申请/专利权人：妙合圣华(上海)生物科技有限公司

申请日：2018-04-27

公开（公告）日：2021-04-27

公开（公告）号：CN108949793B

主分类号：C12N15/70(20060101)

分类号：C12N15/70(20060101);C12N15/65(20060101);C12N1/21(20060101);C12Q1/6897(20180101);C12Q1/02(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.27#授权;2019.01.01#实质审查的生效;2018.12.07#公开

摘要：本发明涉及一种表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用。该重组菌是含有Vibrionatriegens的recA启动子和报告基因的重组载体pVrecA_luxYZ的EscherichiacoliPro2017菌；所述报道基因使用Vibrionatriegens中的recA启动子。该重组菌暴露于具有遗传毒性的物质或具有DNA损伤能力的辐射后，诱导recA启动子引动，并使报道基因表达产生报道产物，报道产物的量与遗传毒性呈剂量效应关系，可被用于评价样品的遗传毒性和辐射的DNA损伤强度。该重组菌宿主为健康人的肠道微生物，同时该报道产物在缺氧条件下也会被遗传毒物诱导表达，因此可用于人体体内原位遗传毒性评价。

主权项：1.一种表征遗传毒性的重组菌，其特征在于，含有表征遗传毒性的重组载体的大肠杆菌EscherichiacoliPro2017；所述表征遗传毒性的重组载体包含Vibrionatriegens的recA基因启动子、报告基因，以及载体；所述报告基因为发光基因luxCDABE，含有发光基因luxCDABE和Vibrionatriegens的recA启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述recA的启动子基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5'末端第3002-3175位，所述发光基因luxCDABE的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5'末端第3192-8990位；含有表征遗传毒性的重组载体的大肠杆菌EscherichiacoliPro2017，已于2018年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.15451。

全文数据：一种表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明涉及一种重组菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种以人体肠道微生物为宿主的表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用。背景技术[0002]环境污染和食品安全问题目前对人类的身体健康和生态平衡构成了巨大威胁。要获得快速、灵敏、低成本技术用以检测污染的水，土壤和食品始终是技术人员面临的一个挑战，而能用于人体代谢物的致癌致畸评价甚至在人体肠道开展原位评价更是科学家和医疗工作者的美好愿望。全细胞生物传感器被认为是最有希望解决这个难题的检测技术。[0003]遗传毒性检测的生物传感器细胞是一类基因工程菌，其DNA包含启动子和报道基因两个关键片段。报道基因的表达受启动子调控，启动子只在造成DNA损伤的毒性物质存在下被诱导开始转录，使得其下游的报道基因开始转录、翻译并表达产生可被测量的产物。报道产物的浓度数量随启动子表达强度升高而升高因而信号增强。全细胞传感器作为环境检测有两大优势，即可反映综合毒性和生物有效性，这两个因素直接影响污染对人健康和生态安全。[0004]在对大肠杆菌DNA损伤修复研究中，研究者发现了在损伤因素诱导下发生的SOS修复系统（孟紫强，环境毒理学.第一版.2000，北京：中国环境科学出版社.）。SOS系统由recA和IexA两个基因调控。LexA蛋白质在SOS系统中阻遏lexA、recA，umuDC、uvrA、uvrB、uvrC等基因的表达，当细胞暴露于遗传毒物时，RecA蛋白质被活化为蛋白酶，与阻遏蛋白LexA结合，使后者裂解。一旦LexA蛋白被裂解，所有参与SOS反应的基因都将充分表达，使细胞的修复得以发生。SOS修复系统广泛存在于微生物中。基于SOS系统，研究者通过分子生物学手段，构建了多种被SOS系统的启动子诱导表达的全细胞生物传感器。目前成熟的检测遗传毒性的生物传感器方法有umuSOS显色实验法，SOSchromotest，Mutatox等，这些方法多已进行商业生产。