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【发明授权】一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液_中国海洋大学_201810589606.1 

申请/专利权人:中国海洋大学

申请日:2018-06-08

公开(公告)日:2021-05-07

公开(公告)号:CN108823289B

主分类号:C12Q1/6841(20180101)

分类号:C12Q1/6841(20180101)

优先权:

专利状态码:失效-未缴年费专利权终止

法律状态:2023.06.16#未缴年费专利权终止;2018.12.11#实质审查的生效;2018.11.16#公开

摘要:本发明公开了一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液,由去离子甲酰胺,2xSSC缓冲液,聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯,酵母总RNA,封闭试剂,乙二胺四乙酸,硫酸葡聚糖,柠檬酸三钠,磷酸氢二钠,焦碳酸二乙酯处理后的水,变性后的探针与去离子甲酰胺混合液按一定比例配置成的。应用本发明的杂交液可以使染色体原位杂交技术不依赖于荧光检测,使用普通显微镜就可以观察到荧光信号,而且试剂配制和存放便捷,杂交结果观察、拍照方便,杂交材料可以长期存放,实验过程更加简单易于操作,极大的扩大了鱼类染色体原位杂交的应用范围。

主权项:1.一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液,其特征在于,所述的杂交液是在体积百分比浓度为15%-25%的的2xSSC缓冲液中添加去离子甲酰胺,聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20,酵母总RNA,封闭试剂Blockingreagent,0.5molL乙二胺四乙酸EDTA母液,硫酸葡聚糖,柠檬酸三钠,磷酸氢二钠,焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水制成的,其中各组分的浓度如下:去离子甲酰胺的体积百分含量为55%-65%,聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20的体积百分比含量为0.5%-1.5%,酵母总RNA使用的体积百分含量为0.1%-0.2%,封闭试剂Blockingreagent的质量百分比为30%-40%,乙二胺四乙酸EDTA的母液浓度为0.5molL,其使用的体积百分含量为1%-1.5%,硫酸葡聚糖其使用的质量分数为20%;柠檬酸三钠其使用的质量分数为15%;磷酸氢二钠其使用的质量分数为10%。

