申请/专利权人：山东省果树研究所

申请日：2018-02-11

公开（公告）日：2021-05-18

公开（公告）号：CN108103235B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101);C40B40/06(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.18#授权;2018.06.26#实质审查的生效;2018.06.01#公开

摘要：本发明公开了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用，该分子标记为T↔G颠换类型。依据该分子标记开发了扩增引物及SNP基因芯片，实现了苹果砧木个体抗寒性性状的早期鉴定。本发明这一SNP分子标记和SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定，降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源，为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定了基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

主权项：1.一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记，其特征是：该SNP分子标记位于苹果参考基因组第4号染色体上，该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个TG颠换类型单核苷酸多态性变异；其碱基序列如SEQIDNO:1所示，在该碱基序列的第51位碱基处存在一个TG颠换类型单核苷酸多态性变异，为51T或51G。

全文数据：一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP单核苷酸多态性分子标记及其引物，还涉及一种SNP基因芯片及快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，属于作物遗传育种技术领域。背景技术[0002]由于气候异常导致极端天气频现，对农业生产造成较大影响，其中低温成为制约我国农业生产效益的一个重要环境因子。低温导致的冷害和冻害等非生物胁迫是影响植物生长发育和繁殖的主要限制因素。在植物育种过程中，需要将抗低温胁迫能力作为重要指标，用以评价、衡量新种质生产应用的价值和潜力。传统育种中，针对实生后代多采用生理生化或逆境胁迫下的表型评价，淘汰不符合抗寒育种目标的个体，具有测试条件要求高、处理过程繁杂、准确性差、工作量大、效率低等缺点，对于苹果等多年生木本作物，个体大、不易移动，育种实践中对其抗寒性准确评价难以实现，获得抗性新品种的周期长。[0003]为适应低温胁迫，植物在分子水平上进化形成了相应的机制，诱导胁迫相关基因的表达，进一步调控不同的复杂信号通路，调控下游生理生化变化，如活性氧清除、渗透势调节、生物膜保护等生物学过程来抵御逆境。通过鉴定筛选与抗寒性表型遗传控制位点紧密连锁的分子遗传标记，可以实现通过分子标记方法鉴别实生后代抗寒性的高低，极大提高育种中早期选择的工作效率，缩短育种时间。[0004]目前随着植物基因组测序的发展，基于遗传图谱的数量性状定位研究技术方兴未艾，对于解析和开发关键表型背后的分子标记提供了一条新的研究途径。依据这一策略国内外已鉴定到多个与苹果果实品质、抗病性、矮化性等相关或连锁的分子标记。这些标记中少数开始用于辅助育种阶段，例如欧洲育种计划中，开发出4个抗黑星病标记3SSR和1SCAR，2个抗白粉病标记（ISSR和ISCAR，2个抗火疫病标记SCAR，利用这些标记从9个杂交组合的1041株后代中筛选出25株抗病株系，可以作为下一步培育抗病品种的亲本。但目前关于抗非生物逆境寒冷、干旱、盐、碱等连锁标记开发还较少，分子辅助选择或分子辅助育种工作还处于相对滞后的阶段。[0005]矮砧集约栽培是当前苹果的主要趋势，优良矮化砧木是实现集约栽培的基础。国外矮砧育种开展较早，如英国利用杂交等技术育成M系、MM系等矮化砧木，对促进世界苹果栽培变革发挥了重要作用。此外，美国、加拿大、日本、波兰、前苏联等国家利用杂交、实生、诱变等技术，育成G系、MAC系、0系、JM系、B系等抗病、抗虫或抗重茬矮化砧木。我国砧木育种开展较晚，育种成果主要为通过常规杂交育成的矮化砧木SH系和GM256。根据当前我国苹果产业发展需求，急需自主选育抗性和适应性强、矮化性好、易繁殖、综合性状优良的矮化砧木。但目前通过常规育种获得新品种周期长，而通过分子辅助技术获得抗逆新品种日益受到重视，其中开发连锁标记是这一工作的前提。发明内容[0006]针对筛选苹果抗寒性新种周期长的不足，本发明提供了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记，以达到为苹果抗寒性砧木分子辅助育种提供标记的目的。[0007]本发明还提供了扩增该SNP分子标记的PCR引物以及含有该引物的SNP基因芯片，通过该引物和基因芯片，能够快速的筛选出苹果抗寒株系，提高了育种的效率。[0008]本发明还提供了快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，该方法操作便捷，效率高，耗时短，为苹果抗寒性新种的培育提供了有利的技术支持。[0009]本发明利用抗寒性较强的苹果砧木“60-160”（低温半致死温度-37.42C°与不抗寒矮化砧木“M9”（低温半致死温度-30.05C°构建的杂交群体200株系和简化基因组测序RAD-seq技术，构建高密度遗传图谱。评价图谱构建群体的梯度降温0〜-40°C条件下枝条相对电导率，求得各株系低温半致死温度LethalTemperature，LT5〇。利用构建遗传图谱，开展此低温半致死温度的数量性状位点QTLs定位，鉴定获得年份间稳定存在、与性状连锁性强的SNP遗传标记。