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【发明授权】红细胞的凝集方法和分离方法以及红细胞凝集用试剂_电化株式会社_201780061966.8 

申请/专利权人:电化株式会社

申请日:2017-10-04

公开(公告)日:2021-06-08

公开(公告)号:CN110073211B

主分类号:G01N33/48(20060101)

分类号:G01N33/48(20060101)

优先权:["20161005 JP 2016-196963"]

专利状态码:有效-授权

法律状态:2021.06.08#授权;2019.08.23#实质审查的生效;2019.07.30#公开

摘要:本发明提供可从血液试样使红细胞瞬间地以充分的尺寸凝集,可从血液试样完全地分离红细胞的、红细胞的凝集方法和分离方法以及红细胞凝集用试剂。本发明的红细胞的凝集方法包括在血液试样中添加含有胆酸系表面活性剂和酸的溶液。另外,本发明的红细胞的分离方法包括分离通过上述本发明的方法凝集的红细胞。此外,本发明的红细胞凝集用试剂含有胆酸系表面活性剂和酸。

主权项:1.红细胞的凝集方法,所述方法包括在血液试样中添加含有胆酸系表面活性剂和酸的溶液,上述溶液的pH值为2.5~4.0,上述溶液中上述胆酸系表面活性剂的浓度为0.1~6.0重量%。

