申请/专利权人:淡马锡生命科学研究院有限公司
申请日:2015-08-21
公开(公告)日:2021-05-07
公开(公告)号:CN107075450B
主分类号:C12N1/14(20060101)
分类号:C12N1/14(20060101);C12N15/53(20060101);C12N15/81(20060101);C12P7/64(20060101);C12R1/645(20060101)
优先权:["20140908 US 62/047,300"]
专利状态码:有效-授权
法律状态:2021.05.07#授权;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开
摘要:本发明涉及真菌生物技术领域,更特别是在选自红冬孢酵母属和红酵母属的真菌宿主中产生多不饱和脂肪酸PUFA的遗传工程方法。
主权项:1.一种真菌宿主细胞,其中在所述真菌宿主细胞中总脂肪酸包含水平为至少9%的升高水平的多不饱和脂肪酸PUFA,其中所述真菌宿主细胞的基因组已被修饰使得所述真菌宿主细胞与具有未修饰的基因组的真菌宿主细胞相比具有减少的天然醛脱氢酶ALD1酶活性,并且其中所述真菌宿主是红冬孢酵母属Rhodosporidium或红酵母属Rhodotorula的物种,并且其中所述天然ALD1的氨基酸序列由SEQIDNO:3示出的序列组成。
全文数据:在红冬孢酵母属和红酵母属物种中高效产生多不饱和脂肪酸PUFA的方法[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请涉及并要求2014年9月8日提交的美国临时专利申请系列号62047,300的优先权。该申请整体援引加入本文。[0003]序列提交[0004]本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2577237PCTSequenceListing.txt,2015年7月2日创建,并且大小为321kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本文。[0005]发明背景[0006]本发明涉及真菌生物技术领域,更特别是在选自红冬孢酵母属Rhodospordium和红酵母属Rhodotorula的真菌宿主中产生ω-3多不饱和脂肪酸PUFA的遗传工程方法。[0007]本文中用来说明本发明的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其他材料援引加入本文,并且为了方便,分别分组在参考文献中。[0008]〇mega-3脂肪酸(也称作ω-3脂肪酸或η-3脂肪酸)是指α-亚麻酸ALA[9Ζ,12Ζ,15Ζ-9,12,15-十八碳三烯酸]、EPA二十碳五烯酸,或[5Ζ,8Ζ,IIZ,14Ζ,17Ζ-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸]和DHA[二十二碳六烯酸,或4Ζ,7Ζ,IOZ,13Ζ,16Ζ,19Ζ-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸]。动物ω-3ΕΡΑ和DHA脂肪酸的常见来源包括鱼油、卵油、乌贼油和磷虾油,而一些植物油如来自沙棘籽和浆果、藻类细胞、亚麻籽、奇亚籽和火麻仁的油包含高水平的ALA。[0009]亚油酸[92,122-9,12-十八碳二烯酸]、丫-亚麻酸的1^,或11-^8-6,9,12-十八碳三烯酸和花生四烯酸[5Z,8Z,IIZ,14Z-5,8,11,14-二十碳四烯酸]是ω-6脂肪酸。GLA是主要在基于植物的油如琉璃苣种子油、月见草油和黑醋栗种子油中发现的ω-6脂肪酸。[0010]ω-3脂肪酸对于正常代谢是至关重要的。据认为ω-3是必需脂肪酸,S卩,不可以通过人体合成,除了哺乳动物具有有限能力,当饮食包括短链ω-3脂肪酸ALA时,以形成更重要的长链ω-3脂肪酸ΕΡΑ,然后从ΕΡΑ,以甚至更低的效率形成最重要的DHA。现在接受ω-3多不饱和脂肪酸,特别是EPA和DHA在人类健康的许多方面起重要作用。但是,过度捕捞和关于海洋环境污染的担心表明需要开发极长链多不饱和脂肪酸VLC-PUFA如EPA和DHA的可选的可持续来源[1]。据认为ω-6脂肪酸是必需脂肪酸:它们对于人类健康是必需的。连同ω_3脂肪酸,ω-6脂肪酸在脑功能以及正常生长和发育中起到至关重要的作用。ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸有助于刺激皮肤和毛发生长,保持骨骼健康,调节代谢,以及维持生殖系统[2]。一些初步临床研究表明GLA可能可用于糖尿病性神经病、类风湿性关节炎、过敏、湿疹、高血压Hypertension、绝经期症状等。据认为ω-6和ω-3必需脂肪酸的膳食摄入比例对于人体健康很重要[3]。[0011]到目前为止已报道大量产油微生物。它们产生的油常称作单细胞油(SCO与植物的相似,并且可以用于生产生物柴油、食品和工业产品[4-6]ACO现在在市场上被广泛接受,并且越来越意识到PUFA如γ-亚麻酸GLA、花生四烯酸ARA、DHA和EPA的健康益处。ARA和DHA还已在世界许多地方用于强化婴儿配方。鱼油是DHA和EPA的丰富来源,并且有限数量的植物油料种子是其他PUFA的良好来源。海洋原生生物和沟鞭藻类如破囊壶菌属Thraustochytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium和Crypthecodinium的物种是DHA的丰富来源,而微藻如褐指藻属PhaeodactyIum和Monodus是EPA的良好来源。低等真菌被孢霉属Mortierella的物种在脂质级分中积累高百分比的ARA[7]。[0012]虽然酵母解脂耶氏酵母YarrowiaIipolytica可能作为SCO的生物工程宿主享有悠久的研究和开发历史[8-12],但是圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides也称作Rhodotorulaglutenis已吸引越来越多的关注,这是由于其能够以快速生长速度进行较高的细胞密度发酵,高效产生具有67%ww干细胞质量油含量的细胞团块[13-16]。[0013]柄锈菌亚门(Pucciniomycotina是担子菌门(Basidiomycota中的真菌亚门[17]。其拥有许多具有重要工业应用的物种。例如,红冬孢酵母属Rhodosporidium和锁掷酵母属(Sporidiobolus中的许多物种如圆红冬孢酵母也称作瘦弱红酵母Rhodotorulagracilis'Rhodosporidiumglutinis、粘红酉孝母(Rhodotorulaglutinis、Torulakoishikawensis和Torularubescens和赫色掷抱酉孝母(Sporobolomycessalmonicolor是能够高密度发酵的富含油的单细胞酵母[6,18]。这些物种拥有巨大潜力作为宿主用于产生长链烃,如三酰甘油TAG,或脂肪)、脂肪酸酯(生物柴油)、脂肪醇、醇、内酯、萜类化合物和维生素[14,19-21]。[0014]红冬孢酵母属和红酵母属基因组是高度富含GC的,已发现这深刻影响遗传转化和蛋白表达[22-24]。代谢工程是提高植物和微生物中的代谢物生成的有效技术。在ω-3脂肪酸的生物工程方面,在植物和产油酵母中表达各种去饱和酶和延长酶对于PUFA的产生至关重要[25]ALA通过Δ6-去饱和酶合成自亚油酸(LA;C18:2Δ9,12cis。红花Carthamustinctorius的种子油包含高LA,并且已通过用来自高山被孢霉Mortierellaalpina和异枝水霉(Saprolegniadiclina的Δ6-去饱和酶转化进行修饰以分别获得超过50%vV的GLA[26]。[0015]ALA和GLA是产生较长链ω-3脂肪酸如花生四烯酸AA、EPA和二十二碳六烯酸DHA的前体[7,27]。因此,以高容积生产率产生高水平的ALA和GLA的能力对于圆红冬孢酵母中较长链PUFA的生物工程至关重要。因此,需要开发产生高水平的ALA和GLA然后在真菌物种中可用于产生较长链PUFA的红冬孢酵母属和红酵母属的真菌物种。[0016]发明概述[0017]本发明涉及真菌生物技术领域,更特别是在选自红冬孢酵母属和红酵母属的真菌宿主中产生ω-3多不饱和脂肪酸PUFA的遗传工程方法。[0018]在第一方面,本发明提供一种真菌宿主,其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少9%量存在的α-亚麻酸ALA。在一实施方案中,所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中,所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中,所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶ALD活性,所述天然醛脱氢酶ALD使用脂肪酸醛作为底物。所述天然ALD由天然ALD基因编码。在一实施方案中,所述天然ALD基因编码具有SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列的醛脱氢酶ALD。在另一实施方案中,所述天然ALD基因编码具有SEQIDN0:3中示出的氨基酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的六〇。在一实施方案中,所述天然ALD基因具有SEQIDNO:1中示出的基因组核苷酸序列。在另一实施方案中,所述天然ALD基因具有SEQIDN0:2中示出的cDNA核苷酸序列。在另一实施方案中,所述天然ALD基因具有这样的核苷酸序列,其具有SEQIDNO:1或SEQIDN0:2中示出的核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0019]在一些实施方案中,减少的天然ALD活性是由减少的天然ALD基因表达引起的。减少的表达可以由任何遗传或表观遗传机制引起。在一实施方案中,减少的表达是由RNAi机制如siRNA、shRNA、miRNA等引起的。在另一实施方案中,减少的表达是由人工转录阻遏物引起的。在另一实施方案中,减少的表达是由反义机制引起的。在一实施方案中,减少的表达是由有义抑制引起的。在另一实施方案中,减少的活性是由天然基因的突变引起的。在一实施方案中,所述突变可以是导致活性减少的取代、缺失、插入、添加或倒位等。在另一实施方案中,所述突变可以由同源重组引起。在另一实施方案中,所述突变可以由T-DNA或转座子插入引起。[0020]在第二方面,本发明提供一种真菌宿主,其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少49%的量存在的α-亚麻酸ALA。在一实施方案中,所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中,所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中,如本文所述,所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶ALD活性。在其他实施方案中,所述真菌宿主的基因组已被修饰以稳定地包括编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的两个或更多个基因。这类蛋白的实例为酰基-CoAδ-12去饱和酶、硬脂酰-αΑ_δ-9-去饱和酶、ω-3去饱和酶、脂肪酸延长酶、乙酰基-CoA羧化酶ACC、ATP:柠檬酸裂解酶ACL、二酰甘油酰基转移酶DGA或苹果酸酶MAE。在一些实施方案中,这类基因的编码序列已被修饰以包含至少55%G和C含量,优选60%-70%G和C含量。在其他实施方案中,至少70%的密码子在第三位具有C或G。[0021]在一实施方案中,ATP:柠檬酸裂解酶ACL具有SEQIDN0:88中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种ATP:柠檬酸裂解酶ACLl由具有SEQIDN0:86中示出的核苷酸序列的基因组DNA核酸编码。在另一实施方案中,这种ATP:柠檬酸裂解酶ACLl由具有SEQIDN0:87中示出的核苷酸序列的cDNA核酸编码。在另一实施方案中,ATP:柠檬酸裂解酶ACLl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0022]在一实施方案中,二酰甘油酰基转移酶DGAl具有SEQIDN0:82中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种二酰甘油酰基转移酶DGAl由具有SEQIDN0:80中示出的核苷酸序列的基因组DNA编码。在另一实施方案中,这种二酰甘油酰基转移酶DGAl由具有SEQIDN0:81中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,二酰甘油酰基转移酶DGAl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0023]在一实施方案中,苹果酸酶MAEl具有SEQIDN0:85中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种苹果酸酶MAEl由具有SEQIDN0:83中示出的核苷酸序列的基因组DNA核酸编码。