其中umu方法和SOSchromotest方法有相应的ISO标准规范。umu显色实验通过SOS系统的umuCD操纵子启动IacZ基因，SOSchromotest通过SOS过程中的sulA基因启动IacZ基因，从而实现通过监测报道基因的报道产物来检测遗传毒物的目的。SOS系统给出的检测结果与传统的检测致突变的Ames实验结果相关性很高，在数百种受试物中，SOSchromotest与Ames实验给出82%的相似结果（Quillardet，P.andM.Hofnung，TheSOSchromotest:areview.MutatRes，1993.2973:ρ·235_79·。但umu与SOS方法的时间和成本上远优于Ames实验，已在大气、水体和土壤遗传毒性检测中广泛应用（潘峰，王万峰，时蕾，Umu测试法及其在环境科学中的应用.安徽农业科学，2007.358:p.2208-2210.〇[0005]虽然以发光基因为报道基因的遗传毒性检测的基因工程菌在文献中有所报道，而且已有部分专利例如清华大学.表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用.中国发明专利，〇价015385498,2012.02.22，截至目前，遗传毒性检测的重组菌的构建在两大方面存在问题，因此其创新主要可以从两个角度进行。一是对遗传毒物做出响应的基因片段。二是实现功能的宿主。[0006]一、受遗传毒性诱导的基因片段。[0007]遗传毒性检测的重组菌都利用SOS过程中的基因实现调控。由于不同的recA启动子对LexA阻遏蛋白的响应程度不一样，进而决定着对DNA损伤的响应速度和敏感程度不一样。目前的报道中，启动基因基本局限于大肠杆菌和不动杆菌，启动基因的创新可能大幅提高重组菌的性能。Vibrionatriegens是自然界已知的生长最快的细菌之一，其代时仅为9min。在高速生长的过程中，为了削减DNA复制中的错误，Vibrionatriegens进化出了非常高效的DNA损伤修复机制，（Booth，M.G.，W.H.Jeffrey，andR.V.Miller，RecAexpressioninresponsetosolarUVRinthemarinebacteriumVibrionatriegens.MicrobialEcology,2001.42⑷：p.531-539.因此以Vibrionatriegens的recA基因作为重组菌的启动基因可能大幅提尚遗传毒性检测的灵敏度和响应时间。[0008]二、实现功能的宿主。[0009]在这些公开报道中，宿主菌通常为大肠埃希氏菌的模式菌株如DH5a、JM109,不动杆菌baylyi，鼠伤寒沙门氏菌等。大肠杆菌的模式菌株大多在野生型基础上进行了遗传学改造，比如DH5a、JM109都为recA基因缺陷（recA_型，因此理论上其SOS修复系统已被破坏，因此以此为宿主构建的遗传毒性检测的重组菌的响应机制完全不清晰，响应结果也容易不稳定;不动杆菌baylyi宿主，与臭名昭著的致病菌鲍氏不动杆菌为近亲，因而在环境和人体健康领域的遗传毒性评价时，需要格外注意其安全性问题。鼠伤寒沙门氏菌也存在同样的隐患。如果以从健康人体肠道中分离得到的微生物定植菌甚至益生菌为宿主，可以在极大程度上避免上述问题并开启更多的应用可能。[0010]目前可见的报道中，存在一株在E.coliDH5a中表达的，利用Vibrionatriegens的recA基因的重组菌。（Jiang，B.,W.E.Huang,andG.H.Li,ConstructionofabioreporterbyheterogeneouslyexpressingaVibrionatriegensrecA::luxCDABEfusioninEscherichiacoli,andgenotoxicityassessmentsofpetrochemical-contaminatedgroundwaterinnorthernChina.EnvironmentalScience-ProcessesImpacts，2016.186:p.751_759，但是该报道中将Vibrionatriegens的recA启动子和报告基因luxCDABE进行重组的设计存在三个缺陷：一是VibrionatriegensrecA启动子VrecA的SD序列和报告基因luxCDABE中间有400bp的碱基插入;二是报告基因luxCDABE拥有两个启动子VrecA和plac;三是宿主菌是DH5a菌株，为recA缺陷型，不能表达完整的RecA蛋白实现对阻遏蛋白LexA的降解或结合，因此理论上它不具备对遗传毒性物质的响应。这几点缺陷可能解释了为什么在多个实验室中，完全无法重复该文献报道的结果。