申请/专利权人：河北师范大学

申请日：2017-11-02

公开（公告）日：2021-05-07

公开（公告）号：CN107794273B

主分类号：C12N15/70(20060101)

分类号：C12N15/70(20060101);C12N1/21(20060101);C12P13/06(20060101);C12N9/04(20060101);C12N9/06(20060101);C12N9/90(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.07#授权;2018.04.06#实质审查的生效;2018.03.13#公开

摘要：本发明公开了一种合成DL‑丙氨酸的三基因共表达载体的构建及应用。根据同尾酶原理，将假坚强芽胞杆菌中编码丙氨酸脱氢酶ald、丙氨酸消旋酶alr和葡萄糖脱氢酶gdh基因串联插入到改造过的质粒pET‑22bNS上，构建三基因共表达载体pET‑22bNS‑GAA。所构建的三基因共表达载体转入大肠杆菌BL21DE3中，以重组菌株全细胞催化反应3h后L‑丙氨酸和D‑丙氨酸的产量最高，分别为7.0和6.5mgmL，二者的最高合成效率分别为56.4和51.9mgmLd。本发明所构建的三基因共表达载体具有高效合成DL‑丙氨酸的能力，具有较好的应用价值。

主权项：1.一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4和SEQIDNo.6共同构成，其中：1SEQIDNo.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；2SEQIDNo.2所示序列为葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；3SEQIDNo.4所示序列为丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；4SEQIDNo.6所示序列为丙氨酸消旋酶基因的核苷酸序列。

