申请/专利权人：郑州大学

申请日：2017-02-23

公开（公告）日：2021-04-27

公开（公告）号：CN106967171B

主分类号：C07K16/28(20060101)

分类号：C07K16/28(20060101);C12N15/13(20060101);C12N15/70(20060101);C07K1/22(20060101);C07K1/18(20060101);C07K1/16(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.27#授权;2017.08.15#实质审查的生效;2017.07.21#公开

摘要：本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法专利申请。所述Fab片段包括重链Fd与轻链；表达制备Fab片段时，在重链Fd的N端增加信号肽PelB，C端连接蛋白酶TEV酶切位点和组氨酸融合标签；在轻链的N端增加信号肽OmpA，然后构建与带有双启动子的大肠杆菌表达载体pETDuet‑1载体进行连接，构建重组表达载体，并进一步表达制备Fab片段。本申请通过对Fab片段进行优化，结合对宿主细胞、表达载体、表达条件和纯化条件的改造及优化，能够较为快速的制备Fab片段，具有纯度高、成本低、效果稳定等技术优势，对于相关疾病的预防控制具有较好的应用价值。

主权项：1.一种全人源重组CD40L单抗Fab片段，其特征在于，其包括重链Fd与轻链，所述重链Fd的蛋白序列如SEQIDNO.1所示，所述轻链蛋白序列如SEQIDNO.2所示。