在另一实施方案中,这种苹果酸酶MAEl由具有SEQIDN0:84中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,苹果酸酶MAEl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0024]在另一方面,本发明提供一种真菌宿主,其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少30%的量存在的γ-亚麻酸GLA。在一实施方案中,所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中,所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中,如本文所述,所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶ALD活性。在其他实施方案中,所述真菌宿主的基因组已被修饰以稳定地表达编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的两个或更多个额外基因。这类蛋白的实例为酰基-CoAδ-12去饱和酶、硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶、酰基-CoAS-6去饱和酶、脂肪酸延长酶、乙酰基-CoA羧化酶ACC、ATP:柠檬酸裂解酶ACL、二酰甘油酰基转移酶DGA或苹果酸酶MAE。在一些实施方案中,这类基因的编码序列已被修饰以包含至少55%G和C含量,优选60%-70%G和C含量。在其他实施方案中,至少70%的密码子在第三位置具有C或G。[0025]在一实施方案中,乙酰基-CoA羧化酶ACCl具有SEQIDN0:91中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种乙酰基-CoA羧化酶ACCl由具有SEQIDN0:89中示出的核苷酸序列的基因组DNA核酸编码。在另一实施方案中,这种乙酰基-CoA羧化酶ACCl由具有SEQIDN0:90中示出的核苷酸序列的cDNA核酸编码。在另一实施方案中,乙酰基-CoA羧化酶ACCl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0026]在一实施方案中,酰基-CoAδ-12去饱和酶具有SEQIDNO:5和94中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种酰基-CoAδ-12去饱和酶由具有SEQIDN0:4、92和N0:93中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,酰基-CoAδ-12去饱和酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0027]在一实施方案中,硬脂酰-〇Α-δ-9-去饱和酶具有SEQIDΝ0:8中示出的氨基酸序列。在一实施方案中,这种硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶由具有SEQIDNO:6中示出的核苷酸序列的基因组核酸编码。在另一实施方案中,这种硬脂酰-〇Α-δ-9-去饱和酶由具有SEQIDNO:7中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0028]在一实施方案中,ω-3去饱和酶具有SEQIDNO:10中示出的氨基酸序列。在一实施方案中,这种ω-3去饱和酶由具有SEQIDN0:9中示出的核苷酸序列的核酸编码。在一额外实施方案中,ω-3去饱和酶具有SEQIDNO:12中示出的氨基酸序列。在一实施方案中,后者这种ω-3去饱和酶由具有SEQIDNO:11中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,ω-3去饱和酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0029]在一实施方案中,酰基-CoAδ-6去饱和酶具有SEQIDΝ0:96和98中示出的氨基酸序列,其中DNA编码的序列包含至少55%G和C,优选60%-70%G和C。在其他实施方案中,至少70%的密码子在第三位具有C或G。在一实施方案中,酰基-CoAδ-6去饱和酶由SEQIDNO:95和97中示出的核酸编码。[0030]在一实施方案中,脂肪酸延长酶具有SEQIDNO:101和104中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种脂肪酸延长酶由具有SEQIDN0:99、100、102和103中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,脂肪酸延长酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0031]在一些实施方案中,将本文描述的已稳定并入真菌基因组的基因可操作地连接至允许在红冬孢酵母属和红酵母属的物种中高效表达的启动子。每个并入基因的启动子可以相同或不同。在一些实施方案中,所述启动子是在红冬孢酵母属和红酵母属的物种中发现的启动子。合适的启动子包括但不限于编码以下蛋白的以下基因的启动子:甘油醛3-磷酸脱氢酶GPD、酰基-CoA载体蛋白(ACP、脂肪酸去饱和酶、翻译延伸因子TEF、丙酮酸脱羧酶TOC、烯醇化酶2-磷酸甘油酸脱水酶)(ENO、肽基脯氨酰异构酶PPI、乙酰基-CoA羧化酶ACC或转醛醇酶。在其他实施方案中,本文所述基因还包括mRNA转录终止子,其可以是在任何真核物种和它们的DNA病毒中发现的mRNA转录终止子。[0032]在另一方面,本发明提供一种制备ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸PUFA的方法,所述方法包括使本文所述真菌宿主细胞在适合产生PUFA的条件下生长。可以使用具有至少5%碳源如葡萄糖、甘露糖、甘油、蔗糖的任何培养基。培养基的实例是MinLG培养基,其包含30-10^葡萄糖、1.58酵母提取物、0.58順42304、2.05812册04、1.458腿2?04、0.68]\%304、0.3gNaCl、IOmgCaCl2、ImgFeS〇4、0.5mgZnS〇4、0.5mgCuS〇4、0.5mgH3B〇4、0.5mgMnSCU、0.5mgNaMo〇4每升)。将培养基pH调整至6-7。在25°C_32°C下进行细胞培养。[0033]附图简述[0034]图1A-1E示出本发明中使用的构建体中的T-DNA结构。所有二元载体均具有相同的PPZP200骨架[28]。图IA:pEC3GPD-GUS。图IB:pEC3Pxxx-HPT3。图IC:pRH2034。图ID:pRHDGAl和pRHMAE1。图IE:pRH201。LB:T-DNA的左边界;RB:T-DNA的右边界;Pgpd:Umgpd1的595bp启动子;Pgpdi:RtGPDl的795bp启动子;Pxxx:各种启动子;hpt-3:基于圆红冬孢酵母R.toruloides中的密码子使用偏好的密码子优化的潮霉素抗性基因;GUS:大肠杆菌E.coliβ-葡糖醛酸酶基因;T35s:花椰菜花叶病毒35S基因的终止子;Tnos:根癌农杆菌A.tumefaciens胭脂氨酸合成酶基因的终止子。示出质粒中的独特限制性酶切割位点。[0035]图2A-2C示出本发明中使用的构建体中的T-DNA结构。所有二元载体均具有相同的PPZP200骨架[28]。图2A:pRHEOO1。图2B:pRHE002。图2C:pRHE003。LB:T-DNA的左边界;RB:T-DNA的右边界;Pgpd:Umgpd1的595bp启动子;Pgpdi:RtGPD1的795bp启动子;hpt-3:基于圆红冬孢酵母中的密码子使用偏好的密码子优化的潮霉素抗性基因;T35s:花椰菜花叶病毒35S基因的终止子;Tnos:根癌农杆菌胭脂氨酸合成酶基因的终止子。示出质粒中的独特限制性酶切割位点。[0036]图3A-3C示出本发明中使用的构建体中的T-DNA结构。所有二元载体均具有相同的PPZP200骨架[28]。图3A:pRHE004。图3B:pRHE005。图3C:pRHE006。LB:T-DNA的左边界;RB:T-DNA的右边界;Pgpd:Umgpd1的595bp启动子;Pgpdi:RtGPD1的795bp启动子;hpt-3:基于圆红冬孢酵母中的密码子使用偏好的密码子优化的潮霉素抗性基因;T35s:花椰菜花叶病毒35S基因的终止子;Tnos:根癌农杆菌胭脂氨酸合成酶基因的终止子。示出质粒中的独特限制性酶切割位点。[0037]图4A-4D示出通过正向遗传学鉴定的突变菌株。图4A:WT和针对浅蓝菌素选择的Τ'-DNA突变体RCM中平均ALAC18:3n=9水平的比较。图4B:个体RCM突变体中的相对ALA水平。图4C:WT和针对四氮卩坐紫(tetrazeoliumviolet选择的突变体中脂质积累的比较。图4D:WT和针对荧光染料尼罗红选择的突变体中脂质积累的比较。[0038]图5A-5F示出圆红冬孢酵母中ALD1的反向遗传学研究。图5A:ALD1及其缺失策略的示意图。用于ALDl缺失的同源序列长度为730bp和829bp,在翻译起始密码子的-185至+535和+1948至+2776之间。图5B:Aaldl的DNA印迹分析。将地高辛标记的DNA序列(图5A中标记的ALD1R用作针对用HincII消化的基因组DNA的探针。图5C:在第3和4天WT和Aaldl中的相对脂质收率。图5D:WT和Aaldl中的相对α-亚麻酸ALA收率。**代表通过统计t-检验非常显著的差异P〈〇.01。图5E:WT和Aaldl的干细胞生物量Biomass和ALA含量总脂肪酸的百分比,%TFA。图5F:马铃薯葡萄糖琼脂PDA和YH肉汤中培养的细胞的颜色。[0039]图6示出来自各种担子菌类Basidiomycotous物种的脂肪醛脱氢酶的比对。Ab:双抱蘑^AgaricusbisporusEKM75339.1;SEQIDN0:105;Pc:肉质显丝菌PhanerochaetecarnosaEKM57674.1;SEQIDN0:106;Mg:球形马拉色菌(MalasseziaglobosaXP_001730031.1;SEQIDN0:107;Sr:玉米丝黑糖病菌(SporisoriumreilianumCBQ71609.1;SEQIDNO:108;Um:玉米黑粉菌(UstilagomaydisXP_762570.1;SEQIDN0:109;M1:松杨栅锈菌Melampsoralarici-populinaEGG04055.1;SEQIDN0:110;Pg:Pucciniagraminisf.sp.triticiXP_003338710.1;SEQIDNO:lll;Pt:小麦叶锈菌(PucciniatriticinaXP_003338710.1;SEQIDN0:112;Ps:条锈病菌(Pucciniastriiformis基因组基因座CQM_00777.1;SEQIDN0:113;Mv:花药黑粉菌(Microbotryumviolaceum基因组基因座MVLG_02667.1;SEQIDN0:114;Rg2:R.glutinisATCC204091SEQIDNO:115;Rt3:圆红冬孢酵母NPllEMS18750.1;SEQIDNO:116;Rtl:圆红冬孢酵母ATCC10657SEQIDNO:117。[注意:序列表仅包括SEQIDN0:112、113、115和117的部分序列。参见完整序列的图。][0040]图7A-7F示出DGA1和MAE1在提高脂质积累中的效果。图7A:圆红冬孢酵母ATCC10657中DGAl和MAEl的定量RT-PCR分析。将工程化突变体DGAl和MAEl中的基因表达针对WT菌株中的归一化。图7B:野生型和两个工程化菌株WT、DGA1和MAEl中的相对脂质收率。将脂质量针对WT中的归一化。图7C:上述菌株中的脂肪酸谱。3-天生物过程之后从上述菌株提取细胞内脂质。图7D:上述菌株中不饱和脂肪酸的组成。%TFA代表总脂肪酸的百分比。图7E:DGA1缺失的示意图。图7F:Adgal的DNA印迹分析。将野生型和候选突变体的基因组DNA用HincII消化并针对如图7E中标记的DIG-标记DGAlLDNA片段探测。[0041]图8示出不同圆红冬孢酵母R.glutinis菌株中的脂肪酸谱。Rtl:圆红冬孢酵母ATCC10657;Rt2:圆红冬孢酵母ATCC10788;Rgl:R.glutinisATCC90781;Rg2:R.glutinisATCC204091。如以前所述[21]在脂质积累培养基MinLG中培养圆红冬孢酵母R.glutinis,有一些修改。MinLG培养基包含30g葡萄糖、1.5g酵母提取物、0.5g冊42S〇4、2.05gK2HP〇4、1.45gKH2P〇4、0.6gMgS〇4、0.3gNaClUOmgCaCl2、lmgFeS〇4、0.5mgZnS〇4、0.5mgCuS〇4、0.5mgH3B〇4、0.5mgMnS〇4、0.5mgNaMo〇4每升)。将培养基pH调整至6.1。在28°C下进行细胞培养4天,持续振荡250rpm。[0042]图9A和9B示出高ALA菌株的工程化过程。图9A:野生型和不同去饱和酶工程菌株中的八1^含量。图98:111空菌株仏1116以及包含肚6?01::]\^六12-2和肚6?01:丄沾六03-2基因盒的aldle菌株中的ALA含量。