全文数据：一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用技术领域[0001]本发明涉及一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的构建方法及应用，属于酶工程和化合物生物合成技术领域。背景技术[0002]DL-丙氨酸是一种非天然氨基酸，也是重要的手性中间体，广泛应用于食品、化妆品和制药等方面，国内外市场对其需求量日渐增大。现有技术中，DL-丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法、化学合成法和生物酶法，其中，化学合成法反应机制复杂、工艺过程长、生产成本高;发酵法生产周期长、设备投资大、分离复杂、成本高;生物酶法是利用微生物所产生的酶催化底物转化生成DL-丙氨酸，该方法具有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但由于所需酶蛋白的稳定性差、活性低、生产成本高。正是由于这些缺点的存在，上述三种方法均不符合工业化生产的要求，难以满足市场的需求。因此，开发高效合成DL-丙氨酸的生产方法具有非常重要的意义。[0003]早在1997年日本京都大学KenjiSoda教授等提出利用4酶偶联合成D-氨基酸Galkinetal.，1997，即利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶协同作用参与催化合成D-氨基酸，该方法转化效率较高，但高活性、高稳定性的酶蛋白的获得是此方法能否成功开发的关键。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体。[0005]本发明的目的还在于提供一种含合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法。[0006]本发明基于上述方法，以葡萄糖脱氢酶替代甲酸脱氢酶，用于催化反应中还原型辅酶NADH的再生;利用同尾酶原理将葡萄糖脱氢酶gdh、丙氨酸脱氢酶aid和丙氨酸消旋酶air三基因串联构建多基因共表达载体，使每个基因均带有独立的启动子T7启动子）、核糖体结合位点（RBS、终止子T7终止子等表达调控元件，各基因的表达相对独立；以含有多基因共表达载体的重组菌体全细胞进行催化，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新途径。[0007]本发明的目的是这样实现的：一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其核苷酸序列由SEQIDNo.l、SEQIDNo.2、SEQIDΝο·4和SEQIDΝο·6共同构成。其中：[0008]ISEQIDNo.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；[0009]2SEQIDNo.2所示序列为编码基因gdh的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C;[0010]3SEQIDNo.4所示序列为编码基因aid的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C;[0011]⑷SEQIDNo.6所示为编码基因air的核苷酸序列。[0012]本发明还提供三个编码基因gdh、ald和air的氨基酸序列，如SEQIDNo.3、SEQIDNo.5和SEQIDNo.7所示。[0013]本发明还提供含有上述三基因的共表达载体及宿主细胞。[0014]本发明还提供含有上述三基因共表达载体的工程菌。[0015]本发明还提供上述三基因共表达载体的构建方法，包括以下步骤：[0016]1根据商业载体pET_22b⑴中T7启动子和终止子待突变区域的核苷酸序列，设计定点突变引物，改造获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点;所述突变引物为：[0020]2以商业载体PET-22M+为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将含有限制内切酶NheI和SpeI识别位点的扩增产物替换商业载体的表达区域，构建能够容纳多个基因共同表达的载体pET-22bNS;[0021]3根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌0F4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对;所述引物对为：[0028]4以假坚强芽胞杆菌0F4基因组DNA为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物逐一连入改造后的载体pET-22bNS中，构建三基因共表达载体；[0029]5将上述三基因共表达载体转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶蛋白。[0030]制备方法的优选条件:步骤⑵中所述表达载体为PET系列中的任意一种。[0031]步骤⑸中所述工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。[0032]本发明进一步提供上述三基因共表达载体的应用，具体是将三基因共表达载体用于生物法生产DL-丙氨酸。