全文数据：一种全人源重组GD40L单抗Fab片段及其制备方法技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法专利申请。背景技术[0002]CD40为I型穿膜糖蛋白，分布于B细胞、单核细胞、树突状细胞、滤泡树突细胞、巨噬细胞、内皮细胞和胸腺上皮细胞等多种细胞表面，在造血干祖细胞表面也有较高表达。CD40L为II型穿膜糖蛋白，最初鉴定于活化的CD4+T细胞表面，在单核细胞、NK细胞、肥大细胞以及部分⑶8+T细胞表面也有不同水平表达。静止的CD4+T细胞不表达CD40L，在其活化后表达短暂上调。除此之外，体内还存在有天然可溶性CD40L，可能由基质金属蛋白酶裂解而产生，至于其在机体内的免疫学作用尚不清楚。[0003]T细胞是免疫系统发挥功能的重要组成部分。其激活不仅需要外来抗原直接刺激，而且还需要细胞间通过表面分子相互作用传递的共刺激信号。CD40CD40L途径是T细胞激活又一重要的共刺激途径，不只在正常生理状态下参与和维持许多重要的生理功能，多种病理过程也往往由于这一途径的失调或紊乱而发生。因此各国学者发展了多种针对⑶40CD40L共刺激信号传导通路的免疫干预策略。在小鼠自身免疫病模型（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症等）中，利用特异性抗CD40L单抗阻断CD40CD40L相互作用均收到良好的疗效。Buhlmann等发现JImmunol.2016Jul15;197⑵：620-9，在输注供者B细胞的同时以抗CD40L抗体阻断CD40信号，可诱导出同种异体特异性T细胞耐受，极大地减轻了宿主同种异体反应能力。当前，利用经典的细胞免疫学手段和或分子免疫学手段制备肿瘤疫苗，以突破肿瘤患者的免疫抑制状态，激活肿瘤特异性免疫反应，达到缓解甚至治疗恶性肿瘤的目标已成为肿瘤生物治疗的必然趋势。CD40CD40L相互作用在肿瘤特异的保护性T细胞免疫反应诱导中有着十分关键的地位。[0004]当前单克隆抗体药物或抗体偶联药物已成为制药行业中增长最快、获利最大的市场之一。随着临床治疗用单抗大量上市，未来临床治疗用单抗制造的需求也相当可观，抗体临床治疗成功的病例也屡见不鲜。CD40L单抗是利用人源化技术获得的人源抗CD40L的抗体。可特异性地与CD40L结合，阻断其与细胞表面CD40蛋白的相互作用。[0005]治疗性抗体是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，其在感染、心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤治疗中有巨大的潜力与应用前景。治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点，而抗体药物作用靶点的选择性、抗体药物的人源化、小型化和高效化也是今后研宄的重点。发明内容[0006]本发明目的在于提供一种全人源重组CD40L单抗Fab片段，通过在大肠杆菌表达系统中高效表达该抗体，可为相关疾病的防治奠定应用基础。[0007]本申请的技术方案详述如下。[0008]—种全人源重组CD40L单抗Fab片段，包括重链Fd与轻链；所述重链Fd的蛋白序列如SEQIDNO.1所示，所述轻链蛋白序列如SEQIDN0.2所示。[0009]所述全人源重组CD40L单抗Fab片段的制备方法，具体包括如下步骤：1根据重链Fd与轻链的蛋白序列，反转录为编码基因（分别如SEQIDN0.3、SEQID奶.4所示）；然后将编码基因进行优化，具体而言，在重链Fd的N端增加PelB信号肽的编码序列，在重链Fd的C端增加蛋白酶TEV酶切位点的编码序列和组氨酸融合标签的编码序列;在轻链的N端增加OmpA信号肽的编码序列；N端信号肽Pe1B的氨基酸序列为:KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，C端蛋白酶TEV酶切位点的序列为:ENLYFQS，C端组氨酸融合标签序列为:HHHHHH;轻链N端信号肽OmpA的氨基酸序列为:KKTAIAIAVALAGFATVAQA;2将步骤（1中优化后的编码基因序列与带有双启动子的大肠杆菌表达载体pETDuet-1载体进行连接，构建重组表达载体；所构建重组表达载体中包括:两个大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、和两个终止子。[0010]3将步骤3中所构建重组表达载体转化至大肠杆菌构建重组菌，培养至对数生长期时进行诱导表达；所述大肠杆菌具体例如为大肠杆菌BL21DE3Star或其表达菌株；所述诱导，具体例如采用终浓度为0•2mmolL的异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂；4对步骤3中诱导表达结束后菌液进行提取;具体例如:采用渗透压冲击法提取诱导表达后菌体的周质蛋白，对所得周质蛋白进行色谱柱纯化，即可得到全人源重组CD40L单抗Fab片段；所述渗透压冲击法的具体步骤为:先对步骤3中诱导表达结束后菌液中加入高渗溶液，再转移至无机盐低渗溶液中；所述高渗溶液，含有质量浓度为20%的蔗糖、50mmolL的Tris-HCl和2.5mmolLEDTA；所述无机盐低渗溶液为5mmolL的MgCl2水溶液；所述色谱柱纯化，依次包括:亲和柱层析、阳离子交换树脂层析、和分子筛介质层析；所述亲和柱层析的亲和层析介质为Ni-NTA;所述阳离子交换树脂层析的阳离子交换介质为SP-FF;所述分子筛介质层析的分子筛层析介质为Superdex200。[0011]已有研究认为，基于高度确定的结构完整性和功能多样性，治疗性抗体结合抗原就可以实现疗效，因而抗原结合片段Fab分子成为IgG抗体的生产和定向改造首选的分子形式。抗体Fab片段由重链Fd段和完整的轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，属于小分子抗体，穿透力强，半衰期短。Fab片段的重链Fd和完整轻链通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体。