[0043]图10示出ALDl和C-末端截短的ALDlALDln的酶测定。将反应与20mMTris-Cl缓冲液PH8.0、1.5mMNAD+或NADP+、I.OmM十二醛以及10μ1纯化的酶混合。在25°C下进行测定2min〇[0044]图11A-11D示出圆红冬孢酵母ATCC10657中的δ-12去饱和酶基因(RtFAD2的表征。图11A:WT和FAD2敲除菌株fad2Δ的DNA印迹分析。将总DNA用PstI消化,并且利用地高辛标记的FAD2的正确同源PCR片段杂交印迹FAD2R,图11C。图IIB:—式三份进行的WT和fad2△的脂肪酸含量谱。图IID:在补充和未补充LAC18:2的YNB培养基中培养的WT和fad2A的脂肪酸含量谱。[0045]图12A-12D示出圆红冬孢酵母ATCC10657中的ELOl和EL02缺失突变体的表征。elolΔ和el〇2Δ图12A和(图12CelolΔ和el〇2Δ的DNA印迹分析。将总DNA用PvuI消化,并且分别针对地高辛标记的ELOlR和EL02L杂交。(图12B和(图12DelolΔ和el〇2A的脂肪酸含量谱。[0046]图13A-13E示出图14中使用的载体的示意图。图13A:FAD1δ-9-油酸去饱和酶,EL01过量表达构建体。图13B:FAD2S-12去饱和酶过量表达构建体。图13C:ω-3去饱和酶δ-15去饱和酶过量表达构建体。图13D:FAD1和FAD2双基因过量表达载体。图13Ε:FADl、FAD2和ω-3去饱和酶三基因过量表达载体。LB:T-DNA的左边界;RB:T-DNA的右边界;RgGroi:源自RhodotorulagrammisWPl的685bpGPDl启动子;RtGroi:源自圆红冬孢酵母ATCC10657的795bpGPDl启动子;hpt-3:基于圆红冬孢酵母中的密码子使用偏好的密码子优化的潮霉素抗性基因;TSV40:猿猴空泡病毒40大T抗原基因终止子;T35S:花椰菜花叶病毒35S基因的终止子;Tnos:根癌农杆菌胭脂氨酸合成酶基因的终止子;RtENOl:来自圆红冬孢酵母ATCC10657的445bp版本ENOl基因启动子;RtACCl:来自圆红冬孢酵母ATCC10657的ACCl基因启动子的805bp版本;MaFAD2-2是SEQIDN0:4,并且VfFAD3-2是SEQIDN0:ll。[0047]图14:工程化菌株的脂肪酸含量谱。将3个独立的转化体用于每个分析,除了Δaldl-0MA2,对其分析总计18个独立的转化体。将所有转化体在RL2培养基中发酵5天。WT:野生型圆红冬孢酵母ATCC10657菌株;Aaldl-:将构建体转化入ADLl敲除突变体;构建体在图13中示出。0EL1:图13A;MA:图13B;AF3:图13C;0M2:图13D;0MA2:图13E。[0048]图15A-15D示出圆红冬孢酵母ATCC10657中推测的ATP-柠檬酸裂解酶基因RtACLl的表征。图15A:ACL1基因及其缺失策略的示意图。图15B:敲除菌株acllΔ的DNA印迹分析。将总DNA用PvuI消化,并且针对地高辛标记的ACLlL杂交。M:地高辛标记的DNA分子量标记VIIRocheDiagnosis,USA。图15C:ACL1破坏对生物质、脂质收率、脂质含量和残余葡萄糖的影响。图15D:Wt和acll△菌株的脂肪酸含量谱。[0049]发明详述[0050]本发明涉及真菌生物技术领域,更特别是在选自红冬孢酵母属和红酵母属的真菌宿主中产生多不饱和脂肪酸PUFA的遗传工程方法。[0051]除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。[0052]如本文所用,“ALD1”是使用脂肪酸醛作为底物的醛脱氢酶。[0053]如本文所用,“等位基因”是指基因座位的任何一种或多种可选形式,所有所述等位基因均涉及一种性状或特征。在二倍体细胞或生物体中,给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。[0054]如本文中在RNAi的上下文中所用,“dsRNA”或“RNAi分子”是指这样的化合物,其能够下调或减少基因的表达或这样的基因产物的活性至足以达到期望的生物或生理效果的程度。如本文所用,术语“dsRNA”或“RNAi分子”是指dsRNA、siRNA、shRNA、ihpRNA、合成shRNA、miRNA中的一种或多种。[0055]当指主题RNAi方法抑制的基因时,术语“下调”是指在一个或多个RNAi构建体的存在下,与不存在这样的RNAi构建体的水平相比时基因的表达水平降低。术语“下调”在本文中用来表示靶基因表达降低1-100%。例如,表达可以减少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。[0056]关于基因序列,术语“表达”是指基因的转录以及在适当时将所得的mRNA转录物翻译为蛋白。因此,从上下文会清楚,蛋白编码序列的表达导致编码序列的转录和翻译。[0057]如本文所用,“基因”是指涵盖与基因产物表达相关的5'启动子区、任何内含子和外显子区以及与基因产物表达相关的3'或5'非翻译区的核酸序列。[0058]术语“基因沉默”是指基因表达的抑制,例如,转基因、异源基因和或内源基因表达。基因沉默可以通过影响转录的过程和或通过影响转录后机制的过程介导。基因沉默可以是等位基因特异性的,其中发生基因的一个等位基因的特异性沉默。[0059]如本文所用,“基因型”是指细胞或生物体的遗传组成。[0060]当参考核酸部分使用时,术语“异源”或“外源”表示所述核酸包含在自然中互相相同的关系中未发现的两个或更多个子序列。例如,所述核酸通常重组产生,具有来自无关基因的两个或更多个序列排列以产生新的功能核酸,例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区。相似地,异源或外源蛋白表示所述蛋白包含在自然中互相相同的关系中未发现的两个或更多个子序列例如,融合蛋白)。[0061]如本文所用,术语“同系物”是指通过来自共同祖先DNA序列的血统与第二基因相关的基因。术语同系物可以应用于通过物种形成事件分离的基因之间的关系直系同源物)或者通过遗传复制事件分离的基因之间的关系旁系同源物)。术语同系物一般用来指所有物种。[0062]如本文所用,“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征,所述特征是基因表达的表现。[0063]术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可交换地用来指核苷酸的聚合物,其可以是天然或合成的核苷酸和或核苷的线性和顺序阵列,包括脱氧核糖核酸、核糖核酸和它们的衍生物。其包括染色体DNA、自我复制质粒、DNA或RNA的感染性聚合物以及发挥主要结构作用的DNA或RNA。除非另有说明,核酸或多核苷酸以5’至3’方向从左至右书写。通过它们普遍接受的单字母代码引用核苷酸。数字范围包括定义范围的数字。[0064]术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换地用来指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,以及天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸可以通过它们常用的三字母或单字母符号引用。氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左至右书写。数字范围包括定义范围的数字。[0065]如本文所用,“可操作的连接”或“可操作地连接”或“操作性地连接”理解为表示,例如,启动子和待表达的核酸以及其他调节元件如果适当)如终止子的顺序排列为这样的方式,每个调节元件可以履行其在重组表达核酸以产生dsRNA中的功能。这不必要求在化学意义上直接连接。遗传控制序列如增强子序列还可以从距离有些遥远的位置发挥它们对靶序列的功能,或者实际上从其他DNA分子顺式或反式定位)。优选排列是其中待重组表达的核酸序列位于充当启动子的序列下游的排列,从而两个序列互相共价键合。如本领域公知的,调节或控制序列可以位于核苷酸序列的5’侧或核苷酸序列的3M则。[0066]术语“约”或“大约”表示在值的统计学上有意义的范围内。这样的范围可以在一个数量级内,优选在给定值或范围的50%内,更优选在20%内,更优选在10%内,并且甚至更优选在5%内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许偏差取决于研究的具体系统,并且本领域技术人员可以容易地理解。[0067]如本文所用,术语“序列相同性”、“序列相似性”或“同源性”用来描述两个或更多个核苷酸序列之间的序列关系。两个序列之间的“序列相同性”的百分比是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列如提到的SEQIDNO:的全长来确定的,其中为了两个序列的最佳比对,比较窗口中的序列部分与参考序列其不含添加或缺失相比可以包含添加或缺失即,缺口)。百分比这样计算,确定在两个序列中均存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目,匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数目,并且将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。与参考序列相比在每个位置相同的序列据说与参考序列相同,反之亦然。如果第一核苷酸序列表现出与第二或参考序列的完全互补性,则认为第一核苷酸序列在以5’至3’方向观察时是以3’至5’方向观察的第二或参考核苷酸序列的“补体”或与其互补。如本文所用,当5’至3’阅读的序列之一的每个核苷酸与3’至5’阅读时的另一序列的每个核苷酸互补时,则认为核酸序列分子表现出“完全互补性”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列会表现出与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中良好定义的,并且本领域技术人员容易理解。[0068]如本文所用,“比较窗口”或“比较的窗口”是指至少6个连续位置的概念片段,通常约50至约100个,更通常约100至约150个,其中在两个序列最佳比对之后将序列与相同数目连续位置的参考序列比较。为了两个序列的最佳比对,与参考序列(不含添加或缺失相比比较窗口可以包含约20%或更少的添加或缺失(即缺口)。本领域技术人员应当参考用于序列比对的详细方法,如WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,Wisc.,USA〇[0069]在第一方面,本发明提供一种真菌宿主,其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少9%量存在的α-亚麻酸ALA。在一实施方案中,所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中,所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中,所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶ALD活性,所述天然醛脱氢酶ALD使用脂肪酸醛作为底物。所述天然ALD由天然ALD基因编码。在一实施方案中,所述天然ALD基因编码具有SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列的醛脱氢酶ALD。在另一实施方案中,所述天然ALD基因编码具有SEQIDN0:3中示出氨基酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的六〇。在一实施方案中,所述天然ALD基因具有SEQIDNO:1中示出的基因组核苷酸序列。在另一实施方案中,所述天然ALD基因具有SEQIDN0:2中示出的cDNA核苷酸序列。在另一实施方案中,所述天然ALD基因具有这样的核苷酸序列,其具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中示出核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0070]在一些实施方案中,减少的天然ALD活性是由减少的天然ALD基因表达引起的。减少的表达可以由任何遗传或表观遗传机制引起。在一实施方案中,减少的表达是由RNAi机制如siRNA、shRNA、miRNA等引起的。在另一实施方案中,减少的表达是由人工转录阻遏物引起的。在另一实施方案中,减少的表达是由反义机制引起的。在一实施方案中,减少的表达是由有义抑制引起的。在另一实施方案中,减少的活性是由天然基因的突变引起的。在一实施方案中,所述突变可以是导致活性减少的取代、缺失、插入、添加或倒位等。在另一实施方案中,所述突变可以由同源重组引起。在另一实施方案中,所述突变可以由T-DNA或转座子插入引起。[0071]在第二方面,本发明提供一种真菌宿主,其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少49%量存在的α-亚麻酸ALA。