申请/专利权人：南昌大学第一附属医院

申请日：2018-05-31

公开（公告）日：2021-04-27

公开（公告）号：CN108441555B

主分类号：C12Q1/6883(20180101)

分类号：C12Q1/6883(20180101);C12N15/113(20100101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.27#授权;2018.09.18#实质审查的生效;2018.08.24#公开

摘要：本发明提供了三条环状RNA在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用，其中三条环状RNA分别为circ0082688、circ0082689、circ0054189，碱基序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。与健康对照者全血相比，三条环状RNA在系统性红斑狼疮患者血浆中显著高表达，并证实系统性红斑狼疮患者全血circ0082688、circ0082689、circ0054189表达水平显著高于健康对照者。且本发明制备了筛查三条环状RNA的引物，为研究系统性红斑狼疮的发病机制提供新的思路，也为三条环状RNA的早期诊断提供了新的靶标。

主权项：1.一种系统性红斑狼疮诊断生物标志物，其特征在于，该标志物由三条环状RNA组成，三条环状RNA包括circ0082688、circ0082689、circ0054189，所述circ0082688的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述circ0082689的碱基序列如SEQIDNO.2所示，所述circ0054189的碱基序列如SEQIDNO.3所示。

全文数据：三条环状RNA在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用技术领域[0001]本发明属于天然核糖核苷酸的用途，并且更具体地，涉及三条环状RNA在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用。背景技术[0002]系统性红斑狼疮是一种病因不明的，以免疫性炎症为突出表现的系统性自身免疫病，好发于育龄期妇女。血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体和多器官受累是其两个主要临床特征。该病临床表现复杂，病程迀延反复，复发与缓解交替，且此病免疫功能紊乱和发病关键环节等致病机制尚不清楚。SLE患者在全世界范围内不断增长，据我国流行病学的初步统计，目前我国的SLE患者约有86〜130万，严重危害人类健康。临床研究证实，早期诊断和适当的治疗可以阻断或延缓疾病的进程，防止SLE患者出现不可逆的组织器官损伤，有效提尚患者的生活质量。[0003]目前，SLE的临床诊断主要依据临床表现和实验室检查，尤其是自身抗体的检测。由于SLE可累多人体多个组织和器官，临床表现不一且多不典型，患者就诊的科室也不同，这给临床诊断造成了很大障碍，极易造成漏诊和误诊，因此实验室检查往往成为SLE诊断的重要依据。但现有的所有SLE诊断的特异性实验室检测指标均存在检测敏感性差、不能有效的监测病情和评估预后等不足。因此，寻找敏感、特异的新型诊断标记物对于SLE的早期发现、病情监测和预后评估具有重要的临床意义。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种三条环状RNA在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用，三条引物分别为circ0082688、circ0082689、circ0054189。[0005]本发明的另一个目的是提供检测三条环状RNAS卩circ0082688、circ0082689、circ0054189的引物。[0006]本发明利用环状RNACircRNA表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到三条在系统性红斑狼疮患者全血中显著高表达的circRNA，即circ0082688、circ0082689、circ0054189,其转录区域分别位于7、7、2号染色体，全长分别为11151bp、3373bp、6204bp，circ0082688的碱基序列如SEQIDN0.1所示，circ0082689的碱基序列如SEQIDN0.2所示，circ0054189的碱基序列如SEQID冊.3所示。与健康人群全血相比，^代0082688、circ0082689、circ0054189在系统性红斑狼疮患者全血中显著高表达。在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实系统性红斑狼疮患者全血circ0082688、circ0082689、circ0054189表达水平显著高于健康对照者和类风湿关节炎患者。circ0082688、circ0082689、circ0054189将为进一步研究系统性红斑狼疮的发病机制提供新的思路，也为系统性红斑狼疮的早期诊断提供了新的靶标。[0007]本发明提供了鉴别可能患有系统性红斑狼疮对象的方法及其引物序列结构。[0008]所述方法包括检测来自所述对象的样品中的circ0082688、circ0082689、circ0054189量，其中较高量的circ0082688、circ0082689、circ0054189与所述对象患有系统性红斑狼疮的概率成正相关关系。[0009]本发明的有益效果有：1提出了circ0082688、circ0082689、circ0054189的用途；2circ0082688、circ0082689、circ0054189是一些新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。circ0082688、circ0082689、circ0054189在系统性红斑狼疮的全血和健康对照者全血中表达量存在差异，因此，circ0082688、circ0082689、circ0054189具有成为系统性红斑狼疮诊断标志物的应用前景。附图说明[0010]图1为CircRNA芯片检测结果图；[0011]图2为使用circ0082688、circ0082689、circ0054189筛查引物对系统性红斑狼疮患者和健康对照者全血样品表达量筛查的结果图；[0012]图3为肺系统性红斑狼疮患者全血样本circ0082688、circ0082689、circ0054189表达量与系统性红斑狼疮病人疾病严重程度相关性图；[0013]图4为ROC曲线分析图。具体实施方式[0014]环状RNAcircularRNA，circRNA是一类具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子，在哺乳动物中普遍存在，具有丰度高、结构稳定和组织特异性表达等特征。近年研究表明，circRNA可在转录及转录后水平调控基因表达功能，与多种疾病的发生及发展密切相关。随着circRNA研究的进一步深入，越来越多的证据表明circRNA表达谱会随着疾病进程发生变化。研究已经证实全血中存在着几百种circRNAs，这些circRNA分子性质稳定，含量丰富且不会降解，易于定量检测，并存在着显著的疾病特异性。全血circRNA作为疾病诊断和预后分子标志物不仅创伤小，方法便捷，还能改进疾病诊断，预后估计、疗效及复发预测的准确度。目前已有文献报道，circRNA可以作为癌症诊断标志物，但尚未见有关全血circRNA作为系统性红斑狼疮诊断标志物的报道。