申请/专利权人：天津大学

申请日：2018-11-20

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN109432098B

主分类号：A61K31/4965(20060101)

分类号：A61K31/4965(20060101);A61P31/14(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.11.01#未缴年费专利权终止;2019.04.02#实质审查的生效;2019.03.08#公开

摘要：本发明公开了化合物PS‑341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用，所述化合物PS‑341为式I所示结构：所述小RNA病毒科肠道病毒属病毒为EVD68病毒、CVA16病毒。实验证明，化合物PS‑341抑制肠道病毒EVD68、CVA16复制的功能，为预防和治疗肠道病毒EVD68、CVA16提供有效方案。

主权项：1.化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用，所述化合物PS-341为式I所示结构： ；所述小RNA病毒科肠道病毒属病毒为EVD68病毒。

全文数据：化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用技术领域本发明涉及化合物PS-341的新用途，特别是涉及化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用。背景技术肠道病毒Enterovirus，小RNA病毒科，肠道病毒属为无包膜单股正链RNA病毒，是常见的人类病原体，可引起从轻微的发热到致死性脑膜炎和病毒性脑炎等一系列广泛的临床症状。VP1基因，作为四种衣壳蛋白之一的VP1蛋白的编码基因，广泛被用来区分不同血清型的肠道病毒。现在公认有四种肠道病毒：A、B、C、D。人肠道病毒D68型HumanEnterovirusD68，EVD68作为EVD组病毒五种血清型D70、D94、D111、D68、D120中的一种，最初于1962年在加利福尼亚州四名儿童呼吸系统疾病患者咽拭子中分离。与其他肠道病毒不同，EVD68与鼻病毒Rhinovirus有相似的生物学特性。2002年报道的Fermon的两个亚系VR-561、VR-1076是酸敏感性的。2004年的报道结果与2002年的报道结果相一致，并增加测试了其他五个临床分离株：MN89、MN98、MD02-1、TX01、TX02均为酸敏感型。Oberste发现EVD68在33℃比在37℃增殖得更快。酸敏感型和较低的最适生长温度与鼻病毒的生物学特征相同，这些共享的特征可能是它们都为呼吸道病毒的基础。自1962年首次发现后，该病毒的分离鉴定罕有报道。在1970-2005年间，只有26例临床分离株在美国被报道，占所有报道的EV家族病例的0.1％，流行病学数据极其有限。然而，近年来该病毒在全球多个地区频繁爆发。EVD68感染的临床并发症包括呼吸道感染、支气管炎及肺炎、手足口病、松弛性瘫痪和新生儿败血症等。有研究证明EVD68能够引起严重的呼吸系统疾病并加剧哮喘及肺炎的临床症状，诱发致死性神经系统感染，严重病例出现心肺功能衰竭，最终导致死亡。EVD68主要在病人的呼吸道分泌物中潜伏存活，病人在咳嗽、打喷嚏或接触物体表面时都会传播病毒。患病的主要年龄群集中在一岁到四岁的儿童，但有接近四分之一的感染者为成年人。因此推断，随着检测数据的增加，EVD68病毒最终可能被认定为全年龄组的呼吸系统病原体。尽管对其生物学特征的了解有所深入，但病毒的流行病学特征及致病机制仍然所知甚少。因此，当前迫切需要发展特异有效的预防及治疗药物和手段来遏制病毒的危害。化合物PS-341是一种20S蛋白酶体抑制剂，分子式为C19H25BN4O4，是美国千年制药公司MilIenniumPharmaceuticals开发的一种二肽硼酸衍生物。化合物PS-341作为一种蛋白酶体抑制剂使用，可以强烈而可逆地抑制蛋白酶体的功能，导致一些本应被清除的蛋白质在细胞内大量堆积，进而引起细胞凋亡。目前，化合物PS-341通过诱导细胞凋亡而发挥的抗肿瘤作用备受瞩目。然而，化合物PS-341能否抑制小RNA病毒科肠道病毒属病毒复制，目前尚未见报道。发明内容本发明的目的是提供一种化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用。本发明的技术方案是：化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用，所述化合物PS-341为式I所示结构：所述小RNA病毒科肠道病毒属病毒为EVD68病毒、CVA16病毒。