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【发明授权】一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法_信阳农林学院_201810549806.4 

申请/专利权人:信阳农林学院

申请日:2018-05-31

公开(公告)日:2021-05-14

公开(公告)号:CN108918703B

主分类号:G01N30/02(20060101)

分类号:G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.05.14#授权;2018.12.25#实质审查的生效;2018.11.30#公开

摘要:本发明属于检测分析技术领域,具体涉及一种鉴别蜂王浆制剂中是否掺入人工合成的10‑HDA的分析鉴别方法,该方法采用硅胶柱层析纯化方法前处理待检样品,得白色固体,然后利用反相‑高效液相色谱法检测,固定相为ODS‑C18反相柱,体积比为55:10:35的甲醇:0.03molLHCl:水为流动相,采用等度洗脱。该鉴别方法,灵敏度高,分离度和重现性好,鉴别特征明显,能够准确鉴别蜂王浆制剂中掺0.5%以上的人工合成的10‑HDA。

主权项:1.一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1:蜂王浆制剂的前处理:蜂王浆制剂的前处理包括以下步骤:步骤1.1:将蜂王浆制剂溶解于乙醇溶液,并上样于30~60目柱层析硅胶;步骤1.2:石油醚洗脱并去除石油醚洗脱部位;步骤1.3:体积百分数50%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱部位,回收过滤并干燥,得白色固体;步骤2:将步骤1得到的白色固体用体积百分数95%的乙醇溶解,然后用反相-高效液相色谱法分析检测;所述反相-高效液相色谱的色谱条件如下:(1)固定相为ODS-C18反相柱;(2)体积比为45~60:10:30~45的甲醇:0.03molLHCl:水为流动相;(3)流速为1.0mLmin;(4)检测波长为210nm;(5)进样量为10μL;步骤3:色谱图分析:蜂王浆制剂中掺有人工合成的10-HDA的样品,反相-高效液相色谱图在17~22min有一个杂质峰;蜂王浆浆渣中提取的10-HDA的色谱图在17~22min无杂质峰。