发明内容[0011]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种以人体肠道微生物为宿主的表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用。[0012]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：[0013]本发明第一方面：[0014]提供一种表征遗传毒性的重组载体，包含需钠弧菌Vibrionatriegens的recA基因启动子、报告基因，以及载体。[0015]recA基因启动子、报告基因与载体连接获得表征遗传毒性的重组载体。[0016]所述报告基因包括发光基因、荧光基因、显色基因等，也可以为荧光蛋白或酶等。[0017]所述报告基因的启动子为Vibrionatriegens的recA启动子。[0018]所述载体可选用商用载体，在本发明的一个实施方式中，所述载体选用商业载体PGEM-T0[0019]在本发明的一个实施方式中，所述报告基因选择发光基因。[0020]在本发明的一个实施方式中，所述发光基因选择luxCDABE。[0021]当所述发光基因选择IuxCDABE时，含有发光基因IuxCDABE和Vibrionatriegens的recA启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述recA的启动子基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5’末端第3002-3175位，所述发光基因IuxCDABE的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5’末端第3192-8990位。[0022]当所述报告基因选择IuxCDABE，所述载体选用商业载体pGEM-T时，表征遗传毒性的重组载体为重组表达载体pVrecA_luxYZ。[0023]本发明中，通过PCR反应获得Vibrionatriegens完整的recA基因的启动子。[0024]本发明中，以pSalAR_lux为模板，通过PCR反应获得完整的IuxCDABE基因。[0025]本发明第二方面：[0026]提供一种表征遗传毒性的重组菌，是含有表征遗传毒性的重组载体的菌株。[0027]所述表征遗传毒性的重组载体如本发明第一方面描述，包含需钠弧菌（Vibrionatriegens的recA基因启动子、报告基因，以及载体。[0028]在本发明的一个实施方式中，所述菌株为EscherichiacoliPro2017。[0029]因此，在本发明的一个实施方式中，表征遗传毒性的重组菌，是含有表征遗传毒性的重组载体的大肠杆菌EscherichiacoliPro2017。本发明以含有表征遗传毒性的重组载体的大肠杆菌EscherichiacoliPro2017命名为重组菌HesenGTox3〇[0030]EscherichiacoliPro2017由健康的亚洲女性肠道中分离得到。[0031]其中报道基因使用Vibrionatriegens的recA基因的启动子，其转录受IexA阻遏蛋白浓度调控，EscherichiacoliPro2017中recA启动子的激活使得报道基因表达。当表征遗传毒性的重组菌暴露在遗传毒性的物质或具有DNA损伤能力的辐射下时，启动SOS修复系统的同时启动报道基因，通过报道产物的量的增加表征遗传毒性物质的存在及强度。[0032]HesenGTox3，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，已于2018年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.15451〇[0033]本发明第三方面：[0034]提供表征遗传毒性的重组菌的构建方法：[0035]IrecA基因启动子、报告基因与载体连接获得表征遗传毒性的重组载体；[0036]2将步骤1中构建的表征遗传毒性的重组载体导入大肠杆菌EscherichiacoliPro2017中，获得表征遗传毒性的重组菌。[0037]构建步骤1中重组载体可以用本领域公知的各种方法。根据Vibrionatriegens染色体DNA序列，取recA基因启动子上下游序列设计引物PCR，扩增得到recA基因的启动子部分，同理设计引物扩增得到报告基因，通过引物在recA基因和报告基因中引入合适的同源序列，进行无缝连接，将recA基因启动子和报告基因以及载体连接起来。[0038]步骤2中，大肠杆菌EscherichiacoliPro2017,简称为Pro2017,分类命名为大肠埃希氏菌^Escherichiacoli，已于2018年03月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.15524。