngmL或更低。[0359][实施例16]hR198_HGlLGl的体内活性16-1施用hR198_HGlLGl对人PBMC移植的小鼠移植物抗宿主病模型的作用已知人移植物抗宿主病样反应可以通过移植人PBMC至NSG小鼠(NOD.Cg-PrAdCs^IMrg^HSzJ来诱导,所述NSG小鼠为严重的联合免疫缺陷小鼠(ClinicalandExperimentalImmunology,157:104-1182009〇贝勾自CharlesRiverLaboratoriesJapan,Inc的17只六周龄雄性NSG小鼠用2.0Gy的X射线照射(HitachiX-rayirradiationapparatusMBR-1520R-4。随后,将小鼠分入两只小鼠的一个组和各5只小鼠的3个组。用HBSor25mM组氨酸5%山梨醇,pH6.0以3mgmL和6mgmL制备的hR198_HG1LG1以10mLkg即30mgkg和60mgkg静脉内施用至2组η=5小鼠的尾部。仅HBSor施用至另一组(η=5作为媒介物组。第二天,使用CTL-抗聚集物(CellularTechnologyLtd.根据方案融解冷冻的人PBMCCellularTechnologyLtd·,并将3,000,000个细胞的人PBMC悬浮在200yL的PBS中并移植入3组η=5的小鼠中,同时人PBMC不移植至1组η=2,其作为X射线照射对照组随时间进行观察。X射线照射后0、7、14和21天,将hR198_HGlLGl或HBSor以如上相同剂量施用至施用组。在第0、1、4、7、9、10、11和13天和随后每天测量每只小鼠的体重。体重变化以百分比方式计算,且第0天的体重定义为100%。每组的平均体重的变化显示于图55中。媒介物施用组中平均体重的降低从约第16天开始被观察到。当媒介物施用组的平均体重降到80%以下时,在第21天终止实验。在该时间点,没有接受人PBMC的X射线照射的对照组没有展示出体重降低。以30mgkg和60mgkg给予hR198_HGlLGl的小鼠没有降低其体重,并且平均体重等于人I3BMC未移植小鼠的平均体重。预期在该系统中显著抑制由活化人PBMC引起的移植物抗宿主病的症状的hR198_HG1LGl抗Orail抗体对人移植物抗宿主病具有治疗和或预防作用。[0360]16-2使用人Orail敲入小鼠的hR198_HGlLGl体内活性评价16-2-1制备人Orail敲入小鼠其中小鼠Orai1的胞外环结构域的氨基酸序列用人Orai1序列替换的人Orai1敲入小鼠由InstituteofImmunologyCo.,Ltd.根据遗传工程化小鼠制备的标准方法来制备。简言之,通过用人Orail基因座替换包含小鼠Orail基因座的BAC克隆编码区的DNA序列构建人Orail基因敲入靶向载体,同时向其引入侧翼为IoxP序列的新霉素抗性基因。用该靶向载体转染小鼠ES细胞以建立G418抗性系。具有特异性重组的靶基因座的ES细胞系通过Southern杂交筛选。通过用Cre表达载体转染去除选择标记物,并将所得的ES细胞系用于制备嵌合Fl小鼠。通过Southern杂交进行基因分型以从Fl小鼠中选择杂合突变体个体。将所选的Fl杂合突变体个体交配以制备作为F2纯合突变体的人Orai1敲入小鼠。[0361]16-2-2hR198_HGlLGl的被动皮肤过敏PCA反应抑制作用根据标准方法进行小鼠PCA反应。将由InstituteofImmunologyCo.,Ltd.产生的八周龄人Orail敲入小鼠或野生型仔鼠保持在定位器中。随后,将用HBSor以6mgmL制备的hRl98_HGILG1以10mLkg即60mgkg静脉内施用至小鼠的尾部。将仅HBSor施用给媒介物组。第二天,将用生理盐水调节至10ygmL的10yL单克隆抗OVAIgEChondrex,Inc.皮内施用于异氟烧PfizerJapanInc.吸入麻醉下的每只小鼠的耳廓。24小时后,将含有2mgmLOVA来自鸡蛋清的白蛋白,Sigma-AldrichCorp.和20mgmL伊文思蓝MerckKGaA的生理盐水以5mgkgOVA和100mgkg伊文思蓝静脉内施用至尾部。30分钟后,通过在异氟烷深度麻醉下放血处死每只小鼠,并且切除其耳廓并浸在0.5mL的DMSO中,随后为提取伊文思蓝37°C,72小时)。含有提取的伊文思蓝的DMSO溶液以200μ!7孔转移至96孔微量板,并且使用微量板读数器MolecularDevicesCorp.,SpectraMaxM5e测量0.D·650nm。渗出的伊文思蓝的吸光度根据下文给出的计算方法测定,并且用定义为100%的媒介物施用组的平均值来表示。DMSO溶液的吸光度测定为空白。%=0D650样品-0D650空白)0D650媒介物-0D650空白)。图56显示hR198_HGlLGl抑制人Orail敲入小鼠中诱导的PCA反应。小鼠PCA反应是再现过敏反应的速发型过敏的基础模型系统,其为人中的I型变态反应,并且已知该系统可用于评价抗过敏药(Archivesinternationalesdepharmacodynamieetdetherapie,165:92-1021967;和Internationalarchivesofallergyandappliedimmunology,78:113-1171985ahRigSJIGlLGl抗Orail抗体)在该系统中确认具有针对IgE依赖性肥大细胞脱颗粒的抑制活性,预期具有针对在现存的肥大细胞脱颗粒抑制剂中发现的支气管哮喘、过敏性鼻咽和过敏性皮肤炎以及在人中的相似的I型变应性疾病例如变应性哮喘的治疗和或预防作用。[0362]16-2-3hR198_HGlLGl的迟发型超敏反应①TH反应抑制作用根据标准方法进行小鼠DTH反应。将由InstituteofImmunologyCo.,Ltd.产生的八周龄人Orail敲入小鼠或野生型仔鼠保持在定位器中。