[0033]具体地，本发明是从假坚强芽胞杆菌Bacilluspseudofirmus0F4中获得葡萄糖脱氢酶（GenBank:ADC51909·1、丙氨酸脱氢酶（GenBank:ADC50010·1和丙氨酸消旋酶GenBank:ADC50009.1基因，通过PCR扩增获得目的基因，并将基因片段与质粒pET-22bNS连接，构建重组表达质粒pET-22bNS-Gdh、pET-22bNS-Ald和pET-22bNS-Alr;利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和SpeI双酶切获取带有启动子、核糖体结合位点、终止子等表达调控元件的目的基因片段，逐一与经BglII和NheI双酶切处理的相应表达载体相连接，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-GAA;该重组质粒转化大肠杆菌感受态，构建三基因共表达的基因工程菌BL21DE3pET-22bNS-GAA;经30°C诱导15h后收集菌体，以重组菌体全细胞参与催化反应，在37°C下ISOrpm振荡反应3h，经检测，反应液中L-丙氨酸和D-丙氨酸的产量分别为7.0和6.5mgmL，二者的合成效率分别为56.4和51.9mgmLd〇[0034]本发明取得以下有益效果:本发明通过同尾酶的原理构建了葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶三基因共表达载体，每个基因均带有独立的表达调控元件;通过转化获得了含有三基因共表达载体的基因工程菌，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新方法，具有较好的推广应用价值。附图说明[0035]图1为pET-22bNS改造区域PCR产物电泳图谱。[0036]图1中M:2000bpDNAmarker;l:pET-22bNS改造区域PCR产物。[0037]图2为质粒pET-22bNS_Ald双酶切电泳图谱。[0038]图2中M:1.0kbDNAmarker;l:质粒pET-22bNS-Ald的双酶切产物。[0039]图3为质粒pET-22bNS-Alr双酶切电泳图谱。[0040]图3中M:1.0kbDNAmarker;l2:质粒pET-22bNS-Alr的双酶切产物。[0041]图4为质粒pET-22bNS-Gdh双酶切电泳图谱。[0042]图4中M:1.0kbDNAmarker;l:质粒pET-22bNS-Gdh的双酶切产物。[0043]图5为二基因共表达载体中基因串联不意图。[0044]图6为三基因共表达载体双酶切电泳图谱。[0045]图6中M:1.0kbDNAmarker;l:质粒pET-22bNS-GAA的双酶切产物。[0046]图7为生物合成DL-丙氨酸含量图；[0047]图7中A:反应液中L-丙氨酸的含量;B:反应液中D-丙氨酸的含量。具体实施方式[0048]以下实施例用于说明本发明。需要说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0049]实施例1构建三个基因共表达载体[0050]1改造载体pET_22b+[0051]a，引物设计:根据商业载体pET_22b⑴中T7启动子和终止子附近待突变区域的核苷酸序列，设计PCR扩增反应引物：[0055]b,增加SpeI识别位点：采用定点突变技术Site-DirectedMutagenesis，以质粒pET-22b+为模板，以Spe-FO1和Spe-RO1为引物对进行定点突变PCR，PCR反应条件为:94°C预变性4min;94°C变性35sec，55°C退火lmin，72°C延伸7min，循环16次；72°C充分延伸IOmin0[0056]PCR反应产物经限制内切酶DpnI消化后，转化至大肠杆菌E.coliDH5a，挑取单一菌落培养后提取质粒并送样测序验证，获得含有SpeI识别位点的突变质粒pET-22bS。[0057]c，增加NheI识别位点：以质粒pET_22bS为模板，以Nhe-FOl和Spe-ROl为引物对进行PCR，PCR反应条件为:94°C预变性4min;94°C变性35sec，55°C退火Imin，72°C延伸Imin，循环22次;72°C延伸IOmin。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测、分离见图1，约390bp的DNA片段），将通过胶回收获得的目的DNA与T载体pMD18-T连接构建载体pMD-22bNS，转入大肠杆菌E.coliDH5a，挑取菌落培养后送样测序验证；[0058]将测序正确的质粒pMD-22bNS经BgIII和SpeI双酶切，酶切产物经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bS混匀，以T4连接酶16°C过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.CoIiDH5a，筛选获得含有限制内切酶NheI和SpeI识别位点的质粒pET-22bNS。[0059]2获得目的基因[0060]依据假坚强芽胞杆菌0F4已知的葡萄糖脱氢酶Gdh，GenBank:ADC51909.1、丙氨酸脱氢酶Ald，GenBank:ADC50010.1和丙氨酸消旋酶Alr，GenBank:ADC50009.1基因序列设计PCR引物，以B.pseudofirmus0F4基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得对应的特异DNA片段。各基因扩增引物及PCR条件分别为：〔下划线为NdeI的识别位点）f下划线为NotI的识别位点）下划线为NdeI的识别位点）下划线为XhoI的识别位点）〔下划线为NdeI的识别位点）下划线为XhoI的识别位点）[0067]95°C预变性5min;95°C变性45sec，53°C退火lmin，72°C延伸90sec，循环25次；72°C延伸lOmin。扩增得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，分别与载体pMDIS-T连接，并将连接产物转化至大肠杆菌E.CoIiDH5a，挑取菌落进行菌落PCR检测，挑选具有目的DNA条带的阳性克隆培养、提取质粒并送样测序。序列比对发现测序基因与Genbank公布的序列完全一致。