根据株系测序结果，确认该SNP遗传标记为位于苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基，为颠换类型:TeG。即本发明苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记简称SNP分子标记，下同）位于苹果参考基因组第4号染色体上，该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个TG颠换类型单核苷酸多态性变异。从LT5q结果看，当第4519417号碱基处为TT基因型时，株系的LT5q表型值低，表示半致死温度更低，抗寒性更强，为GG基因型时，株系的LT5q表型值高，表示半致死温度更高，抗寒性更弱，为TG基因型时，半致死温度介于GG基因型和TT基因型之间，抗寒性也介于这两者之间。因此，通过检测该4519417号碱基处的基因型，可以直接从分子层面获得株系的抗寒性能。[0010]进一步的，为了更方便的通过扩增的方式获取第4519417号碱基处的基因型，将该碱基物理位置上下游各50bp碱基的该段碱基序列作为SNP分子标记，该SNP分子标记的碱基序列为：TAACTCTAGGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATTTAATAATTGTGCCXgTCAGATGAAGCTTAATAAAGCATCTCTTTTCTTGGGCTTCGATGTTTTTA，如SEQIDNO:1所示，在该碱基序列的第51位碱基处存在一个TG颠换类型单核苷酸多态性变异TG等位基因），为51T或51G。[0011]进一步，本发明还提供了用于扩增SEQIDNO:1所示的碱基序列的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物，该引物可用于竞争性等位基因特异性PCR扩增，该引物如下：T等位基因引物Primer_Allele:5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA3’，如SEQIDNO:2所示；G等位基因引物（Primer_Allele:5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC3’，如SEQIDNO:3所示；通用引物（Primer_Common:5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT3’，如SEQIDN0:4所示。[0012]进一步的，上述T等位基因引物和G等位基因引物上都带有荧光标记，但这两种引物上带有的荧光标记种类不同。荧光标记可以是现有技术中常用的荧光标记，例如FAM荧光标记、HEX焚光标记。[0013]本发明还提供了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片（简称SNP基因芯片），该SNP基因芯片上固定有上述苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物，引物共三种。利用该SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定。[0014]本发明的SNP分子标记和SNP基因芯片可以用于苹果育种中，用来筛选抗寒的苹果砧木杂交后代个体。SNP分子标记和SNP基因芯片的使用提供了一种分子辅助育种的新方式，使苹果抗寒性新种的快速筛选成为了可能。本发明SNP分子标记、苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片在苹果育种中的应用也在保护范围之内。[0015]本发明还提供了一种快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，该方法包括以下步骤：1提取苹果基因组DNA，以该DNA为模板，在苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片上进行竞争性等位基因特异性PCR反应；2PCR扩增结束后，将SNP基因芯片进行分析，根据SNP分子标记的基因型判断苹果砧木抗寒性的尚低。[0016]进一步的，竞争性等位基因特异性PCR扩增KASP扩增）的流程在现有技术中有相关记载，本领域技术人员可以按照现有技术进行操作。在本发明具体实施方式中，所用的KASP扩增反应体系为1微升，包含20纳克模板DNA，0.14微升3种引物T等位基因引物、G等位基因引物和通用引物）的混合物，0.5微升Mastermix2x英国LGC公司），ddH20补足1微升。KASP扩增程序为:95°C变性15min，l个循环;95°C变性20s，61°C退火60s，10个循环，退火温度以每循环0.6°C降温;95°C变性20s，55°C退火60s，26个循环。[0017]上述方法中，T等位基因引物作为检测TT基因型的引物，G等位基因引物作为检测GG基因型的引物，这两种引物上分别带有荧光标记。PCR结束后，根据荧光信号强弱判断被检测样本的基因型。[0018]上述方法中，PCR扩增后将芯片进行分析，得到基因型。其中抗寒性高低与基因型关系如下:TT基因型的抗寒性〉TG基因型的抗寒性〉GG基因型的抗寒性。根据所得的基因型，可以选择所需的新种。[0019]本发明利用抗寒性较强的苹果砧木“60-160”（低温半致死温度-37.42C°与不抗寒矮化砧木“M9”（低温半致死温度-30.05C°构建的杂交群体株系和简化基因组测序RAD-seq技术，构建高密度遗传图谱。通过对遗传图谱的分析得到了对苹果砧木抗寒性具有显著影响的SNP单核苷酸多态性）分子标记，依据该分子标记开发了扩增引物及SNP基因芯片，实现了苹果砧木个体抗寒性性状的早期鉴定。本发明这一SNP分子标记和SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定，降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源，为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定了基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。