在一实施方案中,所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中,所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中,如本文所述,所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶ALD活性。在其他实施方案中,已将所述真菌宿主的基因组修饰以稳定地包括编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的两个或更多个基因。这类蛋白的实例为酰基-CoAδ-12去饱和酶、硬脂酰-〇Α-δ-9_去饱和酶、ω-3去饱和酶、脂肪酸延长酶、乙酰基-CoA羧化酶ACC、ΑΤΡ:柠檬酸裂解酶ACL、二酰甘油酰基转移酶DGA或苹果酸酶MAE。在一些实施方案中,已将这类基因的编码序列修饰以包含至少55%G和C含量,优选60%-70%G和C含量。在其他实施方案中,至少70%的密码子在第三位具有C或G。[0072]在一实施方案中,ATP:柠檬酸裂解酶ACL具有SEQIDN0:88中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种ATP:柠檬酸裂解酶ACLl由具有SEQIDN0:86中示出的核苷酸序列的基因组DNA核酸编码。在另一实施方案中,这种ATP:柠檬酸裂解酶ACLl由具有SEQIDN0:87中示出的核苷酸序列的cDNA核酸编码。在另一实施方案中,ATP:柠檬酸裂解酶ACLl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0073]在一实施方案中,二酰甘油酰基转移酶DGAl具有SEQIDN0:82中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种二酰甘油酰基转移酶DGAl由具有SEQIDN0:80中示出的核苷酸序列的基因组DNA编码。在另一实施方案中,这种二酰甘油酰基转移酶DGAl由具有SEQIDN0:81中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,二酰甘油酰基转移酶DGAl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0074]在一实施方案中,苹果酸酶MAEl具有SEQIDN0:85中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种苹果酸酶MAEl由具有SEQIDN0:83中示出的核苷酸序列的基因组DNA核酸编码。在另一实施方案中,这种苹果酸酶MAEl由具有SEQIDN0:84中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,苹果酸酶MAEl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0075]在另一方面,本发明提供一种真菌宿主,其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少30%量存在的γ-亚麻酸GLA。在一实施方案中,所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中,所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中,如本文所述,所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶ALD活性。在其他实施方案中,已将所述真菌宿主的基因组修饰以稳定地表达编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的两个或更多个额外基因。这类蛋白的实例为酰基-CoAδ-12去饱和酶、硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶、酰基-CoAS-6去饱和酶、脂肪酸延长酶、乙酰基-CoA羧化酶ACC、ΑΤΡ:柠檬酸裂解酶ACL、二酰甘油酰基转移酶DGA或苹果酸酶ME。在一些实施方案中,这类基因的编码序列包含至少55%G和C含量,优选60%-70%G和C含量。在其他实施方案中,至少70%的密码子在第三位具有C或G。[0076]在一实施方案中,乙酰基-CoA羧化酶ACC具有SEQIDN0:91中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种乙酰基-CoA羧化酶ACCl由具有SEQIDN0:89中示出的核苷酸序列的基因组DNA核酸编码。在另一实施方案中,这种乙酰基-CoA羧化酶ACCl由具有SEQIDN:90中示出的核苷酸序列的cDNA核酸编码。在另一实施方案中,乙酰基-CoA羧化酶ACCl基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0077]在一实施方案中,酰基-CoAδ-12去饱和酶具有SEQIDNO:5和94中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种酰基-CoAδ-12去饱和酶由具有SEQIDN0:4、92和N0:93中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,酰基-CoAδ-12去饱和酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0078]在一实施方案中,硬脂酰-〇Α-δ-9-去饱和酶具有SEQIDΝ0:8中示出的氨基酸序列。在一实施方案中,这种硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶由具有SEQIDNO:6中示出的核苷酸序列的基因组核酸编码。在另一实施方案中,这种硬脂酰-〇Α-δ-9-去饱和酶由具有SEQIDNO:7中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0079]在一实施方案中,ω-3去饱和酶具有SEQIDNO:10中示出的氨基酸序列。在一实施方案中,这种ω-3去饱和酶由具有SEQIDN0:9中示出的核苷酸序列的核酸编码。在一额外实施方案中,ω-3去饱和酶具有SEQIDNO:12中示出的氨基酸序列。在一实施方案中,后者这种ω-3去饱和酶由具有SEQIDNO:11中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,ω-3去饱和酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0080]在一实施方案中,酰基-CoAδ-6去饱和酶具有SEQIDΝ0:96和98中示出的氨基酸序列,其中DNA编码的序列包含至少55%G和C,优选60%-70%G和C。在其他实施方案中,至少70%的密码子在第三位具有C或G。在一实施方案中,酰基-CoAδ-6去饱和酶由SEQIDNO:95和97中示出的核酸编码。[0081]在一实施方案中,脂肪酸延长酶具有SEQIDNO:101和104中示出的氨基酸序列。在另一实施方案中,这种脂肪酸延长酶由具有SEQIDN0:99、100、102和103中示出的核苷酸序列的核酸编码。在另一实施方案中,脂肪酸延长酶基因具有这样的核苷酸序列,其具有本文所述核苷酸序列的75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。[0082]在一些实施方案中,将本文描述的已稳定并入真菌基因组的基因可操作地连接至允许在红冬孢酵母属和红酵母属的物种中高效表达的启动子。每个并入基因的启动子可以相同或不同。在一些实施方案中,所述启动子是在红冬孢酵母属和红酵母属的物种中发现的启动子。合适的启动子包括但不限于编码以下蛋白的以下基因的启动子:甘油醛3-磷酸脱氢酶GPD、酰基-CoA载体蛋白(ACP、脂肪酸去饱和酶、翻译延伸因子TEF、丙酮酸脱羧酶TOC、烯醇化酶2-磷酸甘油酸脱水酶)(ENO、肽基脯氨酰异构酶PPI、乙酰基-CoA羧化酶ACC或转醛醇酶。在其他实施方案中,本文所述基因还包括mRNA转录终止子,其可以是在任何真核物种和它们的DNA病毒中发现的mRNA转录终止子。[0083]在另一方面,本发明提供一种制备ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸PUFA的方法,所述方法包括使本文所述真菌宿主细胞在适合产生PUFA的条件下生长。可以使用具有至少5%碳源如葡萄糖、甘露糖、甘油、蔗糖的任何培养基。培养基的实例是MinLG培养基,其包含30-10^葡萄糖、1.58酵母提取物、0.58順42304、2.05812册04、1.458腿2?04、0.68]\%304、0.3gNaCl、IOmgCaCl2、ImgFeS〇4、0.5mgZnS〇4、0.5mgCuS〇4、0.5mgH3B〇4、0.5mgMnSCU、0.5mgNaMo〇4每升)。将培养基pH调整至6-7。在25°C_32°C下进行细胞培养。[0084]在一些实施方案中,将本文描述的已稳定并入真菌基因组的基因可操作地连接至允许在红冬孢酵母属和红酵母属的物种中高效表达的启动子。每个并入基因的启动子可以相同或不同。在一些实施方案中,所述启动子是在红冬孢酵母属和红酵母属的物种中发现的启动子。在其他实施方案中,所述启动子是在其他真菌物种中发现的启动子。合适的启动子包括但不限于编码以下蛋白的以下基因的启动子:甘油醛3-磷酸脱氢酶GPD、酰基-CoA载体蛋白(ACP、脂肪酸去饱和酶、翻译延伸因子TEF、丙酮酸脱羧酶PDC、烯醇化酶2-磷酸甘油酸脱水酶)(ENO、肽基脯氨酰异构酶PPI、乙酰基-CoA羧化酶ACC或转醛醇酶。在其他实施方案中,本文所述基因还包括mRNA转录终止子,其可以是在任何真核物种和它们的DNA病毒中发现的mRNA转录终止子。[0085]在一些实施方案中,合适的启动子是国际专利申请公开号W02012169969中描述的启动子,其整体援引加入本文。这个公开申请描述了源自在真菌中充当启动子的甘油醛磷酸脱氢酶基因Groi、翻译起始因子基因(TEFl和硬脂酰-〇Α-δ9-去饱和酶基因(FADl的上游区的几个多核苷酸序列。这个公开申请中描述的启动子在SEQIDΝ0:55-62中示出。在其他实施方案中,额外的启动子描述于2014年3月10日提交的国际专利申请号PCTSG2014000114中,其整体援引加入本文。在一实施方案中,启动子序列包含SEQIDΝ0:63-79中任一个中示出的序列。在另一实施方案中,多核苷酸启动子序列包含SEQIDΝ0:63-79中任一个的启动子序列,即,没有克隆位点的序列。[0086]此外,本文所述启动子序列的可操作片段可以利用常规启动子筛选测定分离,并且可以筛选用于利用本文所述技术高效选择转化的真菌细胞。在一实施方案中,可操作片段长度在本文中也称作启动子部分为约400个碱基对至长达约1100个碱基对,从ATG密码子的-1位开始。如本文所用,“长达”是指公开的SEQIDNO中示出的启动子的启动子部分的长度。因此,“长达”是指启动子序列的最大长度少于公开的SEQIDNO的启动子的1100个核苷酸。[0087]在一实施方案中,提供启动子序列,其与这些启动子序列中的任一个具有至少60%相同性。在另一实施方案中,提供启动子序列,其与这些启动子序列中的任一个具有至少70%相同性。在一额外实施方案中,提供启动子序列,其与这些启动子序列中的任一个具有至少80%相同性。在另一实施方案中,提供启动子序列,其与这些启动子序列中的任一个具有至少90%相同性。在另一实施方案中,提供启动子序列,其与这些启动子序列中的任一个具有至少95%相同性。在另一实施方案中,提供启动子序列,其与这些启动子序列中的任一个具有至少98%相同性。[0088]待稳定并入真菌基因组的基因通常为DNA或多核苷酸构建体形式,其包含本文描述的启动子序列、本文描述的可操作连接的多肽编码序列和可操作连接的RNA转录终止子序列。在一实施方案中,可以使用在真菌物种中可操作的任何转录终止子。终止子通常位于基因的下游3’),在终止密码子TGA、TAG或TAA之后。终止子在RNA的加工和稳定性以及翻译中起到重要作用。大多数但不是全部终止子包含多腺苷酸化序列或切割位点。具体多腺苷酸化序列的实例为AAUAAA或AAUAAU。这些序列已知为近上游元件NUENagayaetal.,2010AUE通常距离已知为远上游元件(FUE的GU-富含区约30bpMogenetal·,1990;Mogenetal.,1992;Rothnieetal.1994TUE增强在多腺苷酸化序列或切割位点处加工,其通常是U-富含区中的CA或UABassett,2007。在终止子内,元件实际上增加转录RNA的稳定性(Ohme-Takagietal.,1993;Newmanetal.,1993;Guti6rrezetal.,1999,并且还可以控制基因表达(1即6113代3111:,1989;六116七31.,1989。[0089]包含真菌可操作启动子、蛋白编码DNA序列和真菌可操作终止子的DNA或核酸构建体在本文中还可以称作表达盒。表达盒可以包括本领域公知的其他转录调节区。在其他实施方案中,DNA或核酸构建体或表达盒进一步包含选择标记。选择标记是技术人员公知的,表达盒并入这类选择标记和启动子以驱动它们的表达,如国际专利申请公开号WO2012169969所述。在本发明中可以使用可操作地连接至任何合适的选择标记的任何合适的启动子。[0090]在一实施方案中,选择标记的编码序列是天然存在或人工产生的编码序列,并且包含至少约60%GC。