[0039]步骤1中构建的载体导入大肠杆菌EscherichiacoliPro2017中可通过本领域公知的各种方法，如热激法。[0040]本发明第四方面：[0041]提供表征遗传毒性的载体、表征遗传毒性的重组菌的应用：表征遗传毒性的载体、表征遗传毒性的重组菌可用来检测遗传毒性物质。[0042]表征遗传毒性的载体、表征遗传毒性的重组菌可用来检测是否存在具有DNA损伤能力的福射。[0043]本发明第五方面：[0044]提供一种检测遗传毒性物质的方法，是将表征遗传毒性的重组菌与待测溶液混合，培养所述重组菌，通过检测报道基因表达产物的量来判断待测溶液是否含有遗传毒性物质。[0045]在本发明的一个实施方式中，所述培养温度为37°C。[0046]在本发明的一个实施方式中，所述培养可以再缺氧条件下进行。[0047]为了公正评价本发明所构建重组菌的优点，本发明在同一个实验室中，重复了已公开文献中与本发明最为接近的两株重组发光菌对同样的遗传毒性标准物质MMC的对比实验。两株重组菌分别为利用Vibrionatriegens的recA启动子的DH5a_lux，（Jiang，B.，ff.E.Huang,andG.H-LijConstructionofabioreporterbyheterogeneouslyexpressingaVibrionatriegensrecA::luxCDABEfusioninEscherichiacoli,andgenotoxicityassessmentsofpetrochemical-contaminatedgroundwaterinnorthernChina.EnvironmentalScience-ProcessesImpacts,2016.186:p.751-759以及利用不动杆菌启动子的ADPl_recA例如清华大学.表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用.中国发明专利，0价015385498,2012.02.22，并对其指标进行比较：[0048][0049]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：[0050]本发明的表征遗传毒性的重组菌，是在EscherichiacoliPro2017菌中导入含有VibrionatriegensrecA启动子和发光基因的重组载体。该重组菌暴露于遗传毒性的物质或具有DNA损伤能力的辐射后，会产生生物发光，发光强度与遗传毒性呈剂量效应关系，可被用于评价样品的遗传毒性和辐射的DNA损伤强度。[0051]本发明的一个实施方式中，将用Vibrionatriegens的recA启动子和报告基因IuxCDABE进行重组，与文献报道的另一株Vibrionatriegens的遗传毒性biosensor相比，响应速度和响应倍数均有显著提高，更高效和稳定。且构建的菌株为健康人肠道分离得到的非致病菌EscherichiacoliPro2017,从人体中分离获得，并且可以在缺氧环境下工作，可用于人体体内原位遗传毒性评价，因此可更好的表征食品和环境样品对人的影响，具备在人体原位应用的广阔前景。附图说明[0052]图1为pVrecA_luxYZ载体的构建流程示意图。[0053]图2为pVrecA_luxYZ载体上构建的recA基因启动子、发光基因luxCDABE、氨苄霉素抗性基因不意图。[0054]图3为HesenGTox3对丝裂霉素C遗传毒性的剂量及时间效应曲线。[0055]图4-1为HesenGTox3对丝裂霉素C遗传毒性的剂量效应3h曲线。[0056]图4-2为HesenGTox3对丝裂霉素C遗传毒性的剂量效应3h曲线。[0057]图4-3为HesenGTox3对丝裂霉素C遗传毒性的剂量效应3h曲线。[0058]图5为暗箱中拍摄HesenGTox3暴露于UV300s和150nmolL丝裂霉素C后的发光响应照片。[0059]图6为HesenGTox3在厌氧条件下，葡萄糖碳源对遗传毒性检测的影响。[0000]图7为HesenGTox3在厌氧条件下，阿拉伯糖碳源对遗传毒性检测的影响。具体实施方式[0061]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。[0062]下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。[0063]实施例1[0064]HesenGTox3的构建[0065]1获得需钠弧菌Vibrionatriegens的recA基因启动子[0066]Vibrionatriegens购买于ATCC，保藏号为No·14048。