全文数据:红细胞的凝集方法和分离方法以及红细胞凝集用试剂技术领域本发明涉及红细胞的凝集方法和分离方法以及红细胞凝集用试剂。背景技术血液被用于各种疾病的诊断或治疗的判定,由红细胞、白细胞和血小板等血细胞成分及作为液体成分的血浆构成。该血液中含有的血浆液体成分或从血液除去血细胞成分和纤维蛋白得到的血清含有蛋白质、糖类、脂质等维持生物体功能所需要的各种成分,可用作用于进行内脏系统疾病等的诊断或治疗的生物化学检查用的分析用试样。但是,若在进行生物化学检查时血细胞成分存在于分析用试样中,则有血细胞成分妨碍检查的情况,特别是在利用比色分析等来进行生物化学检查的情况下,有红细胞对试样的颜色或浊度造成影响而妨碍检查的情况。因此,在生物化学检查中,将预先从全血试样分离红细胞等血细胞成分得到的血浆或血清用作分析用试样。作为将血细胞成分与血浆或血清分离的方法,采用以下方法:将使用采血针从患者采血得到的血液放入采血管中,将含有血液的采血管置于离心分离机中进行离心分离。但是,使用上述离心分离机的分离有需要长时间,操作繁杂等问题,需要更简便的分离方法。另外,作为离心分离以外的分离方法,有使用血细胞分离膜、血细胞分离材料、称作中空丝的特殊过滤器的方法。例如,报道了使用由固相层支持体粒子、固相层支持体粘合剂膜、红细胞凝集素构成的过滤器,从全血样品分离红细胞,生成血浆的方法专利文献1。但是,在使用这些过滤器的情况下,滴加的血液试样在过滤器内浸透并扩散,导致血浆或血清残留在过滤器中。因此,在血液试样为少量的情况下,分离红细胞后的血浆或血清的量变少,有无法得到充分进行生物化学检查的量的分析用试样的问题。此外,由于在分离操作的过程中对过滤器施加一定的压力,所以有产生溶血,或血液飞散等问题。作为从全血除去红细胞的其它方法,报道了在可有效地使红细胞凝集的条件下,使含有选自乙酸、枸橼酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、苹果酸和丙二酸的酸的溶液与全血试样接触,接着使用纤维状材料过滤的方法专利文献2。另一方面,报道了作为表面活性剂的一种的胆酸系表面活性剂为用于膜蛋白质的提取或分离的阴离子型表面活性剂,例如在使用具备生物传感器的装置来测定血红蛋白浓度时,将胆酸系表面活性剂用作为溶血剂专利文献3。但是,到目前为止未报道过在使红细胞凝集时使用胆酸系表面活性剂的实例。现有技术文献专利文献专利文献1:美国专利第5981294号专利文献2:美国专利第5118428号专利文献3:日本特开2014-102143。发明内容发明所要解决的课题如上所述,在目前的利用离心分离法或特殊的过滤器的红细胞的分离法中,操作需要长时间且复杂,或有溶血或血液飞散的问题。另外,即使在使用酸来使红细胞凝集的方法专利文献2的情况下,由于所凝集的红细胞的尺寸小,所以红细胞的分离不完全,作为用于生物化学检查的分析用试剂而言不充分。本发明鉴于上述情况而完成的,其目的在于,提供可从血液试样使红细胞瞬间地以充分的尺寸凝集,可从血液试样完全地分离红细胞的、红细胞的凝集方法和分离方法以及红细胞凝集用试剂。用于解决课题的手段本发明人反复深入研究,结果发现,在使血液试样中的红细胞凝集的方法中,通过在血液试样中添加同时含有酸和胆酸系表面活性剂的溶液,与目前的只添加酸的红细胞凝集法相比,可瞬间地凝集充分的尺寸的红细胞,从而完成了本发明。胆酸系表面活性剂目前作为溶血剂为人所知,但在使红细胞凝集时,通过在血液试样中添加将胆酸系表面活性剂与酸组合而含有的溶液,可不发生溶血,而使红细胞瞬间地以充分的尺寸凝集,这是目前无法预料到的事实。即,本发明提供红细胞的凝集方法,所述方法包括在血液试样中添加含有胆酸系表面活性剂和酸的溶液。另外,本发明提供从血液试样分离红细胞的方法,所述方法包括分离通过上述本发明方法凝集的红细胞。此外,本发明提供含有胆酸系表面活性剂和酸的红细胞凝集用试剂。此外,本发明提供本发明的试剂作为用于使红细胞凝集的试剂的应用。发明效果通过采用本发明的方法和试剂,可从血液试样瞬间地凝集充分的尺寸的红细胞,即使不采用如目前的利用长时间的离心分离或特殊的过滤器的分离方法,也可完全地分离红细胞,可容易且简便地将含有血清和血浆的成分与红细胞分离。附图简述[图1]是表示在比较例1-1、比较例1-2和实施例1中进行的红细胞凝集确认实验的结果的照片。[图2]是表示在比较例2-1、比较例2-2和实施例2中进行的红细胞凝集确认实验的结果的照片。[图3]是表示在比较例3-1、比较例3-2和实施例3中进行的红细胞凝集确认实验的结果的照片。[图4]是表示在比较例4-1、比较例4-2和实施例4中进行的红细胞凝集确认实验的结果的照片。具体实施方式本发明所涉及的红细胞的凝集方法的特征在于,在血液试样中添加含有胆酸系表面活性剂和酸的溶液。