申请/专利权人：广东东阳光药业有限公司

申请日：2016-06-17

公开（公告）日：2021-06-08

公开（公告）号：CN106282278B

主分类号：C12P21/02(20060101)

分类号：C12P21/02(20060101);C12R1/84(20060101)

优先权：["20150629 CN 2015103685170"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.08#授权;2018.06.15#实质审查的生效;2017.01.04#公开

摘要：本发明属于微生物发酵领域，涉及一种人乳头瘤病毒L1蛋白的发酵方法。本发明通过使用KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，其中诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料，有效降低了毕赤酵母表达人乳头瘤病毒L1蛋白过程中目标蛋白的降解。

主权项：1.一种人乳头瘤病毒L1蛋白的发酵方法，其特征在于，KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，其中诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料；所述甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料的质量比为1:0.85-3；所述诱导阶段的温度控制在25℃-30℃；发酵时间为60-80h；所述诱导阶段的OD600控制在250-350。

全文数据：一种人乳头瘤病毒LI蛋白的发酵方法技术领域[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及为一种适合人乳头瘤病毒LI蛋白的发酵方法。背景技术[0002] 人乳头瘤病毒Humanpapillomavirus，HPV是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。宫颈癌是全球最致命但也是最容易预防的女性癌症类型，HPV感染是罪魁祸首，导致了99%的宫颈癌病例。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。[0003]在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此大多数外源蛋白均面临着被降解的问题。另外，HPV疫苗LI蛋白的分子量较大56KDa且结构复杂，在表达修饰的过程中容易出现结构不稳定的情况，这加剧了LI蛋白降解的程度。目前，发酵培养过程中HPVLI蛋白的降解是行业难点，通常降解率为40%〜60%。降解不仅引起目的蛋白的产率下降，而且其降解形成的片断还能造成分离纯化极大困难。另外，大量的实验表明LI蛋白的降解还对后期病毒样颗粒VLP的组装有较大影响。为避免蛋白酶的降解，不同的策略已经得到应用，如蛋白酶缺陷株、添加蛋白酶抑制剂、蛋白胨等。对于HPV疫苗，很难确定引起LI蛋白降解的相关蛋白酶，甚至可能是多种蛋白酶;另夕卜，LI蛋白结构的稳定性也是引起其降解的重要原因。现有方法对于避免HPV疫苗LI蛋白降解的效果不明显。发明内容[0004]针对现有技术的不足，本发明提供了一种能减少人乳头瘤病毒LI蛋白降解的发酵方法，所述方法使用KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料。[0005]在一些实施方案中，甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料的质量比为1:0.85-3。所述山梨醇溶液为质量浓度为50%的水溶液。[0006] 在一些实施方案中，诱导阶段甲醇溶液中含有一定体积的PTMl溶液，优选地，每升甲醇溶液中含12mlPTMl溶液。[0007]在一些实施方案中，诱导阶段的温度控制在25°C-30°C。[0008] 在一些实施方案中，发酵时间为60_80h。[0009] 在一些实施方案中，诱导阶段的OD6qq控制在250-350。[0010]在一些实施方案中，发酵时的底物培养基为L-GJY发酵培养基，其组份为:甘油15〜25gL，酵母粉3〜7gL，尿素2〜5gL，CaS04.2H200.4〜0.6gL，MgS043〜5gL，K0H8〜10gL，H3P048〜12mlL，PTMl溶液2〜6mlL，消泡剂I〜3mlL。在发酵中，底物培养基可以是本发明使用的L-GJY发酵培养基，也可以是本领域常用的BMGY培养基、BSM培养基，其作用是提供必要的营养物质和缓冲环境。[0011]本发明提供的人乳头瘤病毒LI蛋白的发酵方法，有效降低了LI蛋白降解的问题，为宫颈癌疫苗的生产降低了成本，也为使用酵母表达体系表达LI蛋白提供一套行之有效的办法。具体实施方式[0012]本发明实施例公开了一种人乳头瘤病毒LI蛋白的发酵方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0013]在以下实施例中，所用到的培养基组成为:[0014] BMGY种子培养基:酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，无氨基酵母氮源YNB13.4gL，甘油20gL，溶于0.1moILpH7.0的磷酸缓冲液中。[0015] L-GJY发酵培养基:甘油15〜25gL，酵母粉3〜7gL，尿素2〜5gL，CaS04.2H200.4〜0.6gL，MgS043〜5gL，K0H8〜10gL，H3P048〜12mlL，PTMl溶液2〜6mlL，消泡剂I〜3mlL。[0016] PTMl溶液:C11SO4.5H206gL，KI0.08gL,MnSO4.H2O3gL,Na2MoO4.2H200.2gL，H3B030.02gL，ZnS04.7H2020gL,FeSO4.7H2065gL,CoCl2.6H2O0.5gL，H2SO45111IL,B1tin0.2gLo[0017] 实施例1[0018] I菌种培养:取2mlKM71A11_20的甘油保藏液接入含10mlBMGY种子液培养基的250ml摇瓶中，于30°C、220rmin培养12h。