全文数据:一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法技术领域[0001]本发明属于检测分析技术领域,具体涉及一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法。背景技术[0002]蜂王浆是工蜂头部的分泌物,色白或淡黄,是理想的天然保健品,其味酸辛、微甘,性平;既补先天之根本,又益后天之不足;具有宣肺益气、善疏肝理气、滋补强壮、提高免疫能力的功能。蜂王浆的成分极其复杂,其主要成分包括蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪酸、生物活性酶等。对人体有明显的保健作用,特别是对心血管病、血脂代谢紊乱、高血压、内分泌失调等症有良好的调治作用。[0003]蜂王浆含有26种以上的脂肪酸,目前已确认有12种,其中10-羟基-2-癸烯酸简称10-HDA,占总脂肪酸的50%以上,是蜂王浆的重要成分。10-HDA是由德国科学家D.J.朗格1921首次在工蜂上额腺中发现的,日本学者佐藤道夫也以大量数据证实。10-HDA主要分泌于工蜂的上颚腺,1957年Batendt首先报导从王浆中分离出10-HDA,至今还未在自然界其它物质中发现此化合物。由于在自然界中只有蜂王浆中才有,所以10-HDA通常又被称为王浆酸。[0004]10-HDA有多种生理活性,它具有抗菌、灭菌、强壮机体和抑制淋巴癌、乳腺癌等多种癌细胞的作用,还有增强机体免疫功能,防治脱发,并用作化妆品的增效剂,还用作治疗急性辐射损伤和化学物质所致损伤。10-HDA常温时为白色晶体,性质稳定,在室温或高温下长时间存放时,结构不会被破坏或完全消失。该化合物的结构如下:[0005]目前10-HDA主要由蜂王浆浆渣中提取,对于人工合成的10-HDA的研究仍处于起步阶段。10-HDA的含量是评判蜂王浆品质的重要指标,如果10-HDA的含量多1.4%为合格品,含量多1.8%为优等品。虽然所有的蜂王浆制剂中都含有IO-HDA,但是由于IO-HDA的来源不同,导致其含有的杂质种类不同。由于蜂王浆制剂的利润高,且目前对于10-HDA的检测标准较低,造成不法商人通过添加人工合成的10-HDA,制备出检测合格的蜂王浆制剂假货。由于10-HDA在人工合成过程中会引入一些未知的杂质,且对于这些杂质还没有相关的研究。这样可能会因为这些杂质而损害消费者的健康。这极大地危害到人民群众的食品安全,危险性极大。目前对10-HDA的相关研究较多,但都集中于蜂王浆制剂中10-HDA含量的检测,而对人工合成的10-HDA中杂质的研究没有相关报道。因此,一种简单、反应灵敏、快速的对蜂王浆制剂中10-HDA的掺假的检测方法对保证人民食品和保健品安全意义重大。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法,该方法能去除绝大多数杂质的干扰,快速将蜂王浆制剂中10-HDA分离出来,并根据不同来源10-HDA的谱图,来鉴别蜂王浆制剂是否掺假。[0007]人工合成的10-HDA与由蜂王浆浆渣提取的10-HDA所含的杂质不一样,人工合成的IO-HDA中的杂质,在从蜂王浆浆渣中提取的IO-HDA中没有出现过。本发明利用该区别来鉴别蜂王浆制剂中是否掺假。[0008]为实现上述目的,本发明提供了一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法,主要包括以下步骤:步骤1:蜂王浆制剂的前处理:由于蜂王浆制剂中的其它成分会影响10-HDA的测定,因此需要对蜂王浆制剂进行前处理;蜂王浆制剂的前处理主要包括以下步骤:步骤1.1:将蜂王浆制剂溶解于乙醇,并上样于30〜60目柱层析硅胶;步骤1.2:石油醚洗脱并去除石油醚洗脱部位;步骤1.3:体积百分数50%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱部位,回收过滤并干燥,得白色固体。[0009]步骤2:将步骤1得到的白色固体用体积百分数95%的乙醇溶解,然后用反相-高效液相色谱法RP-HPLC分析检测。[0010]步骤3:色谱图分析:蜂王浆制剂中掺有人工合成的10-HDA的样品,反相-高效液相色谱图在17〜22min有一个杂质峰;蜂王浆浆渣中提取的10-HDA的色谱图在17〜22min无杂质峰。[0011]进一步地,步骤1.1中所述乙醇为体积百分数95%的乙醇。[0012]进一步地,步骤1.1中所述蜂王楽制剂:95%乙醇=2〜3g:lmL。[0013]进一步地,步骤1.2中所述石油醚的使用体积为3〜5倍柱体积。[0014]进一步地,步骤1.3中所述50%乙醇的使用体积为3〜4倍柱体积。[0015]进一步地,步骤2中所述反相-高效液相色谱的色谱条件如下:⑴固定相为ODS-C18反相柱,规格为:4.6X150mm,5μπι;⑵体积比为45〜60:10:30〜45的甲醇:0.03molLHCl:水为流动相;⑶流速为1·OmLmin;⑷检测波长为2IOnm;⑸进样量为IOyL;洗脱方式采用等度洗脱。[0016]相比现有技术,本发明的有益效果在于:1、本发明方法反应非常灵敏,能检测出蜂王浆制剂中掺0.5%以上的人工合成的10-HDA0[0017]2、本发明中对样本的前处理方法包括石油醚洗脱等,可以去除绝大多数杂质的干扰。[0018]3、采用本发明的方法对由蜂王浆浆渣提取的IO-HDA和人工合成的IO-HDA的谱图存在明显的区别。而其它鉴别方法则因存在大量的杂质,对IO-HDA的检测有影响。本发明方法特异性高,制剂中的其它成分不影响本发明方法的测定。[0019]4、本发明适用于各种剂型的蜂王浆制剂中IO-HDA的分析和鉴别,前处理方法简单、操作步骤少;分析方法快速、准确;鉴别真伪方法容易、判断指标清晰明确。对蜂王浆制剂标准的提高及产业化的进一步发展意义重大。附图说明[0020]图1为实施例1中蜂王浆浆渣提取的10-HDA的RP-HPLC色谱图,10-HDA的相对保留时间为8.540min。