[0015]下面结合具体实验步骤对本发明进行进一步描述。[0016]实施例1:系统性红斑狼疮患者与健康对照者全血的circ0082688、circ0082689、circ0054189芯片表达分析[0017]—、对象和方法[0018]1.对象[0019]江西省南昌大学第一附属医院风湿免疫科收治的系统性红斑狼疮患者3例，全为女性。SLE患者均符合美国风湿病学会ACR1997年制订的SLE诊断标准，且无合并其它风湿性、代谢性和内分泌疾病。健康对照者3例为同期于南昌大学第一附属医院保健科体检者，排除炎症性疾病，感染性疾病和自身免疫性疾病，年龄与性别比例与病例研究对象相匹配。[0020]2.方'法[0021]1样本采集:清晨采集研究对象空腹静脉血，EDTA抗凝，取250微升全血加入到750微升TRIzolLS中混匀，-80°C保存备用。[0022]2全血总RNA提取：按Qiagen公司的RNA提取试剂盒（RNeasyMicroKit，货号74004说明书提取研究对象全血的总RNA。[0023]3对样品RNA进行Cy5荧光标记（委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStarHumanCircRNAMicroarrayVl.OService”进行标记服务）[0024]4circ0082688、circ0082689、circ0054189表达谱分析：根据试剂盒操作步骤，将每个样本的总RNA采用RNaseR处理，去除线性RNA分子，然后采用随机引物扩增、反转录为荧光标记的cRNA，然后在芯片上杂交，洗片后，在扫描仪上扫描。提取circRNA芯片原始数据，用R软件包对数据进行归一化及后续数据处理，寻找2组样本间差异表达的circRNA，通过倍数变化FoldChange和P值进行筛选，采用t检验方法，差异circRNA的标准为肺结核组与健康对照组表达比值多1.5倍且P0.05。[0025]3.结果[0026]关于系统性红斑狼疮患者全血的circ0082688、circ0082689、circ0054189芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的circRNAs。其中circ0082688、circ0082689、circ0054189在系统性红斑狼疮患者全血中表达显著上调，鉴于其可能在系统性红斑狼疮的全血中存在特异性高表达，本申请通过以下实施例采用大规模样本进行验证。[0027]实施例2:实时荧光定量PCR检测circ0082688、circ0082689、circ0054189在系统性红斑狼疮患者全血中的表达[0028]一、对象与方法[0029]1.对象[0030]1系统性红斑狼疮组:收集江西省南昌大学第一附属医院风湿免疫科系统性红斑狼疮患者74例，男7例，女67例，平均年龄40.5±14.5岁。SLE患者均符合美国风湿病学会ACR1997年制订的SLE诊断标准，且无合并其它风湿性、代谢性和内分泌疾病。[0031]2健康对照组:收集同期南昌大学第一附属医院进行体检的健康人43例，其中男7例，女36例，平均年龄43.9±13.0岁。所有对象均排除炎症性疾病，感染性疾病和自身免疫性疾病;排除孕妇或哺乳期妇女。[0032]2.方'法[0033]1样本采集:采集研究对象空腹静脉血，EDTA抗凝，取250微升全血加入到750微升TRIzolLS中混匀，-80°C保存备用。[0034]2全血总RNA提取及cDNA合成：按TrizolLS试剂说明书提取全血样本总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。[0035]1基因组DNA的去除[0036]依次加入表1中的试剂，并混匀配置反应液均在冰上操作）。[0037]表1基因组DNA去除所用试剂及剂量[0040]反应条件:42°C，2min。[0041]2逆转录反应[0042]配置逆转录体系，依次加入表2中的试剂，并混匀配置反应液均在冰上操作）。[0043]表2逆转录体系所用试剂及剂量[0044][0045]反应条件：37°C，15min;85°C，5sec。[0046]逆转录所得cDNA立即用于实时荧光定量PCRqRT-PCR反应或于_80°C保存。[0047]3实时荧光定量PCRqRT-PCR验证:采用SYBR法进行实时荧光定量PCR检测，检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书（SYBRiiPremixExTaq™，大连宝生物TaKaRa公司）进行。[0048]circ0082688上游引物序列：5’-TGCCGTATCGATGGCAATTC-3’；[0049]下游引物序列5’-ATAGCTCAGGTGGTCAACGC-3’。[0050]circ0082689上游引物序列：5’-GTCCCCAAACACTCTTAGCCA-3’；[0051]下游引物序列5’-CACACTCAGGTTGTGTTCGG-3’。[0052]circ0054189上游引物序列：5’-AGCACACAAACTCCCTGACA-3’；[0053]下游引物序列5’-CACCTTCGAGGGAATAGCTG-3’。[0054]内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因上游引物为:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，；[0055]下游引物为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。[0056]qRT-PCR反应配置反应液均在冰上操作，每个样本重复3次），所用试剂及剂量见表3〇[0057]表3qRT-PCR反应所用试剂及剂量[0058][0059]加样结束后，将PCR反应板置于ABI7500PCR扩增仪上检测。[0060]反应条件：95°C30secl个循环）；95°C5sec40个循环）；60°C30sec〇[0061]溶解曲线:95Γΐ58θ：;6Γ：1πΰη;95Γΐ58θ。。[0062]取平均Ct值做为该样本最后Ct值，以GAPDH基因作为内参基因，计算2_ΔΔα值反映circZFY表达水平。[0063]3.结果[0064]qRT-PCR检测结果显示，系统性红斑狼疮组患者全血circ0082688、circ0082689、Circ0054189的表达水平均显著高于健康对照组，差异有统计学意义P〈0.01，见附图2。系统性红斑狼疮患者补体水平降低，降低的程度提示疾病的活动度，相关性分析结果显示，系统性红斑狼疮组患者全血circ0082688的表达水平与补体C3呈负相关，即表达水平越高，患者病情活动度越高（见附图3。系统性红斑狼疮可累及多个系统，其中血液系统也常常受累，表现为外周血细胞数量的减少，减少的程度，提示疾病病情严重程度，相关性分析结果显示，系统性红斑狼疮组患者全血circ0082688与单核细胞数量呈负相关;系统性红斑狼疮组患者全血circ0082689与白细胞、单核细胞、中性粒细胞数量呈负相关；系统性红斑狼疮组患者全血circ0054189与白细胞、中性粒细胞数量呈负相关见附图3。为了评估全血中circ0082688、circ0082689、circ0054189的诊断价值，绘制了系统性红斑狼疮患者区别于健康对照者的ROC曲线，见附图4。曲线下面积AUC显示，全血circ0082688+circ0082689+circ0054189在用于区别系统性红斑狼疮和健康人群时，具有较好的诊断价值（AUC=0.774。最佳临界点的灵敏度为49.30%，特异度为100.00%，以证明^^0082688+circ0082689+circ0054189能特异地作为系统性红斑狼疮患者诊断的分子标志物。