[0068]3构建三基因共表达载体[0069]a，构建单基因表达载体：质粒pMB18-Gdh、pMB18_Ald和pMB18_Alr经NdeI、XhoI或NotI双酶切，获得大小均约为I.Ikbp的DNA片段。酶切产物经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bNS混合，用T4连接酶16°C过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5a，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得表达载体pET-22bNS-GdhO、pET-22bNS-AldO和pET-22bNS-Alr〇[0070]b，构建同义突变体：由于葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶的核苷酸序列中分别存在一个限制内切酶BglIIAGATCT或SpeIACTAGT的识别位点，为了消除这些影响构建多基因共表达载体的酶切位点，在不改变酶蛋白的氨基酸序列的前提下，根据葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶基因中待突变区域的核苷酸序列设计定点突变引物，通过定点突变技术构建同义突变体，从而消除基因中限制内切酶BglII及SpeI的识别位点;所述突变引物为：[0075]采用定点突变技术，分别以质粒pET-22bNS-GdhO和pET-22bNS-AldO为模板，以引物对Gdhl88D-F01和Gdhl88D-R01或Aldl07L-F01和Aldl07L-R01进行定点突变PCR，PCR反应条件为:94°C预变性4min;94°C变性35sec，55°C退火lmin，72°C延伸7min，循环16次;72°C充分延伸lOmin。[0076]PCR反应产物经限制内切酶DpnI消化后，转化至大肠杆菌E.coliDH5a，挑取单一菌落培养后提取质粒并送样测序验证，获得分别消除BglII和SpeI识别位点的突变质粒pET-22bNS-Gdh和pET-22bNS-Ald，其中葡萄糖脱氢酶中第188位的天门冬氨酸⑼残基密码子由GAT突变为GAC，丙氨酸脱氢酶中第107位的赖氨酸L残基密码子由CTA突变为CTC，二者的氨基酸序列均未发生改变，即为同义突变体。[0077]c，构建三基因共表达载体:将表达载体pET-22bNS_Ald经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约1.4kb的DNA片段见图2，将该DNA与经限制内切酶BglII和NheI双酶切处理的质粒pET-22bNS-Alr见图3相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.CoIiDH5a，并通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得双基因共表达载体pET-22bNS-AA;[0078]将表达载体pET-22bNS_Gdh经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约1.41Λ的DNA片段见图4，将该DNA与经限制内切酶BglII和NheI双酶切处理的双基因共表达载体pET-22bNS-AA相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5a，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得三基因串联共表达载体pET-22bNS-GAA，其中每个基因都带有独立的启动子、核糖体结合位点和终止子等表达调控元件（见图5;经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理得到一个大小约为4.2kb的DNA片段见图6，说明三基因共表达载体构建成功。[0079]实施例2生物合成四氢嘧啶[0080]1三基因共同表达[0081]将三基因共表达载体pET-22bNS-GAA转化至大肠杆菌BL21DE3感受态细胞，挑选转化子于37°C含lOOygmL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养;次日将培养液以1:100比例接种于IOOmL含lOOygmL氨苄青霉素的LB培养液，于37°C180rpm下振荡培养至㈤600为0.5〜0.6时，于30°C诱导15h，8000rpm离心收集菌体，用0.8%的NaCl溶液洗菌体；[0082]2全细胞催化合成四氢嘧啶[0083]称取Ig菌体重悬于20mL反应液（20mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液，pH10;200mM丙酮酸钠，200mM氯化铵，200mM葡萄糖）中，于37°C180rpm振荡培养3h后离心去除菌体，采用HPLC检测上清中L-丙氨酸和D-丙氨酸的含量。结果显示，该反应所合成L-丙氨酸和D-丙氨酸的含量分别为7.0和6.5mgmL见图7，二者的最高合成效率分别为56.4和51.9mgmLd，具有较高的合成水平。[0084]虽然，以上已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。SEQUENCELISTING河北帅范人学.201771DNA质粒pET-22bNS表达区域:21116DNAPRT4：DNA假丨弟强芽胞杆菌（Baciiliispseuttefirmus0F4〉PRT5MetTieTie：ClyTiePro：LysGlu：TieLysAsnAsnGluAvsnArg¥alI5TO15AlalieThrProALaGlyValValAlaLewThrLysAlaGlyHisGln202530HeLeulieGluGlnGlyAlaGlylieGlySerGlyPheGluAspVal354Q45AspTyrThrAlaAlaGlyAlaThrHelieProGluAlaLysAspVal505360TrpAlaLysAla;GluMet：ValMetLysValLysGluProLeuSerSerSS7Q75mGluTyrGlyTyrPheArgLysGlyLeuHeLeuPh©ThrΊγτLeuHis859.