附图说明[0020]图1为本发明“60-160XM9”遗传连锁图谱；图2为本发明试验群体测定的0°C、-20°C、-25°C、-30°C、-35°C、-40°C梯度低温下枝条相对电导率以及低温半致死温度表型的群体频率分布图；图3为本发明“60-160”X“M9”群体低温半致死温度LT5q表型的QTL定位图；图4为本发明苹果砧木抗寒性连锁SNP标记“hkl34”的物理位置及上下游序列图；图5为本发明“60-160”X“M9”群体中不同个体的KASP检测结果图；图6为本发明采用SNPTyper对KASP反应信号的分型结果转化图；图7为采用本发明分子标记对试验群体的基因型分型结果的验证图。具体实施方式[0021]下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的说明，以使本领域技术人员能够更清楚、完整的理解本发明的技术方案。下述说明仅为示例性的，并不对其内容进行限定。[0022]实施例1本发明苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记采用以下方法获得：1、所用试剂和仪器采用PlantGenomicDNAKitTIANGEN试剂盒提取试验群体中个体的基因组DNAgDNA，该试剂盒购自天根生化科技北京有限公司；酶切用限制性内切酶购自美国Sigma-Aldrich公司;酶切样品后处理所需试剂:接头、ATP、连接酶、平末端酶等均购自美国IIlumina公司；测序在北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行，测序使用IIluminaHiseq2500测序平台（美国）。[0023]2、SNP分子标记获取方法1“60-160XM9”遗传连锁图谱构建以苹果抗寒砧木“60-160”（低温半致死温度-37.42C°X不抗寒砧木“M9”（低温半致死温度-30.05C°杂交后代为试材。随机选取200个杂交株系为作图群体。利用植物基因组DNA提取试剂盒PlantGenomicDNAKit进行双亲及株后代的全基因组DNAgDNA提取。提取DNA后，测序文库构建操作步骤描述如下：取500nggDNA样品，利用限制性内切酶fcoW进行酶切。样品65°C预热20min，加入2yLIOOnM的IlluminaPl接头，同时加入IyLIOOnM的“丁？，以1^10陬8缓冲液，141^10001]的了40嫩连接酶和5以1^20，常温反应201^11。再次651€加热20min，超声破碎成平均约500bp的片段。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳，回收300-700bp的片段。[0024]用平末端酶处理DNA样品。18°C纯化样品，并利用15U的Klenowexo在DNA的3’末端加上腺嘌呤。再次纯化样品，加入ΙμΜ的P2接头，反应温度为18°C。再次纯化，获得50yL纯净的DNA。对纯化后的样品进行浓度测定，并进行PCR扩增。扩增后电泳回收片段，稀释后用于测序。构建好RAD测序文库，利用诺禾致源IlluminaHiseq2500测序平台进行测序，测序策略采用pair-end双端测序，测序长度为150bp。[0025]RAD测序得到原始数据，去除接头和低质量序列后用来进行标记的开发。利用测序标签将不同单株的测序数据进行区分，然后对于相似的测序序列进行聚类分析。聚类时mismatch设置为5。舍弃序列支持数_..100的聚类簇（以保证位点分型准确性和防止拷贝数变异）。杂合位点至少需要有5条序列支持，其中次好碱基的支持序列数3。获得SNP位点后，利用孟德尔遗传规律，通过双亲的位点信息删除没有多态性的位点。选择分型类型为ImX11，ηηΧηρ和hkXhk的位点。[0026]用来构建遗传图谱的标记经过以下条件筛选:缺失该标记的单株少于60株约为总群体的20%，标记的卡方检验ImX11，nnXnp类型标记符合预期的1:1分离比，hkXhk类型标记符合1:2:1分离，卡方检验的显著性水平p〈0.01。[0027]筛选得到的标记利用Jionmap4.0作图软件进行遗传连锁图谱绘制，分群阈值设置为L0D=6。利用回归算法，分别构建双亲图谱和整合图谱。利用Kosambi’s函数计算遗传距离，分三轮依次增加标记。作图时，删除存在可以连锁的标记和多重组单株，以确保标记在图谱中的顺序更为准确。[0028]连锁群分群时，有15个标记因为不能加入任何一个连锁群而被删除。进一步经过分离比的卡方检验，30个标记因发生偏分离被舍弃。软件绘图中，141个标记因为与所在连锁群的其他标记连锁不够紧密或是位置不稳定而删除。此外，5个单株因为测序量过小使得它们在超过20%的标记位点缺失分型数据而删除。还有13个单株因为存在多重组现象也被剔除。[0029]最终，绘制完成的整合遗传连锁图谱由182个单株、2240个标记（939个ImX11标记、886个nnXnp标记和415个hkXhk标记组成见图1。标记分布于17条连锁群，根据标记对应参考基因组的物理位置，17条连锁群对应于苹果的17条染色体，各连锁群对应的标记数、遗传距离及标记密度等统计量如表1所示。每个连锁群的标记数量从88到205不等。整合图谱总长为1396.7cM，平均密度为每标记0.62cM。[0030]⑵遗传群体低温半致死温度评价与数量性状位点QTLs定位分别于2015年11月下旬和2016年11月下旬进入休眠期后，采集用于作图的“60-160”X“M9”182个株系和2亲本的1年生枝条用于抗寒性评价。[0031]采集测试株系的1年生枝条先后用自来水、蒸馏水冲洗干净，用石蜡封闭枝条两端的剪口，每种砧木分6份，用干净纱布包好放入塑料袋中，置-40°c的冰箱中人工冷冻处理。设-20°C、-25°C、-30°C、-35°C、-40°C5个低温梯度，以0°C为对照。将样品放在低温保存箱中，降至目的温度后，保持12h，再逐步升温至TC。温度升降速率均为2°Ch。