本发明的有益效果是：实验证明，化合物PS-341抑制肠道病毒EVD68、CVA16复制的功能，为预防和治疗肠道病毒EVD68、CVA16提供有效方案。附图说明图1：MTT实验检测细胞存活率；图2：不同浓度PS-341对肠道病毒EVD68复制的影响；ARD细胞BHela细胞，PS-341药物在其终浓度为50nM、100nM、200nM时，对肠道病毒EVD68病毒的复制均有抑制作用，并且随着PS-341的工作浓度的升高，其抑制功能逐渐增强；图3：小分子PS-341药物处理时间补偿RD细胞，实验中分别按照1病毒与PS-341共孵育后感染细胞2病毒侵染细胞同时在培养液中加入PS-3413病毒吸附完成后加入PS-341处理细胞，药物终浓度均为100nM；结果表明，PS-341均能够显著抑制病毒EVD68的复制；图4：小分子PS-341对CVA16复制影响A柯萨奇A16型病毒感染RD细胞后，以药物终浓度分别为10nM、20nM、100nM处理细胞BPS-341以100nM处理细胞，检测24h、48h后细胞内病毒增值情况；结果表明，PS-341可以显著抑制CVA16在细胞内的复制。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。Hela细胞人宫颈癌细胞购于美国ATCCRD细胞横纹肌瘤细胞购于美国ATCC实施例1化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用，所述化合物PS-341为式I所示结构：所述小RNA病毒科肠道病毒属病毒为EVD68病毒、CVA16病毒。实施例2.PS-341对Hela细胞和RD细胞活力的影响。在96孔板中准备RD细胞和Hela细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，3000-10000个细胞孔。细胞生长密度适中，PS-341药物浓度梯度设置为0nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM，每组设置药物对照以及细胞对照，药物对照组为浓度为1％的DMSO，细胞对照组不做任何处理，每组为3个复孔。利用MTT细胞活力测定方法，检测各个处理组的细胞活性。病毒培养选择肠道病毒D68易感细胞横纹肌肉瘤细胞RD作为接种对象。将RD细胞接种于T75培养瓶中，细胞密度为80％-90％时，去细胞培养基，加入DMEM,取适量病毒原液，以MOIO.1侵染细胞4-6h后，弃掉DMEM,加入含2％FBS的细胞维持液，细胞继续培养48-72h。观察细胞80％-90％出现病变，用细胞刮板收集上清和细胞。反复冻融3次，离心后上清即为培养后的病毒液，直接用于实验。细胞的复苏液氮中冻存的细胞取出，迅速置于37℃恒温水浴锅中，缓慢摇晃至细胞冻存液融化，取出液体置于15ml离心管中，加入5ml新鲜培养基，800rpm，离心5min，弃掉上清，加入适量新鲜培养基反复吹匀，将细胞置于T25培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。细胞的冻存取长满细胞的T25培养瓶，弃掉培养液，用PBS漂洗一次，加入1ml胰酶，于37℃5％CO2培养箱中消化1min，加入5ml新鲜培养液来终止消化，轻轻反复吹匀细胞，将细胞转移至15ml离心管中，800rpm，离心5min，弃掉上清，加入预先配好的细胞冻存液90％FBS，10％DMSO，用移液管轻轻吹打混匀，分装入冻存管中，做好标记包括细胞代数，冻存日期，细胞种类，将冻存管放入冻存盒，置于-80℃冰箱保存，24h后转移至液氮中长期保存。细胞培养1RD细胞的培养RD细胞培养于含有10％FBS，1％青-链霉素的DMEM液体培养基，置于37℃，含5％C02的培养箱中孵育培养。约48h后，用含0.25％EDTA的胰酶消化，约3-5min后，加入10％FBS的新鲜培养基终止，室温离心800rpm，5min，弃上清，取适量新鲜培养基重悬后，三分之一置于培养瓶中继续培养，剩余传至96孔细胞培养板。2HeLa细胞的培养HeLa细胞培养于含有10％FBS，1％青-链霉素的DMEM液体培养基，置于37℃，含5％C02的培养箱中孵育培养。约48h后，用含0.25％EDTA的胰酶消化，约3-5min后，加入10％FBS的新鲜培养基终止，室温离心800rpm，5min，弃上清，取适量新鲜培养基重悬后，三分之一置于培养瓶中继续培养，剩余传至96孔细胞培养板。MTT实验检测细胞存活率细胞按照如上处理方式，处理24h后，按如下步骤进行检测。1.小心吸去上清，加入90μl新鲜培养液，再加入10μlMTT溶液，继续培养4h。2.然后弃掉上清，每孔加入110μlFormazan溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。