权利要求：1.三条环状RNA在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用，其特征在于，三条环状RNA分别为circ0082688、circ0082689、circ0054189,所述circ0082688的碱基序列如SEQIDN0.1所示，所述circ0082689的碱基序列如SEQID勵.2所示，所述^代0054189的碱基序列如SEQIDNO.3所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述circ0082688长11151bp，位于人类的第7条染色体上，所述circ0082689长3373bp，位于人类的第7条染色体上，所述circ0054189长6204bp，位于人类的第2条染色体上。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括检测被检测对象的样品中的circ0082688、circ0082689、circ0054189含量，其中所述circ0082688、circ0082689、circ0054189的量与所述被检测对象患有系统性红斑狼疮的概率成正相关关系。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述circ0082688、circ0082689、circ0054189的含量是从被检测对象的全血样品中确定的。5.—种引物，其特征在于，所述引物用于获得被检测对象的全血的circ0082688的表达量，所述circ0082688长11151bp，位于人类的第7条染色体上，所述circ0082688的碱基序列如SEQIDNO.1所示。6.如权利要求5所述的引物，其特征在于，所述引物由以下序列构成：上游引物序列：5’-TGCCGTATCGATGGCAATTC-3’；下游引物序列:5’-ATAGCTCAGGTGGTCAACGC-3’。7.—种引物，其特征在于，所述引物用于获得被检测对象的全血的circ0082689的表达量，所述circ0082689长3373bp，位于人类的第7条染色体上，所述circ0082689的碱基序列如SEQIDNO.2所示。8.如权利要求7所述的引物，其特征在于，所述引物由以下序列构成：上游引物序列:5’-GTCCCCAAACACTCTTAGCCA-3’；下游引物序列:5’-CACACTCAGGTTGTGTTCGG-3’。9.一种引物，其特征在于，所述引物用于获得被检测对象的全血的circ0054189的表达量，所述circ0054189长6204bp，位于人类的第2条染色体上，所述circ0054189的碱基序列如SEQIDNO.3所示。10.如权利要求9所述的引物，其特征在于，所述引物由以下序列构成：上游引物序列：5’-AGCACACAAACTCCCTGACA-3’；下游引物序列：5’-CACCTTCGAGGGAATAGCTG-3’。

百度查询： 南昌大学第一附属医院 三条环状RNA在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用

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