随后,将用HBSor以6mgmL制备的hRl98_HGILG1以10mLkg即60mgkg静脉内施用至小鼠的尾部。将仅HBSor施用给媒介物组。第二天,将通过等量混合用生理盐水稀释至5mgmL的mBSAAlbuminBovineMethylated,Sigma-AldrichCorp.和弗氏完全佐剂DifcoLaboratories制备的50yL的乳状液皮下施用至每只小鼠的两个腋窝的每一个用于免疫。6天后,将hR198_HGlLGl以60mgkg再次静脉内施用至尾部。第二天,在用异氟烧吸入麻醉下将用生理盐水以0.5mgmL制备的mBSA和生理盐水各自皮内施用至后肢。施用后6、24和48小时,使用刻度盘dialgauge测量腿上的肿胀。腿上肿胀厚度的时间依赖性变化用在0小时作为01T2mm的肿胀计算并且用定义为100%的媒介物施用组的平均值测定。图57显示hR198_HGlLGl在抗原施用后的6小时A、24小时B和48小时(C的各个时间点抑制人Orail敲入小鼠中诱导的DTH反应。小鼠DTH反应是用于观察T细胞依赖性免疫的建立和应答的系统,并且众所周知在该系统中展示活性的药物作为强免疫抑制剂进行开发(ClinicalandExperimentalImmunology,52:599-6061983ARigSJIGlLGI抗Orail抗体在该系统中证实具有针对T细胞免疫的抑制活性,预期针对人中由T细胞活性引起的机体应答或疾病例如移植物排斥、免疫疾病和炎性疾病具有治疗和或预防作用。[0363]16-2-4对抗Orail抗体针对皮炎的抑制活性的研究通过任何以下方法诱导皮炎:将0.5mL白蛋白抗原溶液腹膜内施用于小鼠,并且在2周后,将相同量的以上抗原向其注射作为加强剂。随后,将白蛋白抗原溶液以3天至2周间隔重复应用于耳20yL或背部(100yL3-6次。可选地,将螨抗原霜以3天至2周间隔重复应用于耳20yL或背部(100μ〇3-6次。根据方案制备半抗原苦基氯或二硝基氟苯并一周一次或两次应用于耳20μυ或背部(100μυ持续最大8周。可选地,将皮肤反应诱导物质组胺、化合物4080、5_和6_羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸荧光素或蛙皮素样肽施用至耳20μυ、背部(100μυ或脊髓5μυ。将抗Orail抗体在皮炎诱导前一天或在皮炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后,施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。皮炎诱导后,使用刻度盘式测厚仪测量耳廓厚度或皮炎的肉眼评分随时间进行。测试期完成后,进行血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标记物浓度的定量,获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的生长活性、细胞因子产生能力、表面抗原等的检查,组织病理学分析等以确定抗Orai1抗体针对皮炎的抑制活性。[0364]16-2-5对抗Orail抗体针对银肩病的抑制活性的研究在使用咪喹莫特的情况下,通过向耳廓的两侧或一侧5-30mg和剃毛的背部50-100mg应用来诱导银肩病性皮炎。可选地,通过腹膜内施用200yL的磷酸缓冲溶液中的10mgmL酵母聚糖悬浮液来诱导皮炎。在使用细胞因子(IL-23等)作为亲炎性物质prophlogisticsubstance的情况下,通过皮内施用20-50yL的含有0.1-2yg细胞因子的溶液至在用1-5%异氟烷深度麻醉下的小鼠耳廓的一侧诱导银肩病性皮炎。将抗Orail抗体在皮炎诱导前一天或在皮炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后,施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。皮炎诱导后,使用刻度盘式测厚仪测量耳廓厚度或皮炎的肉眼评分随时间进行。测试期完成后,进行炎症部位重量的检查、浸润入所述部位的中性粒细胞的髓过氧物酶活性、浸润细胞的流式细胞术分析、基因分析、细胞因子浓度测量等,以确定抗Orai1抗体针对银肩病的抑制活性。[0365]16-2-6对抗Orail抗体针对多发性硬化的抑制活性的研究将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白或其肽抗原用生理盐水调整至4mgmL并通过与用生理盐水调整至8mgmL的弗氏完全佐剂等量混合来乳化。将200yL的该混合溶液皮内施用至小鼠的侧腹或腹部。之后立即将100yL的2ygmL百日咳毒素水溶液从尾静脉施用至该小鼠。2天后,将上述百日咳毒素溶液进一步再次从尾静脉施用以诱导实验性脑脊髓炎。进入实验1周至2周后,发生脑脊髓炎,并且麻痹从尾部扩展至后肢和前肢。通过肉眼观察肢和尾部运动来对这种麻痹程度进行评分。将抗Orail抗体在脑脊髓炎诱导前一天或在脑脊髓炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后,施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定施用抗Orai1抗体对多发性硬化的作用。[0366]16-2-7对抗Orail抗体针对关节炎的抑制活性的研究将通过以1:1.3的体积比率混合2mgmL牛II型胶原和弗氏完全佐剂获得的100yL乳状液使用ImL注射器和结核菌素针tuberculinneedle皮内施用至小鼠的尾基部。2-3周后,进行如上相同处理。随后,肉眼观察或使用刻度盘式测厚仪评分肢中的关节肿胀。