Θ.9.5LeuAlaAlaGluProGluLeuAlaLysAlaLeuValAspSerGlyVal100105110lieAlaHeAlaTyrJIuThrValGlu?alAsnIrgThrLeuProLena115120125LeuThrProMetSerGluValAlaGlyArgMetAlaSefGlnlieGly130135140AlaGIbPheLeuGluLyS:SerLysGlyGlyLysGlylieLeuLeuSer145150155160GlyValProGlyValLysArgGlyLysValThrlielieGlyGlyGly靡170175ValYalGlyTbrAsnAIaAlaLysHeAlaValGlyLeuGlyAlaAsp180185190rI¥alThrLeulieAspLeuSerAlaAspArgLeuArgGlnLeuAspAsp195200205GlnPhe：GlyAsnA^plie：GlnThfLeuMetSorAsnProLeuAsnHe210215220AlaGluAlaYalLysGluSerAspLeuVallieGlyAlaYalLeulie225230235240ProGlyAlaLys；AlaProLysLeuValTbrGluGluMetlieLysSef245250255MetThrProĜlySetValValValAspValAlalieAspGlnGlyGly26:02蘭270Ublie：GluThrValAsp；GlnHeThrThrHisAspAsnProThrTyr275280285ThrLysHisGlyVaIValHisTyrAla¥alAlaAsdMetProGlyAla29Q295300ValProArgThrSerTbrIlaGlyLeu.ThrAsnYalThrHeProTyr30531G315320MaMetGlnHeAlaAsnLysGlyValGluLysAla¥alAlaGluAsn325330335ProAlaLeuAiaLeuGlyValAsnVal.AlaAsriGlyAspValThrTyrMO.345350AhŭAlaVaIAlaArĝAsp.LeuGlyTyrGluLeUVa：lS.er¥alJluAsp.3δδ360365AlaLeuLysLys：ThrProValGlnAla[0092]370:37561107DNA7369PRT假坚强芽胞杆菌（Bacilluspseudofirmus0F47MetLysThrSerSerPheArgAsnThrTyrAIaGlnHeSerLeuGln151015AlaLeuLysGluAsnAlaAlaSerPheLysAlaSerLeuGlnSerF^ro202530：MaCysArgLeuMetAlaValValLysGlyAspGlyTyrGlyHisGly354045AlaValAlaAlaAlaSarSerAlaLeuAsnGlyGlyAlaAsp；Tyften505560GlyValALaHeLauAsp：GluAlaHeGXuLauArgAspAlaGlyVal65707580GluAlaProlieLeuValLeuGlyTyfThrSerProHisAlaLeuArg859095GluAlaHeSerArgAsnHeThrLeuThrValPheSarThrAspVal100105HOArgAsp；AlaLenLeuGluValAlaSerGluAlaGluSerProlieLys：115120125ValHlsHeLysThrGluThrGlyMatGlyArgValGlyValGlnThr130135140LysGluGlutenLeuAsp；ValMet：ThrProLeuTyrHisHis：AsnAsn14515:0155160HeGXuValGluGlyHePheThrHisPheALaGluALaAsp：AsnLm165170175GlnSarThrTyrThrAsp；GluGlnPheAlaArgPh：aLeuSerPhelie:180185190GluAlaHeGXuLysAsp：AspMe*tHisValProHeLysHlsCysCys19520Q205AsnSerAlaGlyThrtenPheHis：LysAspLysHisLeuAsp:MetYal210215220ArgValGlylie：SerLeuTyrGlyLeuArgProAspValSerLeulu225230235240PheProHeGXuLeuThrGlnAlaMatArgLauPheSarS©rlieVal245250255SerLeuArgLysLeuProGluGlySerSerlieSarTyfGlyArgThr260265270HisLysLeuSerSarGluLysValValAlaThrMe*tProHeGlyTyr275280285AlaAspGlyLeuSerArgAlaLeuSerAsnLysGlyPheValThrten290295300[0095]HisGlyGlnLysALaProHehmGlyArgValCysMatAsp：GlnThr30531031:5320Metlie：AspValThrAsp；lieProAspAlaAlaLenGlyAsp；HisVal325330335GluPheProHeAspGluMatAlaGluLmThrGlyThrHeAsnTyr340345350GlulieValCys：AlaValSerLysArgValProArgTyrTyrGluGlu355360365Asn