在第二实施方案中,选择标记的编码序列是天然存在或人工产生的编码序列,并且包含约70%GC。在第三实施方案中,选择标记的编码序列是天然存在或人工产生的编码序列,并且包含约75%GC。在一实施方案中,这类编码序列的至少约70%的三联密码子以C或G结束。在另一实施方案中,这类编码序列的超过约80%的三联密码子以C或G结束。在一实施方案中,选择标记的编码序列是至少60%GC,优选约70%GC,并且最优选约75%GC,其中至少70%的三联密码子以C或G结束,优选超过80%的三联密码子以C或G结束。在一实施方案中,这类编码序列在总丝氨酸Ser残基的至少约40%中包含UCG密码子。[0091]在一些实施方案中,选择标记是重组无标记系统的部分。在一实施方案中,不含重组标记系统是Cre-Iox重组无标记系统,如Zuo等人描述的[29]。这样的系统可用于产生无选择标记的转基因植物,包括转基因麻风树植物。在一些实施方案中,重组无标记系统位于植物可操作启动子以及一个或多个核酸片段之间。在这个实施方案中,如本文所述,通过重组事件去除标记基因将植物可操作启动子置于与一个或多个核酸片段的可操作连接中。[0092]在制备核酸构建体或表达盒中,可以操纵各种DNA片段,以便提供正确方向和(如果合适在正确阅读框中的DNA序列。为此,衔接物或接头可以用来连接DNA片段,或者可以包括其他操纵以提供方便的限制性位点,去除多余的DNA,去除限制性位点等。为了这个目的,可以包括体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、重新取代,例如转换和颠换。[0093]本发明的核酸还可以通过本领域已知的方法完全或部分合成,特别是如果期望提供植物偏好序列。因此,可以利用所选宿主偏好的密码子合成本发明的全部或部分核酸。例如,从特定宿主物种中表达的蛋白中最常使用的密码子可以确定物种偏好的密码子。核苷酸序列的其他修饰可能导致具有略微改变的活性的突变体。[0094]用任何重组构建体产生许多单独转化的真菌可能是有用的,以便回收无任何位置效应的真菌。选择包含一个以上拷贝的引入的多核苷酸构建体也可能是优选的,从而获得重组分子的高水平表达。[0095]如果在特定物种中是可能的,产生对于特定基因是纯合的真菌系可能是可取的。在一些物种中,这通过使用单孢子培养完成。通过使用这些技术,可以产生携带插入基因的单倍体系,然后自发或通过使用秋水仙碱加倍染色体数目。这产生对于插入基因是纯合的真菌,如果插入基因携带合适的选择标记用于检测携带该基因的真菌,这可以容易地测定。或者,真菌可以是自体受精的,导致产生孢子的混合物,在最简单的情况下,所述孢子的混合物由3种类型组成,对于插入基因纯合25%、杂合50%和空(25%虽然相对容易鉴别空真菌与那些包含基因的真菌,但是实际上可能通过DNA印迹分析鉴别纯合与杂合真菌,其中注意装载完全等量的来自混合群体DNA,并且通过来自插入基因特异性探针的信号强度鉴别杂合子。通过允许每个独立转化体自体受精来验证DNA印迹分析的结果是可取的,因为纯合性的额外证据可以通过这样的简单事实获得,如果真菌对于插入基因是纯合的,则来自自交个体的所有随后的真菌系均包含所述基因,而如果真菌对于所述基因是杂合的,则生长自自交种子的世代会包含空真菌系。因此,用简单的自交,可以选择纯合真菌系,其还可以通过DNA印迹分析证实。[0096]产生纯合亲本系使得可能产生包含修饰的蛋白组分的杂交真菌和孢子。维持转基因纯合亲本系,每个亲本包含可操作地连接至启动子的第一或第二重组DNA序列。种植杂交作物的优势也并入这个方案,包括更多有价值的性状和杂种优势的结合。[0097]除非另有说明,本发明的实施采用本领域技术内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。参见,例如,Maniatisetal.,1982,MolecularCloningColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,2ndEd.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;SambrookandRussell,2001,MolecularCloning,3rdEd.ColdSpringHarborLaboratoryPressjColdSpringHarbor,NewYork;GreenandSambrookj2012,MolecularCloning,4thEd.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Ausubeletal·,1992,CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySons,includingperiodicupdates;Glover,1985,DNACloningIRLPress,Oxford;Russell,1984,MoIecuIarbiologyofplants:alaboratorycoursemanualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborjN.Y.;AnandjTechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes,(AcademicPress,NewYork,1992;GuthrieandFinkjGuidetoYeastGeneticsandMolecularBiologyAcademicPress,NewYork,1991;HarlowandLane,1988,Antibodies,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborjNewYork;NucleicAcidHybridizationB.D.HamesS.J.Higginseds·1984;TranscriptionAndTranslationB.D.HamesS.J.Higginseds.1984;CultureOfAnimalCellsR.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987;ImmobilizedCellsAndEnzymesIRLPress,1986;B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning1984;thetreatise,MethodsInEnzymologyAcademicPress,Inc·,Ν·Υ·;MethodsInEnzymologyjVols.154and155Wuetal·eds·,ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiologyMayerandWalker,eds·,AcademicPress,London,1987;HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IVD.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.,1986;Riott,EssentialImmunology,6thEdition,BlackwelIScientificPubIications,Oxford,1988;Fireetal.,RNAInterferenceTechnology:FromBasicSciencetoDrugDevelopment,CambridgeUniversityPress,Cambridge,2005;Schepers1RNAInterferenceinPractice,ffiley-VCH,2005;Engelke,RNAInterferenceRNAi:TheNutsBoltsofsiRNATechnology1DNAPress,2003;Gott,RNAInterference,Editing,andModification:MethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiology,HumanPress,Totowa,NJ,2004;Sohail,GeneSilencingbyRNAInterference:TechnologyandApplication,CRC,2004。实施例[0098]参考以下实施例描述本发明,所述实施例通过说明的方式提供而不是为了以任何方式限制本发明。利用本领域公知的标准技术或下文特别描述的技术。[0099]实施例1[0100]菌株、化学品、培养基和培养条件[0101]圆红冬孢酵母菌株ATCC10657和ATCC10788;R.glutinis菌株ATCC90781和R.glutinisATCC204091购自ATCCUSAaR.graminis菌株WPl和掷孢酵母SporobolomycesroseusFGSC10293IAM13481获得自FungalGeneticsStockCenterUniversityofMissouri,USA。根癌农杆菌菌株AGL1[30]用于根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaceins介导的转化(ATMT。潮霉素B购自RocheDiagnosticsUSA。尼龙N和N+膜(Φ82ηιηι,0·45μηι获得自GEHealthcareUppsala,Sweden。浅蓝菌素Sigma-AIdrich,USA制备为DMSO中5mgm1储备溶液。除非另有说明,其他化学品均购自Sigma-Aldrich0[0102]在28°C下于YPD肉汤(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)中或于固体马铃薯-葡萄糖琼脂PDA上维持红冬孢酵母属菌株。使根癌农杆菌在28°C下于液体或固体2YT培养基(1.6%胰蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%NaCl中生长。如以前所述[21]在30°C和持续振荡(200rpm下于脂质积累培养基中培养圆红冬孢酵母,有一些修改。MinLG培养基包含每升)3^葡萄糖、1.58酵母提取物、0.58順42304、2.05812册04、1.458诎屮04、0.68]\%304、0.3gNaCl、IOmgCaCl2、ImgFeS〇4、0.5mgZnS〇4、0.5mgCuS〇4、0.5mgH3B〇4、0.5mgMnSCU、0.5mgNaMoO4pH6。为了分析基因表达,使用氮限制变体MinLG-N,其改进自MinLG,将酵母提取物和硫酸铵的浓度分别减少至〇.3和0.lgΙ。在30°C和持续振荡(200rpm下进行脂质积累过程。[0103]实施例2[0104]DNA构建体[0105]使用的寡核苷酸在表1中列出。所有限制性和修饰酶均购自NewEnglandBiolabsNEB,Massachusetts,USA。二元载体pEX2是用于利用潮霉素B显性选择的pPZP200衍生物[22]。[0106]表1寡核苷酸的序列[0110]以前已描述了各种启动子,如玉米黑粉菌(U.maydisgpdlPgpd,长度为595bp[31,32]、构巢曲霉AspergillusnidulansgpdAPgpdA,884bp[33]、棉阿舒囊霉Ashbyagossypii翻译延伸因子Ia基因(Ptef,348bp[34]和RtGPDl1429bp[22]。利用质粒DNA作为模板并且分别利用Pgpd、PgpdA、Ptef和PRtGPDl的引物对Pgpd-SfPgpd-Nr、PgpdA-SfPgpdA-Nr、Ptef-SfPtef-Nr和RtO11SRtO12N通过PCR获得启动子DNA片段。将所得的PCR片段用SpeI和NcoI消化并单独用于与1030bpBspHISmal消化的合成hpt-3片段[22]和8855bpSpelSacI平端)消化的载体pEC3GPD-GUS图1连接,以便分别产生pEC3GPD-HPT3、pEC3GPDA-HPT3、pEC3TEF-HPT3和pEC3GPDR-HPT3图1。[0111]为了产生ALD1和DGA1的敲除突变体,利用圆红冬孢酵母ATCC10657的总DNA作为模板并且分别利用寡核苷酸对ALDlLfALDIRr和Rtll3Rtll4作为引物扩增完整或部分编码序列(分别为ALDl和DGAl的3kb和2.8kb。在dNTP的存在下用T4DNA聚合酶处理之后将平端PCR产物连接至PmelSacI双消化的pEX2载体以产生中间质粒pEX2ALDl和pEX2DGAl,将扩增自质粒pRH2031的平端潮霉素抗性盒PGpD1::hpt-3::Tnos分别插入中间质粒pEX2ALDl和PEX2DGA1的XhoIBspHI和SmalSpel位点以产生基因靶向载体pKOALDl和pKODGAl。[0112]分别利用圆红冬孢酵母ATCC10657和R.glutinisATCC204091的cDNA模板扩增二酰甘油酰基-转移酶基因DGAlGenBank登录号AB453835和线粒体苹果酸酶基因MAEl粘红酵母ATCC204091基因组支架GL989657中的基因座标签RTG_03106。引物对Rt055NRt056Ev和Rt057NRt058Ev分别用于DGAl和MAEl的扩增。