[0067]Vibrionatriegens染色体DNA已全部测序，可由NCBIGenebank数据库获得。[0068]设计如下引物通过PCR反应获得Vibrionatriegens完整的recA基因的启动子：[0069]Pl:5’-CATGGCCGCGGGATTCGTGATAAGCTCTGCGGCA-3’[0070]P2:5’-CTCCAAGCCTTACTTTCTCCGATTTATTCATCTTTTTGGGCGAC-3’[0071]以Vibrionatriegens基因组为模板，PCR的反应条件如下：[0072][0073]PCR产物进行1%的琼脂糖电泳后，使用Qiagen公司的QIAquickgelextractionkit进行切胶纯化获得recA基因的启动子部分。[0074]2IuxCDABE基因的获得[0075]以pSalAR_lux为模板，该质粒已在非专利文献Huang，W.E.，H.Wang，H.Zheng,L.Huang,A.C.Singer,I.ThompsonandA.S.Whiteley2005·"ChromosomalIylocatedgenefusionsconstructedinAcinetobactersp.ADPlforthedetectionofsalicylate.’’EnvironmentalMicrobiology7⑶：1339-1348.中公开，本申请通过该文献作者获赠该生物材料。该生物材料目前保藏在本公司的实验室中。本申请申请人保证自申请日起二十年内向有需要的科研单位和相关人员提供该生物材料。[0076]以pSalAR_lux为模板，设计如下引物通过PCR反应获得完整的IuxCDABE基因：[0077]P3:5’-GAGAAAGTAAGGCTTGGAGGATACGTATGACTAAAAA-3，[0078]P4:5’-GCCGCACTAGTGATTTCAACTATCAAACGCTTCGGTTAAGCT-3’[0079]PCR的反应条件如下：[0080][0081]PCR产物进行1%的琼脂糖电泳后，使用Qiagen公司的QIAquickgelextractionkit进行切胶纯化。获得完整的luxCDABE基因。[0082]3pVrecA_luxYZ载体的构建：[0083]pVrecA_luxYZ载体的构建流程如图1所示，recA基因启动子，luxCDABE与pGEM-T载体连接，进行克隆。[0084]用GibsonAssemblyMaster试剂盒（来源于NewEnglandBiolab，将步骤1和2中经纯化的recA基因启动子和经纯化的luxCDABE与商业载体pGEM-T连接，获得重组表达载体pVrecA_luxYZ如图2所示），载体pVrecA_luxYZ转化入大肠杆菌JM109感受态细胞由Promega公司购得），在含有氨苄霉素，表面涂布IPTG和X-Gal的LB平板上进行蓝白筛选，得到重组菌。使用QiaquickPrepKitQiagen提取重组菌质粒。[0085]4EscherichiacoliPro2017的获得[0086]取Ig健康人的粪便，加IOml灭菌去离子水。高速振荡使粪便充分打散后，以IOOOrpm转速离心5min。取上清液涂LB平板。37度培养过夜后，在平板上随机挑选10个白色菌落，通过划线纯化。在含有Ampici11in的LB培养基中接种并在37度培养过夜，丢弃能在Ampicillin中生长的菌株。最终得到的菌株以63F1387R的16SrRNA通用引物PCR，测序进行菌种鉴定，确定为大肠杆菌E.coli。命名为EscherichiacoliPro2017。[0087]大肠杆菌EscherichiacoliPro2017,已于2018年03月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.15524。[0088]5HesenGTox3传感器的获得[0089]i.EscherichiacoliPro2017的培养[0090]从LB平板上挑取新活化的EscherichiacoliPro2017单菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37°C下振荡培养12小时，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:50的比例接种于50mLLB液体培养基中，37°C振荡培养2小时至0D600=0.5左右。[0091]ii.EscherichiacoliPro2017感受态细胞的制备CaChfe[0092]将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4°C下3000g离心10分钟。