血液试样在本发明中,血液试样为从人或动物的受试者通过采血取得的含有红细胞的试样。作为血液试样,可直接使用从受试者采血得到的全血,或可使用将采集的全血用生理盐水等稀释得到的试样,但从操作的简便性的观点出发,优选直接使用从受试者采血得到的全血。在本发明的方法中使用的血液试样的量通常为10μl~50ml,优选为望ましくは10μl~1ml,更优选为10μl~100μl。胆酸系表面活性剂本发明中使用的胆酸系表面活性剂为分子内具有类固醇骨架的表面活性剂,具体而言为具有胆酸或胆酸衍生物的结构的表面活性剂。在这里,胆酸衍生物是指由胆酸衍生的所有的化合物,具体而言,可列举出脱氧胆酸等脱羟基化合物、牛磺脱氧胆酸等取代酰胺化合物等。本发明中使用的胆酸系表面活性剂优选为选自胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸钠、甘氨胆酸、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸钠、甘氨石胆酸、甘氨石胆酸钠、石胆酸、石胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺胆酸钠、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸钠等阴离子型表面活性剂,聚氧乙烯胆甾醇醚、N,N-双3-D-葡糖酰氨基丙基胆酰胺N,N-Bis[3-D-gluconamidopropyl]cholamideBIGCHAPS等非离子型表面活性剂,硫酸-3-[3-胆酰氨基丙基二甲基铵基]-1-丙烷CHAPS等两性型表面活性剂,或它们的水合物的化合物。这些胆酸系表面活性剂可单独使用或组合使用2种以上。作为胆酸系表面活性剂,其中从凝集速度和红细胞更完全的分离的观点出发,优选胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠及它们的水合物等阴离子型胆酸系表面活性剂,特别优选牛磺脱氧胆酸钠及其水合物。酸作为本发明中使用的酸,只要是在水溶液中产生氢离子H+的物质即可。具体而言,可列举出无机酸和有机酸以及它们的盐。作为无机酸,可列举出盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等。作为有机酸,例如可列举出乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、丙二酸、抗坏血酸、巴莫酸、马来酸、己二酸、海藻酸、天冬氨酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸盐、半氨基磺酸hemisulfanicacid、庚酸、己酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、果胶酯酸、磷酸、硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、双硫酸、十二烷基硫酸、乙磺酸和十一烷酸等。在本发明中酸可单独使用或组合使用2种以上。作为本发明中使用的酸,从凝集速度和红细胞更完全的分离的观点出发,优选有机酸,其中优选选自乙酸、酒石酸、丙二酸、苹果酸和枸橼酸的有机酸,进一步优选多元羧酸,特别优选枸橼酸。红细胞凝集用试剂在本发明中,通过在血液试样中添加含有上述胆酸系表面活性剂和酸的溶液,使红细胞凝集。添加于血液试样中的含有这样的胆酸系表面活性剂和酸的溶液,可用作用于使红细胞凝集的试剂红细胞凝集用试剂。含有这样的胆酸系表面活性剂和酸的溶液以下记为“红细胞凝集试剂”可通过在用生理盐水等稀释酸得到的酸水溶液中添加胆酸系表面活性剂的方法等来调制。另外,从凝集速度和红细胞更完全的分离的观点出发,作为红细胞凝集试剂中的酸的浓度,通常为1mM~1M,优选5mM~500mM,更优选10mM~200mM,红细胞凝集试剂的pH值优选2.0~5.0,更优选2.2~4.5,进一步优选2.5~4.0。在这里,红细胞凝集试剂的pH值可使用基于玻璃电极法的市售的pH计来测定。在红细胞凝集试剂中,除了上述酸、胆酸系表面活性剂、生理盐水以外,还可含有不溶血的表面活性剂例如Tween20或EmulgenエマルゲンA500等的表面活性剂或试剂等。红细胞凝集试剂中的胆酸系表面活性剂的浓度通常为0.05~15.0重量%,优选0.06~13.0重量%,更优选0.075~8.0重量%,特别优选0.1~6.0重量%。从凝集速度和红细胞更完全的分离的观点出发,红细胞凝集试剂中的胆酸系表面活性剂与酸的比例摩尔比通常为1:7~1:2000,优选1:8~1:1667,更优选1:13~1:1333,特别优选1:17~1:1000。