将PCR产物用NcoI和EcoRV消化,与NcoIEcoRV双消化的pRH2034连接,pRH2034包含蛋白表达盒,所述蛋白表达盒包含795bpRtGPDl启动子和花椰菜花叶病毒35S基因终止子和Cre-重组酶可切割的Umgpd::HPT-3:nos潮霉素选择盒[22]以产生pRHDGAl和pRHMAEl图1。[0113]为了α-亚麻酸中的工程化研究,根据圆红冬孢酵母的密码子偏好合成密码子优化的编码高山被孢霉(MortierellaalpineΔ12去饱和酶MaFAD2SEQIDΝ0:5、亚麻Linumusitatissimumω-3去饱和酶LuFAD3GenBank登录号ABA02173.1;SEQIDΝ0:10和油桐(Verniciafordii也称作Aleuritesfordiiω-3去饱和酶VfFAD3SEQIDNO:12的基因,产生合成基因MaFAD2-2SEQIDN0:4、LuFAD3-2SEQIDN0:9和VfFAD3-2SEQIDN0:11,将它们分别插入RtGPDl启动子调节下的pRH2034以产生pRHE001、pRHE002和PRHE003图2。为了产生FAD2-FAD3双基因过量表达盒,利用oligoRt012Sf35T-Pmr分别从质粒PRHE002和pRHE003扩增VfFAD3-2和LuFAD3-2盒,用SpeI平端)和PmeI消化并与Pmel-cutpRHEOOl连接以产生质粒pRHE004和pRHE005图3。相似地,从pRHMAEl扩增MAEl盒,消化SpeI-PmeI,平端化,随后与Pmel-cutpRHDGAl连接以产生质粒pRHE006图3。[0114]实施例3[0115]根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens介导的转化[0116]将二元载体电穿孔入根癌农杆菌461^12.51^,25以?,400〇,随后用补充了链霉素lOOygml的2YT琼脂培养基进行选择。除非另有说明,如以前所述进行通过ATMT的真菌转化[22]。[0117]实施例4[0118]DNA印迹分析[0119]如以前所述提取圆红冬孢酵母的基因组DNA[22]。将基因组DNA用PstI消化并通过在0.8%琼脂糖凝胶上电泳来分离,并且利用寡核苷酸HptRU和HptRSL2扩增DIG标记的部分hpt-3基因片段nt375-1036的探针。为了基因缺失分析,将推定的敲除突变体Aaldl和Adgal的基因组DNA分别用HincII、PstI和HincII消化。分别利用oligoRtl48Rtl49和Rtll3Dgal-1扩增ALDl和DGAl的约0.6kb上游侧翼序列的DIG标记的探针。根据制造商的说明书(DIG-HighprimeDNA标记和检测启动试剂盒I,RocheDiagnostics进行Southern杂交。[0120]实施例5[0121]定量逆转录PCRq-RT-PCR[0122]如以前所述提取圆红冬孢酵母的总RNA[22]。为了去除污染DNA的痕迹,将RNA样品用DNaseIRocheDiagnostics,USA处理,然后用乙醇沉淀。利用Improm-II逆转录系统Promega,USA合成cDNA,并且利用PlatinumSYBR-GreenqPCRSuperMixInvitrogen,USA在iCycler™实时PCR机器Bi〇-Rad,USA中进行实时PCR。实时条件如下:初始95°C变性步骤2min,然后在95°C下变性15s、在58°C下退火15s和在72°C下15s的延伸步骤的35个循环。利用iCycler™软件Bio-Rad获得数据。RtGroimRNA的表达水平用作靶基因表达归一化的参考。[0123]实施例6[0124]T-DNA标记位置的鉴定[0125]利用高效热不对称InterLacedPCRhiTAIL-PCR鉴定基因组中的T-DNA标记位置[35,36]。特异性引物HRSP1、HRSP2和HRSP3和随机引物LAD1-4用于T-DNA左边界LB侧翼序列,而特异性引物HRRSP1、HRRSP2和HRRSP3和随机引物LAD1-4用于右边界RB侧翼序列。在PTC-200™可编程热控制器(Bio-Rad,USA中用i-TaqDNA聚合酶(i-DNA,Singapore进行PCR反应。利用凝胶提取试剂盒(Qiagen纯化PCR产物,并且利用BigDye终端试剂盒AppliedBiosystems,USA用oligoHRRSP3用于RB或HRSP3LB直接测序。在某些情况下,将PCR产物克隆在pGTM-Teasy载体Promega,USA中,并且利用oligoM13FP和M13RP作为引物测序。[0126]实施例7[0127]脂质积累突变体的筛选[0128]通过随机插入pRH201的T-DNA将圆红冬孢酵母ATCC90781基因组诱变。在补充了300ygml头孢噻B、150ygml潮霉素以及50ygml浅蓝菌素、lOygml四氮唑紫或0.5ygml尼罗红Sigma,USA的YH琼脂培养基上选择转化体。在28°C下温育5天之后,将表现出较大大小针对浅蓝菌素选择)、较深紫色色素沉着针对四氮唑紫选择或较高荧光强度在尼罗红中选择的转化体转移至液体Yro培养基300ygml头孢噻肟、150ygml潮霉素)用于增殖。在补充了上述抗生素的PDA平板上划线之后,将单克隆用于利用50ml培养物二次筛选以验证预期的表型。[0129]实施例8[0130]通过尼罗红染色比较脂质积累水平[0131]如以前所述进行脂质含量快速估计的尼罗红染色[37],有一些修改。简单地说,将10μ1细胞培养物和2μ1尼罗红储备溶液(丙酮中50mM与200μ1PBS缓冲液(pH7.4在FluoroNunc平板(ThermoFisherScientific,Langenselbold,Germany的孔中混合。每个样品伴有不含尼罗红的孔作为背景对照。将另一部分的细胞培养物(1〇μ1装载至96-孔平底透明平板Nunc,Roskilde,Denmark中的90μ1PBS缓冲液ρΗ7.4以测量细胞光密度。利用InfiniteΜ200酶标仪(Tecan,Salzburg,Austria利用iControl™3.0版本软件(Tecan,Salzburg,Austria获得并分析数据。在推断背景对照之后在600nm下读取细胞光密度,同时分别用488nm和508nm的激发和发射波长测量荧光强度。通过在减去背景对照之后针对600nm下的吸收比归一化来计算相对脂质含量。在所有测试中,包括生物重复和统计学重复一式三份。[0132]实施例9[0133]通过GCMS的脂肪酸分析[0134]如以前所述提取总脂质[38],有一些修改。将细胞培养物(Iml沉淀并用500μ1月旨质提取溶剂(氯仿:甲醇=2:1重悬。添加IOOyg玻璃珠(直径1mm,Sigma-Aldrich,Missouri,USA之后,向混合物施加剧烈涡旋IOmin并用移液器去除溶剂相。如以前所述进行脂肪酸甲基酯FAME的制备和气液色谱GC分析[39],有一些修改。将脂质旋转蒸发至几乎干燥Concentrator,Eppendorf.USA,溶于具有5%volvolH2SO4的Iml甲醇中,并且在密封的玻璃瓶中于90°C下温育2hr。添加Iml水中的PBS之后用300μ1正己烷提取脂肪酸甲基酯。将Ιμΐ的己烷提取物注射至气相色谱质谱GCMSQP2010,Shimadzu,Japan中的DB-WAX熔融石英毛细管柱(30-m长度、0·25-μπι直径和0.25-mm膜厚度)(AgilentJWScientific,Folsom,CA,USA上。运行条件通常为42.3mlmin氮流,起始温度180°C3min,15-min渐变至240°C,并且维持在240°C下7min。通过对ShimadzuNIST08化合物文库搜索鉴定脂肪酸甲基酯峰,并且定量为总脂肪酸的百分比(%TFA。[0135]实施例10[0136]通过直接筛选圆红冬孢酵母T-DNA插入文库鉴定ALDl[0137]已知T-DNA主要作为单拷贝整合入核基因组,并且这个特征已作为植物和真菌中的诱变工具广泛利用[32,40-43]。为了研究是否可以通过直接筛选T-DNA突变体文库鉴定调节油收率或质量的新基因,我们设计了三个独立的筛选策略,旨在利用药物或荧光染料的辅助鉴定T-DNA突变体中脂肪酸谱或含量的变化。[0138]浅蓝菌素(2S3R2,3-环氧基-4-氧代-7,10-十二碳二烯酰胺是分离自Cephalosporiumcaerulens的培养肉汤的药物[44,45],并且已成功用于提高细胞内多不饱和脂肪酸的积累[46]或产油微生物中的脂质含量[47,48]。由于其阻断脂肪酸生物合成的能力用作杀真菌剂,预期在这个处理中存活的突变体具有较高水平的脂质或多不饱和脂肪酸。我们针对YPD琼脂培养基中50ygml浅蓝菌素筛选了〜10,000个转化体,并且发现12个突变体看来对浅蓝菌素更耐受。我们将这些推定的红冬孢酵母属浅蓝菌素突变体分别命名为RCMl至RCM12。虽然发现在小规模液体培养物中脂质含量与Wt有点不同,但是RCM表现出显著较高水平的α-亚麻酸ALA图4。值得注意的是,RCM6产生比WT高3-倍以上水平的ALA图4Β。[0139]其次,尼罗红NR已广泛用作脂质的荧光示踪剂[50]。通过筛选〜10,000个T-DNA突变体,我们鉴定了看来表现出较强红色荧光的4个候选,将它们命名为RNMl-4用于红冬孢酵母属尼罗红突变体)。脂质收率的定量显示与WT相比在R匪突变体中显著提高(图4D。但是,可以观察到脂肪酸组成差异很小数据未示出)。[0140]相似地,将用作脂质积累的染料指示剂[51]或微生物生长的氧化还原指示剂[52]的四氮唑紫用作指示剂以筛选〜3,000个转化体,导致鉴定了6个较深着色的突变体(图4C。但是,脂肪酸谱的重复分析不能验证脂肪酸积累的改变数据未示出)。[0141]通过Hi-TAILPCR技术鉴定上述突变体中的T-DNA标记位置,并且结果显示成功获得并测序了12个RCM中的11个、4个RNM中的2个和6个RTM中的6个。受到影响的基因主要参与细胞壁整合的维持,脂质代谢,信号转导,蛋白折叠和运输,次级代谢物、氨基酸、维生素、辅因子等的代谢表2。[0142]表2[0143]圆红冬孢酵母浅蓝菌素突变体RCM、圆红冬孢酵母四唑紫突变体RTM、圆红冬孢酵母尼罗红突变体RNM和圆红冬孢酵母白化突变体RAM的T-DNA标记位置[0147]aLB-侧翼序列[0148]b根据BLASTx结果确定T-DNA标记的基因[0149]。上游l.Okb、上游0.5kb和下游0.3kb分别表示相应标记基因的上游501〜lOOObp、500bp和下游300bp内的T-DNA插入[0150]d最佳命中表示具有最高E-评分的BLASTx结果[0151]e根据BLASTx结果确定注释[0152]f微生物表示最佳命中的宿主[0153]g相同性值来自BLASTx结果[0154]h由于坏的测序结果不可用[0155]实施例11[0156]T-DNA标记突变体RCM6的表征[0157]为了进一步研究通过上述正向遗传学筛选的突变体,并且作为原理验证,进行反向遗传学分别用于突变体RCM6和RAM5中对脂质积累和类胡萝卜素生物合成的潜在调节作用的研究。[0158]同源分析显示RCM6中的T-DNA整合在400th重叠群(contig的72542-72543nt内GenBank登录号AEVR01000400J-DNA标记位置相邻序列的BLASTx显示推定的包含醛脱氢酶结构域的蛋白被RCM6中的T-DNA整合破坏(图6A。靶蛋白位于推定的噻唑生物合成酶EGUl1956和候选二肽基氨基肽酶(EGUl1957之间,显示与来自其他真菌物种如StreptomycessviceusEDY60340·I,E_值=2E_68和分枝杆菌属(Mycobacteriumsp·YP_936108,E-值=3E-66等的醛氢化酶高度同源。因此,被T-DNA破坏的推定的醛氢化酶命名为ALDl编码基因会导致RCM6的表型。RT-PCR和快速扩增cDNA末端RACE的进一步分析显示ALDl基因跨越重叠群#400中的2461bp,包含10内含子分开的11个外显子(图5A。其5’UTR长度为18nt,然后是一段短的富含CT的基序CT盒,数据未示出)^RNA剪接严格遵守经典的⑶-AG规则,其产生长度为1506-nt的mRNA,编码501-aa蛋白,具有严格保守的NAD-结合指纹基序Gly-X-Gly-X-X-GlySEQIDNO:53GSGTVG,aa193-198;SEQIDNO:54、腺苷核糖NAD-结合氨基酸E148和催化中心CysC249图6。在RCM6中,T-DNA整合入从ALDl的起始密码子第2097和第2098核苷酸之间的位置,破坏第9外显子,导致缺失形成部分RYPP基序的C-端58aa图6。[0159]为了进一步证实在脂质积累中的功能,通过同源重组在ATMT的辅助下缺失ALDl。用潮霉素抗性盒Pgpdi::hpt-3::Tnos,图5A置换范围为+536至+1947的ALDl中的核苷酸序列,并且通过DNA印迹分析验证正确的aid1空突变体(图5B。当在液体肉汤中或在琼脂培养基上培养时,与Wt中粉色着色的颜色相比,Aaldl表现出橙色着色的颜色(图5E。Aaldl在脂质积累培养基中生长比WT略慢,但是当培养基中的碳源在第4天耗尽时其产生相似的生物质(图5E。在葡萄糖耗尽之前第3天),△aldl突变体在脂质收率中表现与WT差异很少。当葡萄糖耗尽时,脂质水平在两个菌株中均降低,但是,脂质含量在Aaldl突变体中显著较高(图5C和5D。惊人的是,几乎一半的ALA在WT中降解,而在Aaldl突变体中发现很少降解图5F。这些结果与T-DNA标记突变体RCM6的结果一致图4B。[0160]实施例12[0161]通过合理设计提高圆红冬孢酵母中的总TAG积累[0162]三酰甘油TAG是大多数真核细胞中存在的主要中性脂质,并且生物合成途径是高度保守的[53]。