在B细胞的粗面内质网中，可变区立体折叠，链内二硫键形成，从而轻链和重链可变区的两个分子间相互作用，形成正确的立体构象。[0012]本申请中，通过对Fab片段分子结构进行优化，利用基因工程技术手段，将优化后的人源化抗CD40L抗体的Fab片段重链Fd与轻链基因连接到表达载体中，并进而在大肠杆菌中得到了重组表达，进一步通过蛋白纯化，得到了有活性的人源CD40L单抗的Fab可溶性表达产物。[0013]蛋白表达过程中，作为宿主菌，大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境，重链Fd和轻链的5,端连接有细菌蛋白的信号肽，在其引导作用下，所表达的蛋白可以分泌到周质腔中，信号肽被信号肽酶特异切割，信号肽切割后生成的N末端为正常的重链Fd和轻链，然后重链Fd和轻链在周质腔内完成折叠、并形成正确的链内和链间二硫键，最终成为有生物学活性的Fab片段。[0014]蛋白纯化过程中，利用渗透压冲击法提取经诱导表达的菌体周质蛋白时，只破坏大肠杆菌外膜而不损害内膜，可较好保证抗体片段重链Fd和轻链稳定的结合，同时避免其他无关蛋白的千扰;而通过渗透压冲击法提取周质蛋白后后蛋白悬液，可去除50%以上宿主菌蛋白和蛋白聚合物，利于后续的进一步纯化。[0015]本发明所制备的人源化单克隆抗体CD40L单抗的Fab片段的纯度较高，初步活性实验表明，所制备Fab片段能与抗原CD40L特异性结合，其抑制效果与全抗分子相比无明显的差异，这一结果表明，所制备的Fab片段保留了原CD40L抗体具备的抗体性质和特异性，而由于该Fab片段分子量较低，因而相较于全抗分子更容易到达靶部位。[0016]总体而言，IgG全抗体因其分子量大及其CH2区需要糖基化修饰，因而主要用哺乳动物细胞来表达;而本申请通过对Fab片段进行优化，结合对宿主细胞、表达载体、表达条件和纯化条件的改造及优化，能够较为快速的制备Fab片段，加上其制备技术较为成熟，所制备Fab片段纯度较高，能够高效制备，结合制备成本较低、效果较为稳定等技术优势，对于相关疾病的预防控制具有较好的应用价值，也为其他生物产品制备提供了借鉴和参考。附图说明[0017]图1为⑶40L单抗Fab片段结构示意图；图2为⑶40L单抗Fab片段重组表达载体pEIDuet-1-Fab的结构示意图；图3为分子筛层析纯化后FabSDS-PAGE电泳图，表明获得的抗体片段具有较高纯度；图4为ELISA测定纯化的⑶40L单抗Fab片段与抗原⑶40L特异性结合能力及抗体活性图，其中0D代表光吸度。具体实施方式[0018]下面结合实施例对本申请做进一步说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂及实验设备等情况简要介绍如下。[0019]生物材料：大肠杆菌BL21DE3Star，购自康为生物北京公司；空白载体pETDuet-1载体，购自addgen生物；相关基因由金维智生物北京公司合成提供；实验试剂：限制性内切酶Ncol、HindIII、Nde1和Xho1购自NEB北京）；蛋白Marker、琼脂糖等常用分子生物学试剂购自康为生物北京公司；辣根过氧化物酶horseradishperoxidase,HRP标记的抗轻链抗体羊抗兔IgG抗体购自博士德生物武汉公司。[0020]实施例1本申请所提供的全人源重组CD40L单抗Fab片段，包括重链Fd与轻链；所述重链Fd的蛋白序列如SEQIDN0.1所示，所述轻链蛋白序列如SEQIDN〇.2所示。[0021]正常情况下，Fab片段由重链Fd和轻链组成，，两者通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体如图1所示）。在B细胞的粗面内质网中，可变区立体折叠，链内二硫键形成，从而轻链和重链可变区两个分子间相互作用，形成正确的立体构象。[0022]为较好表达Fab片段，实际制备过程中，发明人对重链Fd与轻链的编码基因序列进行了优化，蛋白表达时，在重链Fd的N端增加了信号肽PelBPelB氨基酸序列：KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，在C端连接有蛋白酶TEV酶切位点（ENLYFQS和组氨酸融合标签HHHHHH;轻链的N端连接有信号肽0mpA0mpA氨基酸序列:KKTAIAIAVALAGFATVAQA。在大肠杆菌中，大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境。重链Fd和轻链5’端由于分别连接有细菌蛋白的前导肽，在其引导作用下诱导表达的蛋白可以分泌到周质腔，在信号肽被信号肽酶特异切割后，所生成的N末端为天然蛋白的Fd段和轻链在周质腔内完成折叠、并形成正确的链内和链间二硫键，最终成为有生物学活性的Fab片段。[0023]实施例2本申请中，全人源重组CD40L单抗Fab片段的制备方法，具体包括如下步骤：1根据重链Fd与轻链的蛋白序列，反转录为编码基因（分别如SEQIDN0.3、SEQIDNO.4；由于需要选用具有两个独立启动子的pETDuet-1作为表达载体进行双基因共表达，因而对编码基因进行了进一步优化，基因优化原则为：在轻链和重链Fd的N端各加上一个独立的来自革兰氏阴性菌周质引导肽序列，具体而言：轻链之前添加OmpA氨基酸序列:KKTAIAIAVALAGFATVAQA，根据大肠杆菌原核表达系统进行密码子优化之后通过固相亚磷酞胺三酷法合成轻链DNA全长，利用5’Nde1和3’Xho1插入于第一个启动子之后；在重链Fd段之前添加Pe1B氨基酸序列:KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，同时在C端设计组氨酸融合标签HHHHHH和蛋白酶TEV酶切位点ENLYFQS，以利于后续的检测以及纯化，根据大肠杆菌原核表达系统进行密码子优化之后通过固相亚磷酞胺三酷法合成重链FdDNA全长利用5’端Ncol和3’端HindIII酶切位点插入于第二个启动子之后；构建的CD40L单抗Fab抗体片段重组表达载体的结构示意图如图2所示。[0024]2将步骤（1中优化后的编码基因序列与带有双启动子的大肠杆菌表达载体pETDuet-1载体进行连接，构建重组表达载体具体操作参考《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著;黄培堂等译，不再赘述）；所构建重组表达载体中包括:两个大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、和两个终止子。[0025]3将步骤3中所构建重组表达载体转化至大肠杆菌构建重组菌，培养至对数生长期时进行诱导表达。[0026]需要解释的是，Fab分子在大肠杆菌细胞周质中表达时需考虑到两个主要因素，一是避免被宿主本身表达的蛋白酶降解，二是促进二硫键形成。因此，选择蛋白酶缺失或促二硫键形成的宿主有利于Fab的表达，尤其是可溶蛋白和分泌表达。在本实施例中，发明人以大肠杆菌BL21①E3Star作为蛋白表达宿主菌，其以T7RNA聚合酶为表达系统可高效表达外源基因。[0027]具体培养过程为：重组质粒转化BL21DE3Star后，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素（100mgmL的LB液体培养基中，37°C、250rmin振摇培养过夜；次日将种子液按1%体积比扩倍于LB液体培养基中，37°C、180rmin振摇培养，培养至光密度OD6〇q=0.6时，加入终浓度为〇.2mmolL的IPTG，16°C振摇培养过夜，最后5000rmin离心5min收菌。[0028]4对步骤3中诱导表达结束后菌液进行提取;具体操作过程为：培养细菌12000rpm离心后收集菌体，500mL的0•9%NaCl充分洗涤，12000rpm离心后收集菌体;在收集的菌体中加入含有5〇mmolLTris-HCI、2.5mmolLEDTA的20%质量浓度的蔗糖高渗溶液，4°C充分悬浮30min重新12000rpm离心收集菌体；把蔗糖处理过的细胞迅速转移到5mmolL的MgCI2低渗溶液中冰浴悬浮，12000rpm离心，最终获得周质蛋白。[0029]对所获得的周质蛋白再依次进行亲和柱层析、阳离子交换树脂层析、和分子筛介质层析纯化，具体步骤为：第一步，NTA亲和层析：A、色谱柱:XK2620,层析介质:Ni-NTAAgrose美国Qiagen;缓冲液A:50mmolLTris-HCIpH7_2，150mmolLNaCI，10%甘油（Glycerol;缓冲液B:50mmolLTris-HCIpH7_2，150mmolLNaCI，10%Glycerol，500mraolL咪哩Imidazole；B、样品处理:将所提取周质蛋白溶液进行〇.22wn滤膜过滤，然后直接上样，进行目标蛋白的分离和纯化;过程为：用缓冲液A预先平衡Ni-NTA柱，样品直接上样，上完样后以缓冲液A平衡柱子，将未结合到柱子的杂质冲洗干净，分别用含20臟〇11^、50111111〇1]^、100111111〇1几和250111111〇1凡浓度咪|1坐用缓冲液B稀释的溶液洗脱蛋白；收集目标蛋白峰，测蛋白浓度并计算回收率，SDS-PAGE分析蛋白纯度。[0030]第二步，阳离子交换树脂：A、色谱柱:HiTrapSPFF5mL美国GE公司）；缓冲液A:20mmolL的NaH2P04，pH7•2;缓冲液B:20mmolL的NaH2P04、lmolLNaCl，pH7•2;B、本步骤目的是对亲和柱层析洗脱的目标蛋白组分去除NaCI和咪唑（Imidazole，具体操作过程为：用缓冲液A预先平衡离子柱，上样后以缓冲液A平衡柱子；将未结合到柱子的物质冲洗干净，再用100%的缓冲液B在20CV内梯度洗脱目标蛋白；收集目标蛋白峰，测蛋白浓度并计算回收率;作SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12%，用考马斯亮蓝R250染色过夜，脱色后用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。[0031]第三步，分子筛层析：A、色谱柱：HiLoad166〇Superdex200prep美国GE公司）；缓冲液为50mmolLTris-HCIpH7.2，150mmolLNaCI，10%Glycerol;B、本步骤目的是将阳离子交换树脂洗脱的目标蛋白利用截留分子量为10KD的再生纤维素膜包超滤浓缩至4mL，具体操作过程为：用缓冲液预先平衡分子筛，上样后按lmLmin的流速洗脱；集目标蛋白峰，作SDS-PAGE电泳；最后，对纯化产物使用Millipore超滤系统，截留分子量为10KD的再生纤维素膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩。[0032]分子筛层析纯化后Fab通过SDS-PAGE电泳分析最终纯化的抗体片段纯度结果参见图3。图3所示为Fab蛋白经分子筛层析纯化后的SDS-PAGE电泳图，为在非还原条件下电泳所得结果，在46kDa处有单一电泳条带，表明获得的抗体片段具有较高纯度。[0033]实施例3利用ELISA法，对实施例2所制备的CD40L单抗抗原结合片段Fab进行了活性分析实验，相关实验过程简要介绍如下。[0034]将抗原CD40L5ugml包被在聚苯乙烯微量细胞培养板上，4°C冰箱放置16h;洗涤后加入200ul封闭液5%BSA，室温封闭2小时；用稀释液将纯化好的CD40L单抗Fab进行稀释800ngmL，400ngmL，200ngmL，100ngmL，50ngmL，25ngmL，12_5ngmL，6_25ngmL，3_125ngmL，l.5625ngmL，0.7813ngmL，每孔100uL，同时作稀释液对照，加辣根过氧化物酶标记的抗轻链抗体羊抗兔IgG1:5000稀释），室温孵育2小时，加200UL邻苯二胺溶液作为底物室温孵育30min显色，用酶联免疫检测仪记录492nm读数。[0035]检测结果显示，结果表明所制得的CD40L单抗Fab片段能与抗原CD40L特异性结合。说明该Fab片段保留了原CD40L单抗抗体具备的抗体性质和特异性。实验结果参见图4。图4为ELISA测定纯化的Fab抗体片段与抗原CD40L特异性结合能力及抗体活性的图。