测试期完成后,测量血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度,获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓等的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原等。将抗Orail抗体在关节炎诱导前一天或在关节炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后,施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定施用抗Orail抗体对关节炎的作用。[0367]16-2-8对抗Orail抗体针对结肠炎的抑制活性的研究使用抗CD4抗体GKl.5、抗CD25抗体PC61.5和抗CD45R抗体C363.16A均来自eBioscience用细胞分选器分离从人Orail敲入小鼠的淋巴结和脾收集和纯化的淋巴细胞。通过该方法获得的细胞在流式细胞仪中证实为具有95%或更高纯度的CD4+CD25-⑶45RBhiT细胞。随后,将500,000个细胞腹膜内移植入12至16周龄的Rag2-_小鼠。随后,进行体重测量和观察症状诸如腹泻持续12周。观察期完成后,通过尸体解剖检查肠道增厚程度、息肉数目和大小以及病理体征存在与否。此外,定量血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度,分析获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的生长活性、细胞因子产生能力、表面抗原等。将抗Orail抗体在细胞移植前一天或在细胞移植前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后,施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定施用抗Orai1抗体对结肠炎的作用。[0368]16-2-9对抗Orail抗体对骨髓细胞移植系统的作用的研究从人Orail敲入小鼠切除股骨和胫骨,并且通过使用具有针头的注射器从骨骺注射1-5mL含有10%FBS的RPMI1640培养基将骨髓中的细胞推出。用细胞过滤器处理后,通过离心回收骨髓细胞并调节使得1〇,〇〇〇,〇〇〇个骨髓细胞包含在200yL的含有10mMHEPES、0.5mMEDTA和0.5%青霉素链霉素的注射缓冲液中。与此同时,根据标准方法从人Orai1敲入小鼠的脾中收集脾细胞。将作为受体的10至13周龄BALBc小鼠用2.0-8.0Gy的X射线照射。随后,将0-4,000,000个供体脾细胞加入至200yL的供体骨髓细胞中,并且将该细胞混合溶液注射至受体的尾静脉。随后,检查体重变化和存活率持续4-16周。测试完成后,测量受体小鼠的血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度和获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的表面抗原、生长活性、或细胞因子产生能力。将抗Orail抗体在骨髓移植前一天或在骨髓移植前1小时至4小时静脉内或皮下施用至受体小鼠。随后,施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定抗Orai1抗体对移植细胞的植入或移植物抗宿主病的发病率的作用。[0369][实施例17]比较亲和力成熟的抗体和其他抗人Orai1抗体之间的生理化学特性使用m-VROC的粘度测量将在10-3中制备的111?198_邪11^1或111?198_!131^1、在12-3中制备的111?198_邢1-1^1^1^1或13-6中制备的2:1.1用¥1¥厶?01^553^〇4118如口3111.1.浓缩至15〇11^mL或更高并随后用HBSor以90、120和150mgmL制备。使用m-VROCRheoSense,Inc.对于每一浓度测量三次25°C下的粘度以计算平均粘度(mPa·s。结果显示于图58和表1中。hR198_HGlLGl、hR198_H3LGl和hR198_HGl-LALALGl在所有浓度下的粘度低于2C1.1的粘度。具体而言,在15011^11^,111?198_邪11^1、111?198」131^1和111?198_邪1-1^1^1^1的粘度分别为11.4、10.0和10.81!^3«8,而2:1.1的粘度为21.011^«8,表明亲和力成熟的抗体相比于2C1.1即使在高浓度下仍然具有低粘度。[0370][^1][0371]产业实用性本发明的人源化抗Orail抗体比本领域已知的抗体具有更强的T细胞活性抑制作用,并且可以用作用于移植排斥等的治疗或预防剂。[0372]序列表的自由文本SEQIDNO:1:人Orail的基因序列SEQIDNO:2:人Orail的氨基酸序列SEQIDN0:3:PCI^|*Nhe-polyC-SSEQIDNO:4:PCR引物rigγ-ASlSEQIDNO:5:PCR引物rigy-AS2SEQIDN0:6:PCI^|*Nhe-polyC-SSEQIDN0:7:PCI^|*rIgK-ASSEQIDNO:8:测序引物rigγ-seqSEQID勵:9:测序引物『181〇-此1SEQIDNO:10:编码R118轻链的核苷酸序列SEQIDNO:11:R118轻链的氨基酸序列SEQIDNO:12:编码R118重链的核苷酸序列SEQIDNO:13:Rl18重链的氨基酸序列SEQIDNO:14:编码R198轻链的核苷酸序列SEQIDNO:15:R198轻链的氨基酸序列SEQIDNO:16:编码R198重链的核苷酸序列SEQIDNO:17:R198重链的氨基酸序列SEQIDNO:18:包含编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的DNA片段SEQIDNO:19:PCR引物3.3-F1SEQIDNO:20:PCR引物3.3-R1SEQIDN0:21:包含编码人重链信号序列和人IgGl恒定区的氨基酸的序列的DNA片段SEQIDNO:22:编码人嵌合cRl18轻链的核苷酸序列SEQIDNO:23:人嵌合cRl18轻链的氨基酸序列SEQIDNO:24:编码人嵌合cR198轻链的核苷酸序列SEQIDNO:25:人嵌合cR198轻链的氨基酸序列SEQIDNO:26:编码人嵌合cRl18重链的核苷酸序列SEQIDNO:27:人嵌合cRl18重链的氨基酸序列SEQIDNO:28:编码人嵌合cR198重链的核苷酸序列SEQIDNO:29:人嵌合cR198重链的氨基酸序列SEQID勵:30:编码111?198_1^1型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:31:hR198_Ll型轻链的氨基酸序列SEQID勵:32:编码1^198_1^型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:33:hR198_L2型轻链的氨基酸序列SEQID勵:34:编码111?198_1^3型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:35:hR198_L3型轻链的氨基酸序列SEQID勵:36:编码111?198_1^4型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:37:hR198_L4型轻链的氨基酸序列SEQID勵:38:编码1^198_!11型重链的核苷酸序列SEQIDN0:39:hR198_Hl型重链的氨基酸序列SEQID勵:40:编码1^198_!12型重链的核苷酸序列SEQIDN0:41:hR198_H2型重链的氨基酸序列SEQID勵:42:编码1^198_!13型重链的核苷酸序列SEQIDN0:43:hR198_H3型重链的氨基酸序列SEQID勵:44:编码1^198_!14型重链的核苷酸序列SEQIDN0:45:hR198_H4型重链的氨基酸序列SEQIDNO:46:PCR引物OrailHFSEQIDNO:47:PCR引物OrailCHFRSEQIDNO:48:PCR引物Ml3rev长SEQIDNO:49:PCR引物SecM终止RSEQIDNO:50:PCR引物OrailLcFSEQIDNO:51:PCR引物OrailCL-FRSEQIDNO:52:PCR引物OrailHR-FLAGRSEQIDNO:53:PCR引物OrailCL-FLAGRSEQIDNO:54:PCR引物Myc-RSEQID勵:55:编码1^198_1^1型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:56:hR198_LGl型轻链的氨基酸序列SEQID勵:57:编码1^198_1^2型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:58:hR198_LG2型轻链的氨基酸序列SEQID勵:59:编码1^198_1^3型轻链的核苷酸序列SEQIDN0:60:hR198_LG3型轻链的氨基酸序列SEQID勵:61:编码1^198_邪1型重链的核苷酸序列SEQIDN0:62:hR198_HGl型重链的氨基酸序列SEQID勵:63:编码1^198_邪2型重链的核苷酸序列SEQIDN0:64:hR198_HG2型重链的氨基酸序列SEQID勵:65:编码1^198_邪3型重链的核苷酸序列SEQIDN0:66:hR198_HG3型重链的氨基酸序列SEQID勵:67:编码1^198_!14-1^1^型重链的核苷酸序列SEQIDN0:68:hR198_H4-LALA型重链的氨基酸序列SEQID勵:69:编码1^198_邪1-1^1^型重链的核苷酸序列SEQIDN0:70:hR198_HGl-LALA型重链的氨基酸序列SEQIDN0:71:包含编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的氨基酸的序列的DNA片段SEQIDNO:72:编码2C1.1抗体重链的核苷酸序列SEQIDNO:73:2C1.1抗体重链的氨基酸序列SEQIDNO:74:编码2C1.1抗体轻链的核苷酸序列SEQIDNO:75:2C1.1抗体轻链的氨基酸序列SEQIDNO:76:编码5H3.1抗体重链的核苷酸序列SEQIDNO:77:5H3.1抗体重链的氨基酸序列SEQIDNO:78:编码5H3.1抗体轻链的核苷酸序列SEQIDNO:79:5H3.1抗体轻链的氨基酸序列SEQIDNO:80:编码10F8抗体重链的核苷酸序列SEQIDNO:81:10F8抗体重链的氨基酸序列SEQIDNO:82:编码10F8抗体轻链的核苷酸序列SEQIDN0:83:10F8抗体轻链的氨基酸序列SEQIDN0:84:编码14F74抗体重链的核苷酸序列SEQIDNO:85:14F74抗体重链的氨基酸序列SEQIDNO:86:编码14F74抗体轻链的核苷酸序列SEQIDNO:87:14F74抗体轻链的氨基酸序列SEQIDNO:88:编码17F6抗体重链的核苷酸序列SEQIDN0:89:17F6抗体重链的氨基酸序列SEQIDNO:90:编码17F6抗体轻链的核苷酸序列SEQIDNO:91:17F6抗体轻链的氨基酸序列SEQID勵:92:大鼠0虬1其来源于1?198并用于111?198_1^1至111?198_1^4型轻链)SEQID勵:93:工程化的0虬1其用于111?198_1^1型轻链)SEQID勵:94:工程化的0虬1其用于111?198_1^2型轻链)SEQID勵:95:工程化的0虬1其用于111?198_1^3型轻链)SEQID勵:96:大鼠0虬2其对于1?118和1?198是共有的并用于111?198_1^1至111?198_1^4和hR198_LGl型轻链)SEQID勵:97:工程化的0虬2其用于111?198_1^2型轻链)SEQID勵:98:工程化的0虬2其用于111?198_1^3型轻链)SEQIDN0:99:大鼠CDRL3其来源于R118并用于hR198_L3和hR198_L4型轻链)SEQID勵:100:大鼠〇虬3其来源于1?198并用于111?198_1^1和111?198_1^型轻链)SEQID勵:101:工程化的〇虬3其用于111?198_1^1至111?198_1^3型轻链)SEQIDN0:102:大鼠CDRHl其来源于R118并用于hR198_H3、hR198_H4和hR198_HGl至hR198_HG4型重链)SEQID勵:103:大鼠〇冊1其来源于1?198并用于111?198_!11和111?198_!12型重链)SEQID勵:104:大鼠〇冊2其来源于1?118并用于111?198_!13和111?198_!14型重链)SEQID勵:105:大鼠〇冊2其来源于1?198并用于111?198_!11和111?198_!12型重链)SEQID勵:106:工程化的〇冊2其用于111?198_邪1型重链)SEQID勵:107:工程化的〇冊2其用于111?198_邪2型重链)SEQID勵:108:工程化的0冊2其用于111?198_!0型重链)SEQID如:109:大鼠〇冊3其对于1?118和1?198是共有的并用于111?198_!11至111?198_!14型重链)SEQID勵:110:工程化的〇冊3其用于111?198_邪1至111?198_邪3型重链)SEQID勵:111:编码1^198_!10型重链的核苷酸序列SEQIDN0:112:hR198_H0型重链的氨基酸序列SEQID勵:113:编码1^198_!15型重链的核苷酸序列SEQIDN0:114:hR198_H5型重链的氨基酸序列SEQIDNO:115:生物素-PEG化的人Orail环区肽序列SEQIDNO:116:大鼠CDRLl其来源于R118,但不用于人源化的抗体)。

权利要求:1.抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合由SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区,其中所述CDRHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:104、106、107和108中任一种代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:109或110代表的氨基酸序列组成;和轻链序列包含具有⑶RL1XDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:93、94和95中任一种代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:96、97和98中任一种代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。2.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述重链序列包含具有CDRHl、CDRH2和⑶RH3的可变区,其中所述⑶RHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和所述轻链序列包含具有⑶RLlXDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和所述CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。3.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述重链序列包含具有CDRHl、CDRH2和⑶RH3的可变区,其中所述⑶RHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和所述轻链序列包含具有⑶RLlXDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:94代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:97代表的氨基酸序列组成,和所述CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。4.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述重链序列包含具有CDRHl、CDRH2和⑶RH3的可变区,其中所述⑶RHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:106代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和所述轻链序列包含具有⑶RLlXDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:95代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:98代表的氨基酸序列组成,和所述CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。