[0093]弃去上清，用预冷的0.05molL的CaCl2溶液IOmL轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4°C下3000g离心10分钟。弃去上清，加入4mL预冷含15%甘油的0.05molL的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200yL的小份，贮存于_70°C可保存半年。[0094]iii.pVrecA_luxYZ载体转化EscherichiacoliPro2017感受态细胞[0095]从-70°C冰箱中取200yL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入IyLpVrecA_luxYZ质粒，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。42°C水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。向管中加入ImLLB液体培养基不含氨苄西林），混匀后37°C振荡培养1小时。将上述菌液摇匀后取IOOyL涂布于含氨苄西林的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16-24小时。[0096]挑取单克隆，接种于5mLLB液体培养基含氨苄西林）中，37°C下振荡培养过夜，使用QiaquickPrepKitQiagen提取重组菌质粒，使用下面一对引物进行测序：[0097]P5:5’-GTAAAACGACGGCCAGTGAA-3’[0098]P6:5’-AGTCACGAATGTATGTCCTGCG-3’[0099]序列正确的就是构建的HeSenGT〇X3细胞传感器。[0100]重组菌HesenGTox3已于2018年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.15451。[0101]实施例2[0102]HesenGTox3对遗传毒性物质丝裂霉素C的响应[0103]1细胞培养与准备[0104]HesenGTox3单菌落接种至含有lOOygmL氨苄西林的LB培养基LBA，37°C培养过夜。4°C条件下，3000rpm，5min收集细胞，用I3BS将细胞洗涤3次，然后用M9培养基稀释10倍重悬获得细胞悬浮液，待用。[0105]2样品准备[0106]分别配制浓度为0，15011]\1，150011]\1，1500011]\1，15^]\1和150^]\1的丝裂霉素：11〇水溶液。[0107]3样品测试[0108]取200yL步骤1中稀释的细胞悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标版孔内。每孔分别加入不同浓度的2yL丝裂霉素C水溶液，清水作为阴性对照。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪（SpectraMaxM2读板机，MolecularDevicesCorporation。在37°C测量每个微孔的化学发光Lum，并读取该孔在600nm波长处的吸光度0D600。每隔15分钟进行一次测量，共测量10小时。测量期间96孔板在37°C下振荡培养。[0109]4数据处理[0110]按如下公式计算相对发光值:RLU=Lum0D600[0111]HesenGTox3对遗传毒性物质丝裂霉素C的响应如图3和图4所示，图3中各曲线上标注的数字表示MMC最终浓度，单位是μΜL，图3为在不同浓度丝裂霉素C诱导重组菌产生的化学发光随时间的变化曲线。图4为暴露三小时后丝裂霉素C对重组菌相对发光的剂量效应曲线和OD变化。在一定浓度范围内丝裂霉素C的剂量与细胞相对发光强度具有较好的剂量效应关系。[0112]实施例3[0113]HesenGTox3对UV遗传毒性的检测[0114]1细胞培养与准备[0115]HesenGTox3单菌落接种至含有lOOygmL氨苄西林的LB培养基LBA，37°C培养过夜。4°C条件下，3000rpm，5min收集细胞，用I3BS将细胞洗涤3次，然后用M9培养基稀释10倍重悬获得细胞悬浮液，待用。[0116]2样品准备[0117]取200yL步骤1中稀释的细胞悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内。然后将酶标板放入UVcrosslinkerUVP，CL-1000中，8W，300s〇[0118]3样品测试[0119]曝光300s后，在暗箱中拍摄UV诱导重组菌发光的强弱。[0120]HesenGTox3对UV的响应如图5所示。