权利要求：1.一种全人源重组⑶40L单抗Fab片段，其特征在于，其包括重链Fd与轻链，所述重链Fd的蛋白序列如SEQIDN0.1所示，所述轻链蛋白序列如SEqIDN0.2所示。2.权利要求1所述全人源重组CD40L单抗Fab片段的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1根据重链Fd与轻链的蛋白序列，反转录为编码基因，具体碱基序列如SEqidNO.3和SEQIDNO.4所示；将编码基因进行优化，具体而言，在重链Fd的N端增加PelB信号肽的编码序列，在重链Fd的C端增加蛋白酶TEV酶切位点的编码序列和组氨酸融合标签的编码序列;在轻链的娘爵增加OmpA信号肽的编码序列；2将步骤（1中优化后的编码基因序列与带有双启动子的大肠杆菌表达载体pETDuet-1载体进行连接，构建重组表达载体；3将步骤3中所构建重组表达载体转化至大肠杆菌构建重组菌，培养并进行诱导表达；4对步骤3中诱导表达结束后菌液进行提取。3.如权利要求2所述全人源重组⑶40L单抗Fab片段的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21DE3Star;所述诱导，采用终浓度为〇•2mm〇lL的异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂。4.如权利要求2所述全人源重组⑶40L单抗Fab片段的制备方法，其特征在于，步骤4中，提取操作为:先采用渗透压冲击法提取诱导表达后菌体的周质蛋白，再对所得周质蛋白进行色谱柱纯化，即可得到全人源重组CD40L单抗Fab片段。、5.如权利要求4所述全人源重组CD40L单抗Fab片段的制备方法，其特征在于，所述渗透压冲击法的具体步骤为:先对步骤3中诱导表达结束后菌液中加入高滲溶液，再转移至无机盐低渗溶液中；所述高渗溶液，含有质量浓度为20%的蔗糖、50mm〇lL的Tris-HCl和2.5mmolLEDTA；所述无机盐低渗溶液为5mmolL的MgCh水溶液。6.如权利要求4所述全人源重组⑶40L单抗Fab片段的制备方法，宜特征在于所述色谱柱纯化，依次包括:亲和柱层析、阳离子交换树脂层析;^分子筛介质层析；所述亲和柱层析的亲和层析介质为Ni-NTA;所述阳离子交换树脂层析的阳离子交换介质为SP-FF;所述分子筛介质层析的分子筛层析介质为Superdex200。

百度查询： 郑州大学 一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法

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