[0021]图2为实施例1中人工合成的10-HDA的RP-HPLC色谱图,10-HDA的相对保留时间为8.322min〇[0022]图3为实施例2中掺0.5%人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC色谱图,10-HDA的相对保留时间为8.230min。[0023]图4为实施例3中掺1.0%人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC色谱图,10-HDA的相对保留时间为8.387min。具体实施方式[0024]以下实施例用于说明本发明,但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明,实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0025]以下实施例中,从蜂王浆浆渣提取10-HDA包括以下步骤:将蜂王浆采用乙醚提取,使用10%的氢氧化钠水溶液洗涤乙醚层,在〇°C滴加盐酸调整水层至pH=2后,抽滤,得到的固体使用乙醚:石油醚=3:1重结晶,得到含量为97%的10-HDA。所述蜂王浆购自浙江蜂之语股份有限公司。[0026]人工合成的10-HDA购自武汉远城共创科技有限公司或嘉兴市远墨化工有限公司。[0027]蜂王浆制剂包括两种,一种是新鲜蜂王浆灭菌后得到的制剂,一种是蜂王浆冻干粉,本发明中所述蜂王浆制剂为新鲜蜂王浆灭菌后得到的制剂。[0028]实施例1蜂王浆浆渣提取的10-HDA与人工合成的10-HDA的对比取蜂王浆浆渣提取的10-HDA含量为97%和人工合成的10-HDA含量98%各200mg,分别用体积百分数95%的乙醇溶解,定容至100mL,使用0.45μπι微孔滤膜过滤后,进行RP-HPLC检测。人工合成的10-HDA购自武汉远城共创科技有限公司。[0029]设备:岛津LC-10AT型高效液相色谱仪;DiamonsilC18色谱柱5ym,4.6X150mm。[0030]色谱条件:⑴固定相为ODS-C18S相柱;⑵流动相为甲醇:0.03molLHCl:水VVV=55:10:35;⑶流速为1·OmLmin;⑷检测波长为2IOnm;⑸进样量为i〇yL。[0031]结果见图1和图2,从RP-HPLC色谱图中可以发现,人工合成的IO-HDA的色谱图在19.235min处比蜂王浆浆渣提取的10-HDA的RP-HPLC色谱图多一个杂质峰。[0032]实施例2掺0.5%人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC分析人工合成的10-HDA购自武汉远城共创科技有限公司。[0033]取掺0.5%人工合成10-HDA的蜂王浆制剂样品40g,用20mL95%的乙醇超声辅助溶解,离心,去除不溶性物质;将滤液上样于30〜60目的柱层析硅胶,上样完成后用3倍柱体积的石油醚洗脱,弃去该部位的洗脱液;再用3倍柱体积的体积百分数50%乙醇洗脱,得乙醇洗脱部位;将此洗脱液回收至无乙醇味,出现白色固体;再继续回收水相至适量的体积,抽滤,得白色固体,60°C条件下鼓风干燥6h烘干,备用。[0034]将上述白色固体用体积百分数95%的乙醇溶解至2mgmL,然后进行色谱检测。[0035]设备:岛津LC-10AT型高效液相色谱仪;DiamonsilC18色谱柱5ym,4.6X150mm。[0036]色谱条件:⑴固定相为ODS-C18S相柱;⑵流动相为甲醇:0.03molLHCl:水VVV=45:10:30;⑶流速为1·OmLmin;⑷检测波长为2IOnm;⑸进样量为i〇yL。[0037]结果如图3所示:掺0.5%人工合成IO-HDA的蜂王浆制剂的色谱图在18.937min处有一个杂质峰。[0038]实施例3掺1.0%人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC分析人工合成的10-HDA购自嘉兴市远墨化工有限公司。[0039]取掺1.0%人工合成10-HDA的蜂王浆制剂样品50g,用20mL95%的乙醇超声辅助溶解,离心,去除不溶性辅料;将滤液上样于30〜60目的柱层析硅胶,上样完成后用5倍柱体积的石油醚洗脱,弃去该部位的洗脱液;再用4倍柱体积的体积百分数50%乙醇洗脱,得乙醇洗脱部位;将此洗脱液回收至无乙醇味,出现白色固体;再继续回收水相至适量的体积,抽滤,得白色固体,60°C条件下鼓风干燥6h烘干,备用。[0040]上述白色固体用体积百分数95%的乙醇溶解至2mgmL,然后进行色谱检测。设备:岛津LC-IOAT型高效液相色谱仪;DiamonsilCl8色谱柱5μηι,4.6X150mm。[0041]色谱条件:⑴固定相为ODS-C18S相柱;⑵流动相为甲醇:0.03molLHCl:水VVV=60:10:45;⑶流速为1·OmLmin;⑷检测波长为2IOnm;⑸进样量为i〇yL。[0042]结果如图4所示,掺1.0%人工合成IO-HDA的蜂王浆制剂的色谱图在19.522min处有一个杂质峰。[0043]由RP-HPLC色谱图可得,与浆渣提取的IO-HDA的RP-HPLC色谱图相比,掺入人工合成的IO-HDA的蜂王浆制剂的RP-HPLC谱图发生了明显的变化,在19min前后出现了一个杂质峰。该杂质峰的峰高和峰面积的变化与人工合成的10-HDA的加入量成正比:实施例2图3中杂质的面积归一法含量为0.003%,实施例3图4中杂质面积归一法含量为0.006%。[0044]利用该杂质峰,可以鉴别蜂王浆制剂的真伪,可以非常容易的鉴别出蜂王浆制剂中是否掺有人工合成的10-HDA。[0045]以上所述之实施例,只是本发明的较佳实施例而已,仅仅用以解释本发明,并非限制本发明实施范围,对于本技术领域的技术人员来说,当然可根据本说明书中所公开的技术内容,通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式,故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等,均应包括于本发明申请专利范围内。