通过合理设计的代谢工程在提高脂质含量和生产率中已非常成功[54-56]。在圆红冬孢酵母中,可获得二酰甘油乙酰转移酶Dgal和苹果酸酶MAEl的序列信息分别参见例如SEQIDN0:81和SEQIDN0:84。构建两个基因的过量表达盒,通过795-bpRtGPD1启动子Pgpd1::DGAl和Pgpd1::ME1驱动,图ID,通过根癌农杆菌介导的转化将其整合入圆红冬孢酵母ATCC10657的染色体。定量RT-PCR分析显示两个基因的mRNA转录物水平在3-天生物过程中显著增强(图7A,导致DGAl和MAEl过量表达菌株比Wt菌株分别提高2.3和1.8-倍的峰脂质收率(图7B。在两个菌株中脂肪酸谱未显著改变图7C和7F。正如预期的,构建的空突变体dgal图7D具有显著减少的脂质积累(图5E。[0163]实施例13[0164]通过基本原理设计提高圆红冬孢酵母中的多不饱和脂肪酸PUFA生成[0165]在圆红冬孢酵母菌株中,油酸(C18:l是主要脂肪酸组分(〜50%,而棕榈油酸C16:1和亚油酸C18:2组成〜20%的总FA。多不饱和ω-3脂肪酸α-亚麻酸C18:3n=9,ALA是以总脂肪酸的3〜4%%TFA存在的微量组分(图8。为了从油酸产生ALA,需要δ-12去饱和酶Fad2和ω-3去饱和酶Fad3[57,58]。根据圆红冬孢酵母的密码子使用偏好设计并商业合成亚麻L.usitatissimumFAD3、桐树(油桐(V.fordiiFAD3和高山被孢霉M.alpineFAD2[22],其中用圆红冬孢酵母中常用的密码子代替所有稀有密码子。涉及的基因的GC含量为LuFAD3-2SEQIDN0:9中的65.3%,MaFAD2-2SEQIDN0:4中的64.8%和VfFAD3-2SEQIDN0:ll中的63·3%。[0166]通过可操作地连接至RtGPDl启动子和花椰菜花叶病毒35S终止子实现3个合成基因的高水平表达,然后分析所选ATMT菌株的脂肪酸组成。过量表达LuFAD3-2RHE001、¥^^03-2〇^迅002或1^厶02-3〇^迅003的优良菌株表现出厶1^含量分别提高1.8、2.2和1.6倍(图94。随后,将肚6?01::4€?403-2:355和肚6?01::]\^402-2:355安插入单个1'-0祖载体PRHE004,通过ATMT将其转化至圆红冬孢酵母ATCC10657的衍生物RT1CE6,包含稳定整合入基因组的17β-雌二醇诱导Cre基因)。通过利用pKOALDl载体缺失ALDl基因来进一步修饰所选优良菌株RHE004。所得菌株命名为aldleAM产生比aldl空突变体aldle高3.74-倍的ALA图9B,ALA含量达到总脂肪酸的〜49%。[0167]实施例14[0168]Aldl的生物化学分析[0169]为了表征Aldl并证实RCM6突变体中的T-DNA插入所致的C-端58个残基缺失损害其酶活性,将Aldl蛋白的全长和截短版本在大肠杆菌EcoliBL21DE3中作为具有C-端6X组氨酸标签的融合蛋白表达。将重组Aldl和Aldln用^GEhealthcare,USA纯化并利用以前报道的方法测定[59],有一些修改。简单地说,反应混合物由40μ1的IOOmM1^8-:1缓冲液!18.0、3^1的101111熟0+或熟0?+5丨81^-厶1办丨*,1]5厶)、1^1的201111十二醛十二烷基醛,C12-醛,Sigma-Aldrich,USA、110μ1水和10μ1纯化的酶组成。反应在室温25°C下进行,并且通过添加酶起始。如以前所述[40],利用iControl™版本3.0软件Tecan,Salzburg,Austria通过InfiniteM200酶标仪(Tecan,Salzburg,Austria读取340nm下光密度值的时间进程。如图10所示,Aldl和Aldln均表现出明显的脱氢酶活性,略微偏好NAD+。值得注意的是,具有C-端58aa缺失的突变蛋白表现出显著较低的酶促活性。[0170]实施例15[0171]圆红冬孢酵母中脂肪酸生物合成基因的表征[0172]通过利用已知的解脂耶氏酵母和玉米黑粉菌酶序列作为询问对圆红冬孢酵母ATCC204091基因组支架序列204091以前名为粘红酵母,GenBank登录号AEVR02000000,全基因组鸟枪测序计划PRJNA59971,密西西比州立大学,USA.进行BLAST搜索鉴定了各种脂肪酸去饱和酶、延长酶和ATP-柠檬酸裂解酶的圆红冬孢酵母同源物。用圆红冬孢酵母菌株ATCC10657或其衍生物Rtlck在同源重组中表现出极高效率的KU70缺陷突变体进行遗传操纵和DNA序列表征。使用的寡核苷酸在表3中列出。[0173]表3用于以下的寡核苷酸:[0174]用于硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶基因(RtFADl的缺失[0176]用于δ-12去饱和酶基因(RtFAD2的缺失[0179]用于延长酶基因IRtELOl的缺失[0181]用于ATP-柠檬酸裂解酶基因RtACLl的缺失[0183]用于延长酶基因2RtEL02的缺失[0185]用于ELOlcDNA的表达[0188]用于EL02cDNA的表达[0192]aSEQIDNO:[0193]为了δ-9-油酸去饱和酶基因FADl或0LE1同源物的缺失,利用圆红冬孢酵母ATCC10657基因组DNA用寡核苷酸对DS9L-SfDS9L-Br和DS9R-HfDS9R-Str分别扩增左侧和右侧同源侧翼片段各〜〇.9kb。用SacIPmeI消化的pEX2二元载体、SacIBamHI消化的左侧侧翼片段、BamHIHindlll消化的来自pDXP795hptR的密码子优化的潮霉素选择盒(PGPD1::hpt-3:=Tncis,[60]和HindlllStuI消化的右侧侧翼片段进行4-片段连接以产生基因缺失质粒pKOOLEl。应用相似的策略构建pK0FAD2和pKOELOl,分别用于敲除推定的δ-12去饱和酶基因和延长酶基因1。01丨8〇对05121^-5€205121^-812和05121?-^705121?-5让用来扩增PK0FAD2的左侧(0.6kb和右侧(0.9kb同源侧翼片段,并且ELOlL-SfELOlL-Br和ELOlR-HfEL01R-Str用于pKOELOl各〜0.9kb。对于EL02,对于左侧和右侧同源侧翼片段,分别使用oligo对EL02L-StfEL02L-Hr和EL02R-BfEL02R-Sr各〜0.8kb并用StulHindlll和BamHISacI消化。在4-片段连接中相似地使用两个片段以产生pK0EL02。[0194]为了缺失推定的ATP-柠檬酸裂解酶基因(RtACLl,将寡核苷酸c^#ACLlL-Sf2ACL1L-Br2和ACLlR-Hf2ACLlR-Str2用来扩增左侧和右侧同源侧翼片段各0.9kb以利用上文所述相似的策略产生PK0ACL1。[0195]通过RT-PCR获得所关注的基因的cDNA序列,利用BDSMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒(Clontech,California,USA根据制造商的说明书进行5’和3’RACE。寡核苷酸对0LE1U10LE1L1、FAD2U1FAD2L1分别用作FADlOLEl和FAD2的5’3’RACE的特异性引物。[0196]预测的FadlOlel和Fad2的ORF分别编码545、451aa的蛋白。两个Fad享有膜脂肪酸去饱和酶的共有保守结构域蛋白家族编号口€3111〇04873冊1^481。但是^12缺少细胞色素β5样血红素类固醇结合结构域pfamOOnSALAST搜索显示Olel和Fad2分别与来自的禾柄锈菌Pucciniagraminis的硬脂酰-CoA去饱和酶XP_003326562.1,70%相同性)、来自玉米黑粉菌的A12-脂肪酸去饱和酶XP_757193.1,57%相同性表现出最高相同性。[0197]鉴定了两种延长酶。ELOlSeqID.No.99和100和EL02SeqID.No.102和103分别编码长度为329SeqID101和293aaSeqID104的蛋白。两种推定的脂肪酸延长酶均享有参与长链脂肪酸延长系统的GNS1SUR4家族的共有保守结构域pfam01151Alol和Elo2分别与来自禾柄锈菌(PGTG06945,XP_003325743.2,43%相同性)和松杨栅锈菌1^1^^01^?1'_427234?_007407925.1,65%相同性)的脂肪酸延长酶表现出最高相同性。ELOl和EL02敲除的脂肪酸谱分析显示ELOl敲除导致谱变化很少,除了C18:0适度减少以及C16:0和C18:l少量增加。相比之下,EL02敲除导致长链脂肪酸(C18合成的完全丧失(图12。这些结果强烈表明OLEl是短链脂肪-CoA延长酶,而EL02能够是长链和短链脂肪酸-CoA的延长酶。[0198]为了过量表达研究,利用通过逆转录合成的圆红冬孢酵母cDNA分别用引物对Rt227NfRt228Evr、Rt229NdfRt230Evr和Rt259NfRt260Evr扩增0LE1、FAD2和EL02的cDNA。将NcoIEcoRV消化的PCR产物与NcoIEcoRV消化的pKCl载体连接以产生pKClOLEl、PKC1FAD2和pKClEL02,因为载体pKCl中使用的强RtGPDl启动子导致基因的过量表达。[0199]实施例16[0200]基因缺失分析[0201]为了证实每个基因的功能,通过各敲除构建体的农杆菌Agrobacterium介导的转化产生敲除突变体;通过菌落PCR和DNA印迹分析筛选。FADl敲除在几次尝试中不成功。FAD2的缺失在转化和增殖培养基中补充亚油酸之后成功。亚油酸(C18:2,LA和α-亚麻酸C18:3,ALA在FAD2空突变体中不存在,而C18:l的含量增加至总脂肪酸的几乎70%图11B。这证实FAD2基因(SEQIDN0:92编码催化油酸C18:1转化形成LA的Δ12-脂肪酸去饱和酶。FAD2敲除突变体中缺少ALA表明Fad2是△12和△15双功能脂肪酸去饱和酶。甚至在补充了LAC18:2前体时fad2Δ突变体不能产生ALA生成支持这个图11D。[0202]通过过量表达可以证实FADl0LE1的功能。将Rt⑶Pl::0LE1盒(图13A转化入Wt和ALDl敲除菌株(Aaldle导致油酸含量显著增加(图14。因此,将RtGDPl::OLEl叠加至MaFAD2-2图13D,或者叠加至MaFAD2-2和VfFAD3-2过量表达盒(图13E分别导致LA和ALA增加(图14。在表达3-基因盒的18个转化体中,在aldle背景中3个表现出20%ALA含量,一个包含〜24%。这个系列中较低的ALA含量可能归因于用于MaFAD2-2的较弱ACC1启动子,因为LA含量非常低未不出)。[0203]实施例17[0204]在圆红冬孢酵母中表征ATP-柠檬酸裂解酶ACLl基因[0205]基于动物中的研究,据信真菌ATP-柠檬酸裂解酶ACL是油积累的重要因子。通过粘红酵母ATCC204091部分基因组序列的BLAST搜索鉴定了推定的ATP-柠檬酸裂解酶合成酶基因ACLlseqIDNo.86和87。推定的Acll蛋白序列在SeqID.No.88中示出。产生ACLl基因的敲除突变体,并且其表现出显著减少的油积累和生物质生长(图15。这强烈表明ACLl表达促进圆红冬孢酵母中的油积累和生物质生成。[0206]参考文献[0207]An,G.,etal.,1989.Functionalanalysisofthe3'controlregionofthepotatowound-inducibleproteinaseinhibitorIIgene.PlantCell,1:115-122.[0208]I.Venegas-Caleron1M.,0.Sayanova,andJ.A.Napier,Analternativetofishoils:metabolicengineeringofoil-seedcropstoproduceomega-3longchainpolyunsaturatedfattyacids.Progressinlipidresearch,2010.492:p.108-119.[0209]2.Horrobin,D.,Nutritionalandmedicalimportanceofgamma-linolenicacid.Progressinlipidresearch,1992.312:p.163-194.[0210]3.Simopoulos,A.P.,Theimportanceoftheratioofomega-6omega-3essentialfattyacids.Biomedicinepharmacotherapy,2002.568:p.365-379.[0211]4.Gong,Z.,etal·,Efficientconversionofbiomassintolipidsbyusingthesimultaneoussaccharificationandenhancedlipidproductionprocess.Biotechnologyforbiofuels,2013.6I:p.1-12.[0212]5.RatledgejC.,Regulationoflipidaccumulationinoleaginousmicroorganisms.BiochemSocTrans,2002.30Pt6:p.1047-50.[0213]6.Meng,X.,etal.,Biodieselproductionfromoleaginousmicroorganisms.RenewableEnergy,2009.34I:p.1-5.