权利要求：1.一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQIDNo·l、SEQIDNo·2、SEQIDNo·4和SEQIDNo·6共同构成，其中：1SEQIDNo.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；2SEQIDNo.2所示序列为葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C;3SEQIDNo.4所示序列为丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C;⑷SEQIDNo.6所示序列为丙氨酸消旋酶基因的核苷酸序列。2.—种编码如权利要求1所述三个酶蛋白Gdh、Ald和Alr，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDN0.3、SEQIDΝο·5和SEQIDΝο·7所示，其中SEQIDΝο·3中第188位的天门冬氨酸⑼为同义突变GAT—GAC，SEQIDNo.5中第107位的赖氨酸L为同义突变CTA—CTC。3.—种含权利要求1所述三基因共表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1根据质粒pET-22b⑴中T7启动子和终止子待突变区域核苷酸序列信息，设计突变引物，通过PCR突变技术引入限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；所述引物为：Nhe-FOi：S7-Gagatctcgatgctagcaaattaatacgactc-S7；Spe-FO1:57-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-37；Spe-RO1:57-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-37；以质粒pET-22b⑴为PCR模板，使用上述设计的引物，利用PCR突变技术将T7启动子和终止子待突变区域分别突变获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点，改造获得质粒pET-22bNS；⑵根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌0F4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，通过PCR扩增获得目的DNA;所述各基因扩增引物为：Gdh-FO1:57-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-37Gdh-RO1:57-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-37Ald-FO1:57-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-37Ald-RO1:57-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-37Alr-FO1:57-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-37Alr-RO1:57-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-37以来自假坚强芽胞杆菌Bacilluspseudofirmus0F4的基因组DNA为模板，使用上述设计的引物，利用PCR技术扩增获得目的DNA片段，通过限制内切酶将目的DNA与经相同酶切处理的质粒pET-22bNS连接，构建表达载体pET-22bNS-GdhO、pET-22bNS-AldO和pET-22bNS-Alr；3在不改变氨基酸序列的前提下，根据待突变区域的核苷酸序列设计定点突变引物，通过定点突变技术构建同义突变以消除相关限制内切酶的识别位点；所述突变引物为：Gdh188D-F01:57-CTCTGCCCCAGACCTAGCACAGGAC-37Gdh188D-R01:57-GTCCTGTGCTAGGTCTGGGGCAGAG-37Aldl07L-F01:57-GCAAAAGCACTCGTAGACAGCG-37Aldl07L-R01:57-CGCTGTCTACGAGTGCTTTTGC-37以质粒PET-22bNS-GdhO和pET-22bNS-AldO为模板，使用上述设计的引物，利用定点突变技术分别消除葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶基因中的BglII或SpeI识别位点，改造获得质粒pET-22bNS-Gdh和pET-22bNS-Ald;4利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和NheI或SpeI逐一双酶切处理表达载体pET-22bNS-Gdh，pET-22bNS-Ald和pET-22bNS-Alr，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-GAA。4.含有权利要求1所述三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法，其特征在于：1将共表达载体pET-22bNS-GAA通过化学转化法转入大肠杆菌BL21DE3中，37°C于含100ygmL氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养，即得工程菌；⑵挑取单菌落，37°C于含lOOygmL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD6qq达0.5-0.6时，于30°C诱导15h，离心收集菌体作为转化反应的酶源；⑶称取Ig湿菌体，重悬于20mL含200mM丙酮酸钠，200mM氯化铵，200mMD-葡萄糖，20mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液pH10中，在37°C下180rpm振荡反应3h，离心去除菌体，经检测反应液中L-丙氨酸和D-丙氨酸的含量分别为7.0和6.5mgmL，合成效率分别为56.4和51.9mgmLd〇5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤⑴中表达载体为pET系列中的任意一种。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤（1所述的工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。7.—种如权利要求1所述三基因共表达载体的应用，其特征在于用于生物合成L-丙氨酸和D-丙氨酸。

百度查询： 河北师范大学 一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用

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