全文数据:一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液技术领域[0001]本发明属于染色体原位杂交领域,具体涉及一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液。背景技术[0002]焚光原位杂交fluorescenceinsituhybridization,FISH是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。它的原理是利用碱基互补配对原则,将探针DNA分子标记后,使其与染色体上相对应的序列杂交。再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体上的位置。目前,荧光原位杂交技术已广泛应用于染色体的识别、DNA序列的定位、物理图谱的构建、进化分析等研宄。[0003]现阶段,荧光原位杂交技术在细胞遗传学、分子生物学、基因组学等领域发挥着重要的作用,但同时也存在着明显的缺陷:1荧光信号具有不稳定、容易淬灭的特点,导致杂交后的材料需要立即观察,不能长期保存;2杂交过程所需试剂繁多,且大多需要避光冷冻保存,同时,信号的检测依赖于荧光显微镜,与普通显微镜相比体积大、配件多、不方便搬运,大大限制了该技术的便携性;3信号检测需要至少两种波长的激光来激发荧光,必须将拍摄的多组不同波长激发的信号图片进行融合处理才能最终显示出信号的位置,步骤繁琐且费时;4荧光信号的观察要尽可能在暗处,对环境要求比较严格。上述缺陷大大限制了荧光原位杂交技术的应用范围,还会对实验结果的观察以及后续分析造成影响。因此,迫切需要开发出一种可以使染色体原位杂交摆脱荧光限制的技术,来扩大染色体原位杂交的应用范围,准确便捷的完成对特定DNA在染色体上的定位分析及定量分析。此外,与高等脊椎动物相比,鱼类染色体标本制片较难,操作过程的精确度要求更高,因此适用于鱼类染色体的便捷的原位杂交技术急需获得重大突破。发明内容[0004]本发明的目的是发明一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液,应用本发明可以使染色体原位杂交技术不依赖于荧光检测,使用普通显微镜就可以观察到杂交信号。而且试剂配制和存放便捷,杂交结果观察、拍照方便,杂交材料可以长期存放,实验过程相对简单易于操作。[0005]本发明的不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液是在体积百分比浓度为15%-25%的的2xSSC缓冲液中添加去离子甲酰胺,聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯T抑en-20,酵母总RNA,封闭试剂(Blockingreagent,〇_5m〇1L的乙二胺四乙酸⑽Ta母液,硫酸葡聚糖,柠檬酸三钠,磷酸氢二钠,焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水,其中各组分的浓度如下:[0006]去离子甲酰胺的体积百分含量为55%—65%,更优选地为60%。[0007]聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween_2〇的体积百分比含量为〇.,更优选地为1%。[0008]酵母总RNA使用的体积百分含量为〇•1%-〇•2%,更优选地为〇.1%。[0009]封闭试剂Blockingreagent为常规试剂,购自Roche公司,其使用的质量百分比为30%-40%,更优选地为37•5%。[0010]乙二胺四乙酸(EDTA的母液浓度为〇.5m〇lL,其使用的体积百分含量为1%-1.5%〇[0011]硫酸葡聚糖其使用的质量分数为20%;柠檬酸三钠其使用的质量分数为15%;磷酸氢二钠其使用的质量分数为10%。[0012]本发明所提供的原位杂交液用于鱼类染色体原位杂交应用中;[0013]所述的鱼类,优选为鲆鲽鱼;[0014]本发明再一个方面提供一种鲆鲽鱼的染色体原位杂交方法,是将变性后的探针与本发明中的杂交液按一定比例配置,随后用普通显微镜观察DNA片段与染色体杂交结果。[0015]本发明通过各成分的有效配比配置溶液,对变性后的染色体标本进行杂交,从而使染色体和探针分别显色,且通过普通显微镜就可以观察到探针在染色体上的位置。此方法的应用性更广泛,可以完全满足不依赖于荧光检测观察特定DNA片段在染色体上的定性、定量或相对定位分析。附图说明[0016]图1为使用本发明提供的杂交液处理后,鲆鲽鱼染色体原位杂交在普通显微镜下观察到的结果图。具体实施方式[0017]本发明提供一种在鱼类染色体原位杂交中使用的杂交液,经过对杂交液所含成分以及各成分比例的长期尝试试验,从而促成本发明。使用本发明提供的杂交液可以使染色体原位杂交在普通显微镜下即可进行观察,信号清晰,杂交后的染色体标本具有很好的稳定性。[0018]下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均在常规生化试剂商店购买得到的。[0019]实施例1[0020]本发明中的鱼类染色体原位杂交杂交液(以lmL体积为例),配方如下:[0021]在1^36_;^66的超净工作台中,向1.51111^?管中依次加入60%的去离子甲酰胺,目口600yL,加入20%的2xSSC缓冲液,SP200UL,加入封闭试剂Blockingreagent0.375g,加入1%的0.5molL的乙二胺四乙酸EDTA,S卩10uL,加入1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20,S卩10uL,加入0•1%的酵母总RNA,S卩luL,加入硫酸葡聚糖0.2g,加入柠檬酸三钠0.15g,加入磷酸氢二钠0•lg,加5%_6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水补充到lmL。然后取10uL探针和10uL去离子甲酰胺于200UL小EP管中,80°C加热7min后立即转入冰上冷却,冰上保温至少十分钟。然后将20uL探针和去离子甲酰胺混合液加入到之前1.5mLEP管中,充分混合均匀获得杂交液。混合后的杂交液放在4°C保存备用。[0022]这样制成的杂交液中各组分的浓度如下:[0023]体积百分含量20%的2xSSC缓冲液、体积百分含量60%的去离子甲酰胺、质量分数37.5%的封闭试剂(Blockingreagent、体积百分含量1%的0•5molL的乙二胺四乙酸EDTA母液、体积百分含量1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween_2〇、体积百分含量0•1%的酵母总RNA、质量分数2〇%的硫酸葡聚糖,质量分数15%的柠檬酸三钠,质量分数1〇%的磷酸氢二钠、体积百分含量5%-6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水。[0024]本发明的杂交液的使用方法如下:[0025]杂交时首先将染色体标本在75°c下热处理十分钟,然后立即将4°C保存的杂交液均匀的滴在染色体标本表面,再轻轻加上盖玻片,用封口膜包好后,放入暗盆中在37°C培养箱中杂交12-18h。[0026]杂交过夜之后对染色体标本进行洗脱,最后用吉姆萨对染色体标本进行染色,在普通显微镜下观察的结果如图1,在浅蓝色的染色体上,我们可以很清晰的看到深蓝色的探针信号。观察方法更为直接简便。由此可以说明使用本发明的杂交液在普通显微镜下即可观察到明显的杂交信号,而且操作简洁,拍照方便。[0027]通过本发明提供的鱼类染色体原位杂交杂交液对染色体标本进行处理,使染色体原位杂交不依赖于荧光检测,在普通显微镜下就可以观察到清晰的杂交信号。在普通显微镜下观察到染色体显浅蓝色,特定的标记DNA片段显现出深蓝色。本发明解决了传统方法下鱼类染色体原位杂交对实验试剂仪器要求苛刻,结果观察、拍照费时,杂交材料不能长期稳定保存等问题。相比于传统的依赖于荧光检测的染色体原位杂交来说,所需的实验条件变得更加简单,摆脱了严格的杂交试剂储存条件以及大型荧光显微镜的限制。对实验结果的观察变得更加直接便捷,通过普通显微镜直接观察即可,相比于原来的依赖多种不同波长激光激发信号再融合处理的信号定位方法来说,大大的缩短了观察和拍照所用的时间。杂交后材料可以长期保存,不存在荧光信号不稳定、易淬灭等问题。极大的扩大了染色体原位杂交的应用范围。[0028]实施例2[0029]本发明杂交液配方与各种杂交液配方对鲆鲽鱼类染色体原位杂交结果影响的比较。[0030]杂交液1:体积百分含量20%的2xSSC缓冲液、体积百分含量60%的去离子甲酰胺、质量分数37•5%的封闭试剂Blockingreagent、体积百分含量1%的0•5molL的乙二胺四乙酸EDTA、体积百分含量1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20、体积百分含量0.1%的酵母总RNA、质量分数20%的硫酸葡聚糖、质量分数15%的柠檬酸三钠、质量分数10%的磷酸氢二钠、体积百分含量5%-6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水。[0031]杂交液2:体积百分含量20%的2xSSC缓冲液、体积百分含量6〇%的去离子甲酰胺、体积百分含量1%的0.5molL的乙二胺四乙酸EDTA、体积百分含量1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-2〇、体积百分含量0.1%的酵母总RNA、质量分数20%的硫酸葡聚糖、质量分数15%的柠檬酸三钠、质量分数10%的磷酸氢二钠、体积百分含量5%-6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水。[0032]杂交液3:体积百分含量20%的2xSSC缓冲液、体积百分含量60%的去离子甲酰胺、质量分数37.5%的封闭试剂Blockingreagent、体积百分含量1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20、体积百分含量〇•1%的酵母总RNA、质量分数20%的硫酸葡聚糖、质量分数15%的梓檬酸三钠、质量分数10%的憐酸氢二钠、体积百分含量5%—6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水。[0033]杂交液4:体积百分含量40%的2xSSC缓冲液、体积百分含量40%的去离子甲酰胺、质量分数37.5%的封闭试剂Blockingreagent、体积百分含量1%的〇.5molL的乙二胺四乙酸EDTA、体积百分含量1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20、体积百分含量〇_1%的酵母总RNA、质量分数20%的硫酸葡聚糖、质量分数15%的柠檬酸三钠,、质量分数10%的磷酸氢二钠、体积百分含量5%-6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水。[0034]杂交液5:体积百分含量20%的2xSSC缓冲液、体积百分含量60%的去离子甲酰胺、质量分数37•5%的封闭试剂Blockingreagent、体积百分含量1%的0.5molL的乙二胺四乙酸EDTA、体积百分含量1%的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20、体积百分含量0•1%的酵母总RNA、质量分数20%的硫酸葡聚糖、体积百分含量5%-6%的焦碳酸二乙酯DEPC处理后的水。[0035]通过对杂交液所含成分以及各成分比例的比较试验,证明本发明的杂交液与其他配方相比会产生最佳的杂交结果。杂交信号清晰,结果明显。相反,去掉本发明杂交液配方中的一种或几种,或者改变浓度都会导致鱼类染色体原位杂交结果不理想。