然后分别取2ml上述培养好种子液转接于三个含200mlBMGY二级种子液培养基的500ml摇瓶中，于30°C、220rmin培养18h。[0019] 2接种:向50L发酵罐中注入20LL-GJY发酵培养基，然后按体积比2.5%的接种量接入上述培养好的二级种子液。[0020] 3发酵:①基础生长阶段:初始转速为100rmin，温度控制在30°C，通气量为Ivvm，溶氧控制在50%以上，pH无需控制。②甘油补加阶段:待溶氧反弹至80%时开始以20gLh的速率补加甘油溶液50%，wv，含12mlLPTMl溶液，温度控制在30°C，通气量为1.3vvm，溶氧控制在30%以上，用氨水控制pH在5.0左右。③诱导阶段:当OD6qq=250时，停止补加甘油，待溶氧反弹至80%时开始诱导，以1:0.85的质量比补加甲醇溶液和山梨醇溶液，其中，每升甲醇溶液中含12mlPTMl溶液，山梨醇溶液为质量浓度为50%的水溶液。温度控制在25°C，通气量为1.5vvm，溶氧控制在20%以上，用氨水控制pH在5.0。培养至6011左右时结束。[0021] 4菌体收集:收集放罐时的发酵样品，经处理后测得LI蛋白的表达量为289mgL±5mgL，SDS-PAGE分析并计算出其降解率为8%±2%。[0022] 实施例2[0023] I菌种培养:取2mlKM71A11_20的甘油保藏液接入含10mlBMGY种子液培养基的250ml摇瓶中，于30°C、220rmin培养12h。然后分别取2ml上述培养好种子液转接于三个含200mlBMGY二级种子液培养基的500ml摇瓶中，于30°C、220rmin培养18h。[0024] 2接种:向50L发酵罐中注入20LL_GJY发酵培养基，然后按体积比2.5%的接种量接入上述培养好的二级种子液。[0025] 3发酵:①基础生长阶段:初始转速为100rmin，温度控制在30°C，通气量为Ivvm，溶氧控制在50%以上，pH无需控制。②甘油补加阶段:待溶氧反弹至80%时开始以20gLh的速率补加甘油溶液50%，wv，含12mlLPTMl溶液，温度控制在30°C，通气量为1.3vvm，溶氧控制在30%以上，用氨水控制pH在5.0左右。③诱导阶段:当0D6Q=350时，停止补加甘油，待溶氧反弹至80%时开始诱导，以1:3的质量比补加甲醇溶液和山梨醇溶液，其中，每升甲醇溶液中含12mlPTMl溶液，山梨醇溶液为质量浓度为50%的水溶液。温度控制在30°C，通气量为1.5vvm，溶氧控制在20%以上，用氨水控制pH在5.0。培养至80h左右时结束。[0026] 4菌体收集:收集放罐时的发酵样品，经处理后测得LI蛋白的表达量为295mgL±5mgL，SDS-PAGE分析并计算出其降解率为6%±2%。[0027] 实施例3[0028] I菌种培养:取2mlKM71A11_20的甘油保藏液接入含10mlBMGY种子液培养基的250ml摇瓶中，于30°C、220rmin培养12h。然后分别取2ml上述培养好种子液转接于三个含200mlBMGY二级种子液培养基的500ml摇瓶中，于30°C、220rmin培养18h。[0029] 2接种:向50L发酵罐中注入20LL-GJY发酵培养基，然后按体积比2.5%的接种量接入上述培养好的二级种子液。[0030] 3发酵:①基础生长阶段:初始转速为100rmin，温度控制在30°C，通气量为Ivvm，溶氧控制在50%以上，pH无需控制。②甘油补加阶段:待溶氧反弹至80%时开始以20gLh的速率补加甘油溶液50%，wv，含12mlLPTMl溶液，温度控制在30°C，通气量为1.3vvm，溶氧控制在30%以上，用氨水控制pH在5.0左右。③诱导阶段:当0D6Q=300时，停止补加甘油，待溶氧反弹至80%时开始诱导，以1:1.2的质量比补加甲醇溶液和山梨醇溶液，其中，每升甲醇溶液中含12mlPTMl溶液，山梨醇溶液为质量浓度为50%的水溶液。温度控制在28°C，通气量为1.5vvm，溶氧控制在20%以上，用氨水控制pH在5.0。培养至70h左右时结束。[0031] 4菌体收集:收集放罐时的发酵样品，经处理后测得LI蛋白的表达量为310mgL土5mgL，SDS-PAGE分析并计算出其降解率为5%±2%。

权利要求：1.一种人乳头瘤病毒LI蛋白的发酵方法，其特征在于，KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，其中诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料的质量比为1:0.85-3。3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述甲醇溶液中含有一定体积的PTMl溶液。4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，每升所述甲醇溶液中含12ml PTMl溶液。5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述山梨醇溶液为质量浓度为50 %的水溶液。6.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，诱导阶段的温度控制在25°C-30°C。7.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，发酵时间为60-80h。8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，诱导阶段的OD_控制在250-350。9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，发酵时的底物培养基选自L-G JY发酵培养基、BMGY培养基、BSM培养基中的一种。10.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，发酵时的底物培养基为L-G JY发酵培养基，其组份为:甘油15〜25gL，酵母粉3〜7gL，尿素2〜5gL，CaS04.2H200.4〜0.6gL，MgSO43〜5gL，K0H8〜10gL，H3P048〜12mlL，PTMl溶液2〜6mlL，消泡齐丨」1〜3mlL。

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