权利要求:1.一种鉴别蜂王浆制剂中IO-HDA的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1:蜂王浆制剂的前处理:蜂王浆制剂的前处理包括以下步骤:步骤1.1:将蜂王浆制剂溶解于乙醇,并上样于30〜60目柱层析硅胶;步骤1.2:石油醚洗脱并去除石油醚洗脱部位;步骤1.3:体积百分数50%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱部位,回收过滤并干燥,得白色固体;步骤2:将步骤1得到的白色固体用体积百分数95%的乙醇溶解,然后用反相-高效液相色谱法分析检测;步骤3:色谱图分析:蜂王浆制剂中掺有人工合成的IO-HDA的样品,反相-高效液相色谱图在17〜22min有一个杂质峰;蜂王浆浆渣中提取的10-HDA的色谱图在17〜22min无杂质峰。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1.1中所述乙醇为体积百分数95%的乙醇。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤1.1中所述蜂王浆制剂:95%乙醇=2〜3g:ImL04.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1.2中所述石油醚的使用体积为3〜5倍柱体积。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1.3中所述50%乙醇的使用体积为3〜4倍柱体积。6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2中所述反相-高效液相色谱的色谱条件如下:1固定相为㈤S-C18K相柱;2体积比为45〜60:10:30〜45的甲醇:0.03molLHCl:水为流动相;3流速为1·OmLmin;4检测波长为2IOnm;5进样量为10yL。

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