权利要求:一1•-种不依織光检_交信号的錢染色体雖杂翅,其雜在于,臟的杂交液疋在体积百分比浓度为I5%-25%的的2xSSC缓冲液中添加去离子甲酰胺,聚氧乙稀失水山梨醇单月桂酸酉日Tween-2〇,酵母总RNA,封闭试剂Bi〇ckingreagent,〇•5m〇iL乙二胺四乙酉交EDTA母液,硫fe匍來糖,朽1彳家酸二钠,磷酸氢二钠,焦碳酸二乙醋depc处理后的水制成的,其中各组分的浓度如下:去离子甲酰胺的体积百分含量为55%-65%,聚氧乙細失水山梨醇单月桂酸酯Tween-20的体积百分比含量为〇.5%—15%酵母总RNA使用的体积百分含量为0.1%-〇.2%,'’封闭试剂Blockingreagent的质量百分比为30%-40%,乙二胺四乙酸EDTA的母液浓度为〇_5molL,其使用的体积百分含量为1%_丨5%,硫酸葡聚糖其使用的质量分数为20%;’柠檬酸三钠其使用的质量分数为15%;磷酸氢二钠其使用的质量分数为10%。2.如权利要求1所述的杂交液,其特征在于,所述的去离子甲酰胺的体积百分含量为60%〇3.如权利要求1所述的杂交液,其特征在于,所述的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸醋Tween-20的体积百分比含量为1%〇4.如权利要求1所述的杂交液,其特征在于,所述的酵母总RNA使用的体积百分含量为0.1%。5.如权利要求1所述的杂交液,其特征在于,所述的封闭试剂Blockingreagent的质量百分比为37.5%。6.权利要求1-5任一项所述的杂交液在鱼类染色体原位杂交中的应用。7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的鱼类为鲜鲽鱼类。8.—种鉀鲽鱼的染色体原位杂交方法,其特征在于,所述的方法是将变性后的探针与权利要求1-5任一项所述的杂交液按配置后,随后用普通显微镜观察DNA片段与染色体杂交结果。

百度查询: 中国海洋大学 一种不依赖荧光检测杂交信号的鱼类染色体原位杂交液

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