[0214]7.Ward,O.P.andA.Singh,Omega-36fattyacids:alternativesourcesofproduction.ProcessBiochemistry,2005.4012:p.3627-3652.[0215]8.Beopoulos,A.,etal.,Yarrowialipolyticaasamodelforbi〇-〇iIproduction.ProgLipidRes,2009.486:p.375-87.[0216]9.KatrejG.,etal.,EvaluationofsinglecelloilSCOfromatropicalmarineyeastYarrowialipolyticaNCIM3589asapotentialfeedstockforbiodiesel.AMBExpress,2012.2I:p.36.[0217]10.Neuveglise,C.,etal.,AshuttlemutagenesissystemfortagginggenesintheyeastYarrowialipolytica.Gene,1998.2131-2:p.37-46.[0218]11.SabirovajJ.S.,etal.,TheiLipoYeastsJproject:usingtheoleaginousyeastYarrowialipolyticaincombinationwithspecificbacterialgenesforthebioconversionoflipids,fatsandoilsintohigh-valueproducts.MicrobBiotechnol,2011.4I:p.47-54.[0219]12·Tai,M.andG.Stephanopoulos,EngineeringthepushandpulloflipidbiosynthesisinoleaginousyeastYarrowialipolyticaforbiofuelproduction.MetabEng,2013.15:p.1-9.[0220]13.Li,Y.,Z.K.Zhao,andF.Bai,High-densitycultivationofoleaginousyeastRhodosporidiumtoruloides〈iY4infed-batchculture.EnzymeandMicrobialTechnology,2007.413:p.312-317.[0221]14.Zhao,X.,etal.,LipidproductionbyRhodosporidiumtoruloidesY4usingdifferentsubstratefeedingstrategies.JIndMicrobiolBiotechnol,2010.[0222]15.Pan,J.G.,M.Y.Kwak,andJ.S.Rhee,HighdensitycellcultureofRhodotorulaglutinisusingoxygen-enrichedair.Biotechnologyletters,1986·810:p.715-718.[0223]16.FrengovajG.I.andD.M.Beshkova,CarotenoidsfromRhodotorulaandPhaffia:yeastsofbiotechnologicalimportance.Journalofindustrialmicrobiologybiotechnology,2009.362:p.163-180.[0224]I7.Kirk,M.P.,etal.,inDictionaryoftheFungi.2008,CABI:Wallingford.p.7I6.[0225]18.HujC.,etal.,Effectsofbiomasshydrolysisby-productsonoleaginousyeastRhodosporidiumtoruloides.BioresourTechnol,2009·10020:p.4843-7.[0226]19.Zhao,X.,etal.,LipidproductionfromJerusalemartichokebyRhodosporidiumtoruloidesY4.JIndMicrobiolBiotechnol,2010·376:p·581-5·[0227]20.Wu,S.,etal.,MicrobiallipidproductionbyRhodosporidiumtoruloidesundersulfate-limitedconditions.BioresourTechnol,2010.[0228]21.WujS.,etal.,Phosphate-limitationmediatedlipidproductionbyRhodosporidiumtoruloides.BioresourTechnol,2010.10115:p.6124-9.[0229]22.Liu,Y.,etal·,Characterizationofglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasegeneRtGPDlanddevelopmentofgenetictransformationmethodbydominantselectioninoleaginousyeastRhodosporidiumtoruloides.ApplMicrobiolBiotechnol,2013.972:p.719-29.[0230]23.JijL.,N.Peng,andΗ.-I.Cheng,PolynucleotidesequencesfromRhodosporidiumandRhodotorulaandusethereof,inU.S.ProvisionalApplicationNo.61782,832.2013.[0231]24.LiujY.,etal.,GeneticmanipulationandexpressionsystemsforPucciniomycotinaandUstilaginomycotinasubphyla,inWOpatent2012169969.2011.[0232]25.YejV.M.andS.K.Bhatia,Metabolicengineeringfortheproductionofclinicallyimportantmolecules:Omega-3fa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权利要求:1.一种真菌宿主细胞,其中在所述真菌宿主细胞中总脂肪酸包含水平为至少9%,优选超过24%,最优选超过49%的升高水平的多不饱和脂肪酸PUFA,特别是α-亚麻酸ALA或γ-亚麻酸GLA,其中所述真菌宿主细胞的基因组已被修饰使得所述真菌宿主细胞与具有未修饰的基因组的真菌宿主细胞相比具有减少的天然醛脱氢酶ALDl酶活性,并且其中所述真菌宿主是红冬孢酵母属Rhodosporidium或红酵母属Rhodotorula的物种。2.权利要求1的真菌宿主细胞,其中所述天然ALDl选自:a具有SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列的ALDl;以及⑹与SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列具有至少75%相同性或至少85%相同性或至少95%相同性的ALDl。3.权利要求2的真菌宿主细胞,其中所述天然ALDl由选自以下的核酸编码:a具有SEQIDNO:1中示出的核苷酸序列的核酸;⑹具有SEQIDNO:2中示出的核苷酸序列的核酸;c与a的核酸具有至少75%相同性或至少85%相同性或至少95%相同性的核酸;以及⑹与⑹的核酸具有至少75%相同性或至少85%相同性或至少95%相同性的核酸。4.权利要求1-3中任一项的真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞具有缺陷的编码ALDl的基因,导致Aldl酶活性丧失。5.权利要求4的真菌宿主细胞,其中所述缺陷的基因是由T-DNA插入、同源重组或定点诱变引起的。6.权利要求1-3中任一项的真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞的基因组已被修饰以下调天然ALDl基因的表达,导致Aldl酶活性丧失或减少。7.权利要求6的真菌宿主细胞,其中所述表达是通过人工转录阻遏物、RNAi、siRNA、shRNA、miRNA、反义或有义抑制下调的。8.权利要求1-7中任一项的真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞的基因组已被进一步修饰以包括至少两个表达盒,其中每个表达盒包含可操作地连接至编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的核酸,并且其中所述蛋白选自:a酰基-〇Αδ-12去饱和酶;⑹硬脂酰-CoA-S-9-去饱和酶;cω-3去饱和酶;d脂肪酸延长酶;e酰基-CoA羧化酶ACC;fATP:柠檬酸裂解酶ACL;g二酰甘油酰基转移酶DGA;⑹苹果酸酶MAE;⑴酰基-CoAS-6去饱和酶。9.权利要求8的真菌宿主细胞,其中所述表达盒进一步包含可操作地连接至编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的核酸的转录终止子。10.权利要求8或9的真菌细胞,其中所述核酸的编码序列包含至少55%C和G,优选60%-70%C和G,其中至少70%的密码子在第3位具有C或G。11.权利要求8-10中任一项的真菌细胞,其中所述蛋白选自:a酰基_:οΑδ-12去饱和酶,其具有SEQIDNO:5和或SEQIDN0:94中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;⑹硬脂酰-CoA-S-9去饱和酶,其具有SEQIDNO:8中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;cω-3去饱和酶,其具有SEQIDNO:10或SEQIDNO:12中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;⑹脂肪酸延长酶,其具有SEQIDNO:101或SEQIDNO:104El〇2中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;e酰基-CoA羧化酶ACCl,其具有SEQIDN0:91中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;fATP:柠檬酸裂解酶ACLl,其具有SEQIDN0:88中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;g二酰甘油酰基转移酶DGAl,其具有SEQIDN0:82中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性;以及⑹苹果酸酶MAEl,其具有SEQIDN0:85中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性。g酰基-CoAS-16去饱和酶,其具有SEQIDN0:96或SEQIDN0:98中示出的氨基酸序列,或者与所述氨基酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性。12.权利要求11的真菌细胞,其中所述蛋白由选自以下的核酸编码,所述核酸具有SEQID冊:4、6、7、9、11、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、96、98、99、100、102和103中示出的核苷酸序列,或者与所述核苷酸序列具有至少80%或至少90%或至少95%相同性。13.权利要求8-12中任一项的真菌宿主细胞,其中所述启动子是分离自编码选自以下蛋白的基因的启动子:甘油醛3-磷酸脱氢酶GPD、酰基-CoA载体蛋白(ACP、脂肪酸去饱和酶、翻译延伸因子TEF、丙酮酸脱羧酶TOC、烯醇化酶2-磷酸甘油酸脱水酶)(ENO、肽基脯氨酰异构酶PPI、乙酰基-CoA羧化酶ACC和转醛醇酶。14.权利要求13的真菌宿主细胞,其中所述启动子是选自SEQIDNO:55-79中示出的启动子组的启动子序列。15.权利要求13或14的真菌宿主细胞,其中所述启动子分离自红冬孢酵母属或红酵母属的物种。16.权利要求1的真菌宿主细胞,其中SeqIDNo.99和102中示出的ELOl或EL02基因或者与其序列具有至少75%相同性、85%相同性或95%相同性的核酸已被人工操纵为具有升高或降低水平的脂肪酸延长酶活性。17.—种产生ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸PUFA的方法,所述方法包括使权利要求1-16中任一项的真菌宿主细胞在适合产生PUFA的条件下生长。18.—种产生三酰甘油TAG的方法,所述方法包括使权利要求1-16中任一项的真核宿主细胞在适合产生TAG的条件下生长。
百度查询: 淡马锡生命科学研究院有限公司 在红冬孢酵母属和红酵母属物种中高效产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法
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