取出后在4°C下放置8h，以备测定用。测定砧木枝条各处理温度下的相对电导率，以Logistic方程拟合，求拐点温度，即为砧木各株系的低温半致死温度LT5qIT5O是评价植物抗寒性的一种高效的数量性状指标，砧木各株系测定的〇°C、-20°C、-25°C、-30°C、-35°C、-40°C梯度低温下枝条相对电导率以及低温半致死温度表型的群体频率分布图见图2,从图中可以看出，各指标表现出连续变异，说明受多基因遗传控制的数量性状，符合QTL定位要求。[0032]利用遗传连锁图谱和作图群体的LT5q表型评价结果，进行QTL定位。利用软件MapQTL6.0，通过区间作图法来检测QTL位点，算法模型釆用混合模型。全基因组范围内QTL位点的显著性阈值为L0D=3.0，p〈0.05。位于LOD峰值的标记为与位点紧密连锁的标记。鉴定到共定位于4号连锁群（1^443.11—47.75〇]«的2个01^:1^201501^.2015和LT2016QTL.2016,此2个QTL在2015和2016两年间稳定存在，其LOD峰值标记均为hkl34,在2015和2016年，该位点LOD值分别为3.84和4.48，其解释表型变异率分别为19.8%和23.6%见图3，确认“hkl34”为与低温半致死温度紧密连锁的分子标记。[0033]3苹果砧木抗寒性连锁SNP标记开发与应用根据株系测序结果，确认“hkl34”连锁SNP标记为位于苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基，SNP为颠换类型：T*G见图4，即第4519417号碱基处为TG等位基因。[0034]依据连锁SNP标记对应的苹果基因组物理位置，下载该标记物理位置上下游各50bp碱基见图4，作为SNP分子标记，其基因序列如SEQIDN0:1所示，同时设计了采用竞争性等位基因特异性PCRKompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP反应扩增该SNP分子标记的PCR引物，引物共三种，序列如下：T等位基因引物Primer_AlleleFAM:5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA3’，如SEQIDNO:2所示，该引物带有FAM荧光标记；G等位基因引物Primer_AlleleHEX:5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC3’，如SEQIDNO:3所示，该引物带有HEX荧光标记；通用引物（Primer_Common:5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT3’，如SEQIDN0:4所示。[0035]实施例2为了高效、快速、准确的检测本发明SNP分子标记，可以将其制成SNP基因芯片。该SNP基因芯片上固定有上述扩增SNP分子标记的PCR引物，基因芯片由美国AffymetriX公司制得。提取试验群体的基因组DNA，在SNP基因芯片上进行KASP反应，扩增SNP分子标记，通过SNP分子标记的基因型快速鉴定试验群体的抗寒性能。具体操作如下：采集182株“60-160”X“M9”作图群体株系，采用植物基因组DNA提取试剂盒PlantGenomicDNAKit，北京天根公司）提取试验群体基因组DNA，在制作的SNP基因芯片上进行KASP反应。KASP扩增反应体系共1微升，包含20纳克模板DNA，0.14微升3种引物T等位基因引物、G等位基因引物和通用引物）的混合物，0.5微升Mastermix2x英国LGC公司），CldH2O补足1微升。用移液器将配制的反应体系注入基因芯片，密封进出口。将基因芯片置于离心托架上，离心速度3000rpm，离心Imin，离心均勾分配到反应孔。而后，将基因芯片放入平板PCR仪北京博奥晶典生物技术有限公司制造上进行扩增，运行扩增程序:95°C变性15min，1个循环;95°C变性20s，61°C退火60s，10个循环，退火温度以每循环0.6°C降温;95°C变性20s，55°C退火60s，26个循环。待PCR扩增程序运行结束后，将基因芯片放入晶芯LuxScan10KD微阵列芯片扫描仪北京博奥晶典生物技术有限公司制造），进行扫描，生成KASP检测结果图，如图5所示，不同显色表示不同基因型。将采集的荧光信号转换成数字信号，生成基因芯片的原始数据，然后再通过分型软件SNPTyper进行分型，根据分型结果即可判定测试群体中各个株系的抗寒性高低。[0036]图6为采用SNPTyper对KASP反应信号的分型结果转化图，显示为3种分型结果:GG、TT和TG，表示参加试验的182个株系可分为上述3种基因型。确定该标记基因型分型结果所对应的表现型LT5q，对试验群体的基因型分型结果进行验证，如图7所示。图中所示的TT、TG、GG所对应的柱状图为该标记芯片对作图群体分型后各基因型的表型值LT5q的四分位数分布图，hh、hk、kk所对应的柱状图为通过测序获得该标记位点的基因型分型结果所对应的表型值的四分位数分布图。根据这两种基因型分型方法分型后所对应的表现型结果来看，这两种方法分型结果一致。并且，采用不同分型方法在该遗传标记位点对群体进行基因型分型，均将试验群体分为3个表型显著差异的类群柱状图上字母a、b、c分别表示在5%水平上差异显著），即高表型值类群、低表型值类群和介于二者之间的中间型类群，其中，TThh基因型株系的LT5q表型值低，表示半致死温度更低抗寒性强），GGkk基因型株系的LT50表型值高，表示半致死温度更高抗寒性弱），TGhk介于二者之间。由此可以看出，采用本发明分子标记对试验群体的基因型分型结果与测序分型结果完全一致，同时实现了试验杂交群体抗寒性的快速、准确的鉴定，降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明分子标记为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源，为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