[0121]实施例4[0122]HeSenGT〇X3在厌氧条件下，不同碳源对遗传毒性检测的影响[0123]1细胞培养与准备[0124]HesenGTox3单菌落接种至含有100ygmL氨苄西林的M9含0.4%葡萄糖）培养基M9GA，37°C培养过夜。4°C条件下，3000rpm，5min收集细胞，用PBS将细胞洗涤3次，然后用M9GA培养基稀释10倍重悬获得细胞悬浮液，标记为M9GA待用。[0125]]^86]161'«3单菌落接种至含有10^81111^氨节西林的]\19含0.5%阿拉伯糖培养基M9AA，37°C培养过夜。4°C条件下，3000rpm，5min收集细胞，用PBS将细胞洗涤3次，然后用M9AA培养基稀释10倍重悬获得细胞悬浮液，标记为M9AA待用。[0126]2样品准备[0127]分别配制浓度为0，15011]\1，150011]\1，1500011]\1，15^]\1和150^]\1的11：水溶液。[0128]3样品准备[0129]取200yL步骤1中稀释的细胞悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标版孔内。每孔分别加入不同浓度的2yL丝裂霉素C水溶液，清水作为阴性对照，加入50mL矿物油作为密封剂。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪（SpectraMaxM2读板机，MolecularDevicesCorporation。在37°C测量每个微孔的化学发光Lum，并读取该孔在600nm波长处的吸光度0D600。每隔15min进行一次测量，测量16h。测量期间96孔板在37°C下振荡培养。[0130]4数据处理[0131]按如下公式计算相对发光值:RLU=Lum0D600[0132]厌氧，不同碳源条件下HesenGTox3对遗传毒性物质丝裂霉素C的响应如图6和图7所示，图6为在葡萄糖为碳源条件下不同浓度丝裂霉素C诱导重组菌产生的化学发光随着时间的变化。图7在阿拉伯糖为碳源条件下不同浓度丝裂霉素C诱导重组菌产生的化学发光随着时间的变化。在一定浓度范围内丝裂霉素C的剂量与细胞相对发光强度具有较好的剂量效应关系，且葡萄糖优于阿拉伯糖作为碳源。[0133]上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种表征遗传毒性的重组载体，其特征在于，包含^；1131'；[〇111：1^686118的代〇4基因启动子、报告基因，以及载体。2.根据权利要求1所述的一种表征遗传毒性的重组载体，其特征在于，所述报告基因包括发光基因、荧光基因、显色基因、荧光蛋白或酶。3.根据权利要求2所述的一种表征遗传毒性的重组载体，其特征在于，所述发光基因选择IuxCME04.根据权利要求3所述的一种表征遗传毒性的重组载体，其特征在于，含有发光基因IuxCDABE和Vibrionatriegens的recA启动子的核苷酸序列如SEQIDN0.1所不，所述recA的启动子基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5’末端第3002-3175位，所述发光基因IuxCDABE的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5’末端第3192-8990位。5.—种表征遗传毒性的重组菌，其特征在于，含有如权利要求1-4中任一项所述表征遗传毒性的重组载体的菌株。6.根据权利要求5所述的一种表征遗传毒性的重组菌，其特征在于，是含有表征遗传毒性的重组载体的大肠杆菌EscherichiacoliPro2017。7.根据权利要求6所述的一种表征遗传毒性的重组菌，其特征在于，含有表征遗传毒性的重组载体的大肠杆菌EscherichiacoliPro2017,已于2018年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.15451。8.权利要求6或7所述的表征遗传毒性的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：DrecA基因启动子、报告基因与载体连接获得表征遗传毒性的重组载体；2将步骤1中构建的表征遗传毒性的重组载体导入大肠杆菌EscherichiacoliPro2017中，获得表征遗传毒性的重组菌。9.表征遗传毒性的载体或表征遗传毒性的重组菌的应用，其特征在于，表征遗传毒性的载体或表征遗传毒性的重组菌用于检测遗传毒性物质，或用于检测是否存在具有DNA损伤能力的辐射。10.—种检测遗传毒性物质的方法，其特征在于，将表征遗传毒性的重组菌与待测溶液混合，培养所述重组菌，通过检测报道基因表达产物的量来判断待测溶液是否含有遗传毒性物质。

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