3.同时设置调零孔培养基、MTT、Formazan溶解液，每组设定3复孔。4.MTT结果分析计算IC501、公式法:lgIC50＝Xm-IP-3-Pm-Pn4Xm:lg最大剂量I:lg最大剂量相临剂量P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率实施例3.不同浓度PS-341对肠道病毒EVD68复制的影响。本实验在RD细胞和Hela细胞中进行。细胞复苏具体实施步骤同实施例2.细胞培养1RD细胞的培养RD细胞培养于含有10％FBS，1％青-链霉素的DMEM液体培养基，置于37℃，含5％C02的培养箱中孵育培养。约48h后，用含0.25％EDTA的胰酶消化，约3-5min后，加入10％FBS的新鲜培养基终止，室温离心800rpm，5min，弃上清，取适量新鲜培养基重悬后，三分之一置于培养瓶中继续培养，剩余传至96孔细胞培养板。2HeLa细胞的培养HeLa细胞培养于含有10％FBS，1％青-链霉素的DMEM液体培养基，置于37℃，含5％C02的培养箱中孵育培养。约48h后，用含0.25％EDTA的胰酶消化，约3-5min后，加入10％FBS的新鲜培养基终止，室温离心800rpm，5min，弃上清，取适量新鲜培养基重悬后，三分之一置于培养瓶中继续培养，剩余传至96孔细胞培养板。细胞处理在24孔板中准备Hela细胞和RD细胞，用MOI＝0.1的EVD68病毒感染Hela细胞和RD细胞，病毒吸附完成后，用不同浓度的PS-341处理细胞，浓度为50nM、100nM、200nM，药物对照处理组为1％DMSO。细胞样品收集细胞加药处理24h后，弃掉细胞上清，用PBS缓冲液漂洗细胞两次，取500μlPBS将细胞收集到1.5ml离心管中，5000rpm离心5min，弃掉上清，置于-20℃备用。RNA提取细胞样品用作RNA提取，350μLRLT裂解液裂解细胞，上下吹打细胞沉淀直至沉淀消失；加入等体积的70％乙醇溶液，吹打混匀，迅速转移到2ml吸附柱中，12000rpm离心15s，弃掉废液；向吸附柱中加入700μlRW1buffer，12000rpm离心15s，弃掉废液；加入500μlRPEbuffer已加入四倍体积44ml无水乙醇，12000rpm离心15s；再加入500μlRPEbuffer，12000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱放入干净的2ml收集管中14000rpm离心1min；将吸附柱放入1.5ml离心管中，用30μl无RNA酶水将吸附柱中的RNA洗脱下来，-80℃备用。RNA逆转录成cDNA利用cDNA第一条链合成试剂盒进行RNA反转录。反应体系为20μl。逆转录体系如下：TotalRNAmRNA50ng-5ng5-500ngAnchored-oligodT0.5ngml1μlRNAse-freeWater适量将模板、引物、RNAse-freeWater混合均匀，置于PCR仪中，65℃孵育5min。再将该体系放置在冰上两分钟。再按照如下体系配制反转录成分：2×TSRectionMix10μlTranScriptorRTRIEnzymeMix1μl将配好的20μl体系混匀，置于PCR仪中42℃孵育15min；85℃，5s灭活TranScriptorRTRI。反转录后的cDNA保存在-40℃备用。实时定量PCRReal-timePCR利用SYBERGreenI染料进行实时定量PCR检测细胞中肠道病毒EVD68结构蛋白VP1含量来间接监测病毒RNA的水平。反应体系为20μl，体系配制如下：所用引物序列VP1-F5GGCAGCCTATCAGGTGGAGAG32412-2432VP1-R5GAGTTTGTATGGCTTCTTCTGGTTC32536-2560GAPDH-F5CCCACTCCTCCACCTTTGAC3GAPDH-R5CATACCAGGAAATGAGCTTGA3实验结果：如图2所示，PS-341药物在其终浓度为50nM、100nM、200nM时，对肠道病毒EVD68病毒的复制均有抑制作用，并且随着PS-341的工作浓度的升高，其抑制功能逐渐增强。实施例4.PS-341药物处理时间补偿实验处理方式1100nMPS-341加入细胞培养基中，于37℃孵育2h后，病毒EVD68以MOI＝0.1侵染细胞；2细胞感染病毒EVD68MOI＝0.1的同时补加100nMPS-341处理细胞；3细胞感染病毒EVD68MOI＝0.11h后，用100nMPS-341处理细胞；4细胞感染病毒EVD68MOI＝0.1，用1％DMSO处理细胞。细胞样品收集分别在病毒吸附完成后12h、24h收集细胞样品。弃掉细胞上清，用PBS缓冲液漂洗细胞两次，取500μlPBS将细胞收集到1.5ml离心管中，5000rpm离心5min，弃掉上清，置于-20℃备用。