权利要求：1.一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记，其特征是：该SNP分子标记位于苹果参考基因组第4号染色体上，该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个TG颠换类型单核苷酸多态性变异。2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征是：其碱基序列如SEQIDNO:1所示，在该碱基序列的第51位碱基处存在一个TG颠换类型单核苷酸多态性变异，为51T或51G。3.用于扩增权利要求2所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物，其特征是：T等位基因引物:5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA3’；G等位基因引物:5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC3’；通用引物：5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT3’。4.根据权利要求3所述的PCR引物，其特征是:T等位基因引物和G等位基因引物上均带有荧光标记，这两种引物上的荧光标记不同。5.—种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片，其特征是：所述SNP基因芯片上固定有权利要求3或4所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物。6.权利要求1或2所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、权利要求5所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片在苹果育种中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征是:所述苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记或苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片用于筛选抗寒的苹果砧木杂交后代个体。8.—种快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，其特征是包括以下步骤：1提取苹果基因组DNA，以该DNA为模板，在权利要求5所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片上进行竞争性等位基因特异性PCR反应；2PCR扩增结束后，将SNP基因芯片进行分析，根据SNP分子标记的基因型判断苹果砧木抗寒性的尚低。9.根据权利要求8所述的方法，其特征是:抗寒性高低与基因型关系如下:TT基因型〉TG基因型〉GG基因型。

百度查询： 山东省果树研究所 一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用

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