5.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述重链序列包含具有CDRHl、CDRH2和⑶RH3的可变区,其中所述⑶RHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:107代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和所述轻链序列包含具有⑶RLlXDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和所述CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。6.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述重链序列包含具有CDRHl、CDRH2和⑶RH3的可变区,其中所述⑶RHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:108代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:110代表的氨基酸序列组成;和所述轻链序列包含具有⑶RLlXDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和所述CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。7.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述重链序列包含具有CDRHl、CDRH2和⑶RH3的可变区,其中所述⑶RHl由SEQIDNO:102代表的氨基酸序列组成,所述⑶RH2由SEQIDNO:104代表的氨基酸序列组成,和所述⑶RH3由SEQIDNO:109代表的氨基酸序列组成;和所述轻链序列包含具有⑶RLlXDRL2和⑶RL3的可变区,其中所述⑶RLl由SEQIDNO:93代表的氨基酸序列组成,所述⑶RL2由SEQIDNO:96代表的氨基酸序列组成,和所述CDRL3由SEQIDNO:101代表的氨基酸序列组成。8.权利要求1或2的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。9.权利要求8的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。10.权利要求8的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:70代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。11.权利要求1或3的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:58代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。12.权利要求11的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:58代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。13.权利要求1或4的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:60代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。14.权利要求13的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:60代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。15.权利要求1或5的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:64代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。16.权利要求15的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:64代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。17.权利要求1或6的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:66代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。18.权利要求17的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:66代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。19.权利要求1或7的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体包含由来自SEQIDNO:43代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。20.权利要求19的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成,所述重链序列由来自SEQIDNO:43代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQIDNO:56代表的氨基酸序列中的位置21-235的氨基酸残基组成。