申请/专利权人:新疆农业科学院植物保护研究所
申请日:2021-01-27
公开(公告)日:2021-05-07
公开(公告)号:CN112760335A
主分类号:C12N15/70(20060101)
分类号:C12N15/70(20060101);C12N15/67(20060101);C12N15/66(20060101)
优先权:
专利状态码:在审-实质审查的生效
法律状态:2021.05.25#实质审查的生效;2021.05.07#公开
摘要:筛选菌液表达dsRNA载体的方法,它涉及一种筛选表达dsRNA载体的方法。针对RNAi的特异性以及原核发酵获得dsRNA良好的应用前景,本发明提供筛选菌液表达dsRNA载体的方法以及提高原核表达dsRNA表达量的方法。本发明方法:一、合成测试dsgfp片段;二、设计引物;三、测试dsgfp片段扩增;四、备选表达载体酶切后与扩增片段重组,质粒转入感受态细胞;五、IPTG诱导表达;六、体外合成的dsgfpDNA模板制备;七、取诱导菌液用备选dsRNA提取方法提取菌液中的dsgfp;八、根据测定结果从备选表达载体中确定最合适的表达载体及最佳dsRNA提取方法。
主权项:1.筛选菌液表达dsRNA载体的方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:一、以gfp序列为模板,节选不同长度的dsgfp片段并随机改变序列的碱基,合成不同碱基CG含量的测试dsgfp片段;二、以启动子为起始序列设计、合成体外合成引物;根据备选表达载体选择双酶切位点设计、合成dsgfp片段扩增引物;三、以测试dsgfp片段为模板,用dsgfp片段扩增引物进行PCR扩增;四、对备选表达载体进行双酶切然后与步骤三PCR扩增的dsgfp片段重组,再将重组产物加入Trans-T1感受态细胞培养,挑取单克隆进行验证和测序;验证正确的质粒转入HT115DE3感受态细胞;获得初始菌液;五、IPTG诱导表达,获得诱导菌液;六、体外合成的dsgfpDNA模板制备;七、取诱导菌液采用备选dsRNA提取方法提取菌液中的dsgfp;八、根据测定菌液的dsgfp浓度、纯度和产量结果从备选表达载体中确定最为合适的表达载体以及该表达载体对应的最佳dsRNA提取方法。
全文数据:
权利要求:
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