RNA提取细胞样品用作RNA提取，350μLRLT裂解液裂解细胞，上下吹打细胞沉淀直至沉淀消失；加入等体积的70％乙醇溶液，吹打混匀，迅速转移到2ml吸附柱中，12000rpm离心15s，弃掉废液；向吸附柱中加入700μlRW1buffer，12000rpm离心15s，弃掉废液；加入500μlRPEbuffer已加入四倍体积44ml无水乙醇，12000rpm离心15s；再加入500μlRPEbuffer，12000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱放入干净的2ml收集管中14000rpm离心1min；将吸附柱放入1.5ml离心管中，用30μl无RNA酶水将吸附柱中的RNA洗脱下来，-80℃备用。RNA逆转录成cDNA利用cDNA第一条链合成试剂盒进行RNA反转录,反应体系为20μl。具体实施步骤参见实施例3。反转录后的cDNA保存在-40℃备用。实时定量PCRReal-timePCR利用SYBERGreenI染料进行实时定量PCR检测细胞中肠道病毒EVD68结构蛋白VP1含量来间接监测病毒RNA的相对含量。反应体系为20μl。具体实施步骤参见实施例3。实验结果：如图3所示，病毒与PS-341共孵育后感染细胞、病毒侵染细胞同时在培养液中加入PS-341、病毒吸附完成后加入PS-341，PS-341均能够显著抑制病毒EVD68的复制。实施例5.PS-341对CVA16在细胞内复制影响。处理方式A在细胞感染病毒CVA16MOI＝0.1后，加入终浓度为10nM、20nM、100nMPS-341对细胞进行处理；B在细胞感染病毒CVA16MOI＝0.1后，加入终浓度为100nMPS-341对细胞进行处理。细胞样品收集药物处理细胞24h、48h后收集细胞样品。弃掉细胞上清，用PBS缓冲液漂洗细胞两次，取500μlPBS将细胞收集到1.5ml离心管中，5000rpm离心5min，弃掉上清，置于-20℃备用。RNA提取细胞样品用作RNA提取，350μLRLT裂解液裂解细胞，上下吹打细胞沉淀直至沉淀消失；加入等体积的70％乙醇溶液，吹打混匀，迅速转移到2ml吸附柱中，12000rpm离心15s，弃掉废液；向吸附柱中加入700μlRW1buffer，12000rpm离心15s，弃掉废液；加入500μlRPEbuffer已加入四倍体积44ml无水乙醇，12000rpm离心15s；再加入500μlRPEbuffer，12000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱放入干净的2ml收集管中14000rpm离心1min；将吸附柱放入1.5ml离心管中，用30μl无RNA酶水将吸附柱中的RNA洗脱下来，-80℃备用。RNA逆转录成cDNA利用cDNA第一条链合成试剂盒进行RNA反转录,反应体系为20μl。具体实施步骤参见实施例3。反转录后的cDNA保存在-40℃备用。实时定量PCRReal-timePCR利用SYBERGreenI染料进行实时定量PCR检测细胞中肠道病毒CVA16的相对含量。反应体系为20μl。具体实施步骤参见实施例3。结果表明，如图4所示，以药物终浓度分别为10nM、20nM、100nM处理细胞和PS-341以100nM处理细胞，检测24h、48h后细胞内病毒增值情况，PS-341均可以显著抑制CVA16在细胞内的复制。以上所述仅为本发明的优选实施方式，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的若干改进或变形，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，也应视为在本发明的专利保护范围内。序列表天津大学化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用1114SIPOSequenceListing1.0121DNA人工合成1ggcagcctatcaggtggagag21225DNA人工合成2gagtttgtatggcttcttctggttc25320DNA人工合成3cccactcctccacctttgac20421DNA人工合成4cataccaggaaatgagcttga21

权利要求：1.化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用，所述化合物PS-341为式I所示结构：2.根据权利要求1所述化合物PS-341在制备小RNA病毒科肠道病毒属病毒抑制剂的应用，其特征在于，所述小RNA病毒科肠道病毒属病毒为EVD68病毒、CVA16病毒。

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