21.权利要求1-20中任一项的抗体的抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’)2、FabmFv。22.权利要求1-8、11、13、15、17和19中任一项的抗体,其中所述抗体是scFv。23.药物组合物,其包含权利要求1-22的至少任一种抗体或抗体的抗原结合片段。24.权利要求23的药物组合物,其中所述药物组合物是用于移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病或癌症的治疗和或预防剂、抗血小板或抗血栓活化剂或Orail表达细胞活化的抑制剂。25.权利要求24的药物组合物,其中所述移植排斥是针对移植器官或组织诸如心、肾、肝、骨髓、或皮肤的排斥反应和宿主抗移植物反应、和由移植造血细胞骨髓、外周血、脐带血等)引起的移植物抗宿主病。26.权利要求24的药物组合物,其中所述免疫相关疾病是结缔组织或肌肉骨骼疾病类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎等)、血液病再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等)、胃肠道疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、神经系统疾病多发性硬化、重症肌无力等)、眼疾病葡萄膜炎等)、血管疾病(白塞病、韦格纳肉芽肿等)、表皮疾病银肩病、天疱疮、白斑病等)、内分泌疾病(1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、桥本氏病等等,变应性性疾病是特应性皮炎、哮喘、过敏反应、类过敏反应、食物过敏、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫咬伤反应、对植物的反应、乳胶过敏、结膜炎、荨麻疹等,和炎性疾病是炎症性肾病(肾小球肾炎、肾病等)、炎性肺部疾病慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺炎等)、炎症性肠疾病溃疡性结肠炎、回肠炎等)、炎症性肝病(自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等)、炎性心脏病心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等)、炎症性皮肤疾病接触性皮炎、湿疹等)、炎症性眼病沙眼、眼内炎等)、炎症性中枢神经疾病脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎等)、炎症性关节疾病关节炎、骨关节炎等)、全身炎症败血症、出血、超敏反应、由癌症化疗等引起的休克症状等),等等。27.权利要求24的药物组合物,其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、皮肤癌、白血病等,和抗血小板或抗血栓活性可用于治疗和或预防的病例是心肌梗死、中风、缺血性心脏病、血栓形成等,和抑制Orail表达细胞活化可用于治疗和或预防的病例是肥大细胞白血病、肥大细胞增多症、嗜碱细胞性白血病、子宫内膜异位症、Stormorken综合征、管状聚集性肌病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、特应性皮炎等等。28.多核苷酸,其编码权利要求1-22中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。29.载体,其包含权利要求28的多核苷酸。30.转化的宿主细胞,其包含权利要求28的多核苷酸。31.转化的宿主细胞,其包含权利要求29的载体。32.用于产生权利要求1-22中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的方法,其包括培养权利要求30或32的宿主细胞和从培养产物纯化抗体的步骤。33.抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为80ngmL或更低。34.权利要求33的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为10ngmL或更低。35.抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的人外周血单核细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为100ngmL或更低。36.权利要求35的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人外周血单核细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为20ngmL或更低。37.抗体或抗体的抗原结合片段,其特异性结合SEQIDNO:2代表的氨基酸序列,其中从用PMA和A23187处理的人外周血单核细胞释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为800ngmL或更低。38.权利要求37的抗体或抗体的抗原结合片段,其中从用PMA和A23187处理的人外周血单核细胞释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为40ngmL或更低。

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