红细胞凝集试剂相对于所使用的血液试样的添加量体积比通常为1:4~1:80,优选为1:8~1:20,更优选为1:10~1:13。红细胞的凝集方法在本发明中,如果在室温下直接在血液试样中添加上述红细胞凝集试剂,则红细胞瞬间地凝集为充分的尺寸,但为了更完全地进行凝集,可在使血液试样与红细胞凝集试剂接触的状态下,静置5秒~30秒、优选5秒左右后,颠倒混合数次。通过如上操作使红细胞凝集,可得到具有充分的尺寸的凝集物。由于采用本发明的方法和试剂凝集的红细胞具有充分的尺寸,所以可容易且简便地从血液试样分离。作为所凝集的红细胞的分离方法,可列举出回收红细胞凝集物沉淀后的上清液的方法或通过使用滤纸的过滤来分离的方法。由于如上操作分离红细胞后的血清成分和血浆成分实质上不含有红细胞,所以可用作生物化学检查用的分析用试样。实施例以下,基于实施例来更具体地说明本发明。但是,本发明并不限定于下述实施例。实施例1~4、比较例1-1~4-2基于胆酸系表面活性剂和盐的有无与pH值范围的红细胞凝集在71mL的蒸馏水中加入10mL的10%wv牛磺脱氧胆酸钠水合物TDOC和10mL的1M枸橼酸、9mL的10%wv氯化钠,调制终浓度为100mM枸橼酸、1%TDOC、0.9%氯化钠的溶液红细胞凝集用试剂。另外,同样地调制不添加TDOC和或氯化钠的溶液红细胞凝集用试剂,比较胆酸系表面活性剂和盐的有无与pH值范围对红细胞凝集造成的影响。在400μL的红细胞凝集用试剂中添加60μL的全血样品,通过目视确认红细胞的凝集速度。凝集速度根据如下所述的标准,按快慢顺序记为+++>++>+>±,在未凝集而溶血的情况下记为-。+++:红细胞瞬间地凝集为充分的尺寸,红细胞的凝集物沉淀++:红细胞在静置数秒后开始凝集,红细胞的凝集物逐渐沉淀+:虽然发生红细胞的凝集,但凝集物微小,凝集不完全±:红细胞的凝集非常少-:未凝集而溶血将结果示于下述表1中。需说明的是,红细胞凝集用试剂的pH值使用HORIBA台式pH计来测定在以下的实施例和比较例中同样。[表1]根据表1的结果,在红细胞凝集用试剂含有胆酸系表面活性剂和酸的情况下,在pH值为2.5~5.0的范围内,无论有无NaCl,凝集速度均为“+++”,可见优异的凝集效果。另一方面,在红细胞凝集用试剂不含有胆酸系表面活性剂、而只含有酸或只含有酸和盐的情况下,凝集速度为“-”或“+”,产生溶血,或即使发生红细胞的凝集,但凝集物微小,凝集不完全。根据该结果可知,在红细胞的凝集中,胆酸系表面活性剂的存在会带来很大的影响。实施例5~7基于胆酸系表面活性剂和酸的红细胞凝集在生理盐水中添加各种胆酸系表面活性剂1重量%和枸橼酸100mM来调制红细胞凝集用试剂pH3.0,比较红细胞的凝集能力。在400μL的红细胞凝集用试剂中添加60μL的全血样品,确认红细胞的凝集速度。凝集速度根据如下所述的标准,按快慢顺序记为+++>++>+>±,在未凝集而溶血的情况下记为-。需说明的是,以下的标准与上述实施例1~4和比较例1-1~4-2的标准相同。+++:红细胞瞬间地凝集为充分的尺寸,红细胞的凝集物沉淀++:红细胞在静置数秒后开始凝集,红细胞的凝集物逐渐沉淀+:虽然发生红细胞的凝集,但凝集物微小,凝集不完全±:红细胞的凝集非常少-:未凝集而溶血将结果示于下述表2中。[表2]表面活性剂凝集速度实施例5脱氧胆酸++实施例6胆酸钠++实施例7牛磺脱氧胆酸钠水合物TDOC+++根据表2的结果可知,即使在红细胞凝集用试剂同时含有酸和各种胆酸系表面活性剂的情况下,凝集速度也为“++”或“+++”,得到了优异的凝集效果。特别是牛磺脱氧胆酸钠水合物TDOC的红细胞凝集效果最为显著。实施例8基于胆酸系表面活性剂的浓度的红细胞凝集在生理盐水中添加牛磺脱氧胆酸钠水合物TDOC和枸橼酸100mM来调制红细胞凝集用试剂pH3.0,对于下述表中示出的TDOC的浓度范围,比较红细胞的凝集能力。在400μL的红细胞凝集用试剂中添加60μL的全血样品,确认红细胞的凝集速度。凝集速度根据以下的标准,按快慢顺序记为+++>++>+>±,在未凝集而溶血的情况下记为-。需说明的是,以下的标准与上述实施例1~7和比较例1-1~4-2的标准相同。+++:红细胞瞬间地凝集为充分的尺寸,红细胞的凝集物沉淀++:红细胞在静置数秒后开始凝集,红细胞的凝集物逐渐沉淀+:虽然发生红细胞的凝集,但凝集物微小,凝集不完全±:红细胞的凝集非常少-:未凝集而溶血将结果示于下述表3中。[表3]TDOC浓度重量%凝集速度6.0+++1.0+++0.5+++0.1+++根据表3的结果可知,在胆酸系表面活性剂的浓度为0.1~6.0重量%的情况下,凝集速度为“+++”,得到了优异的凝集效果。另外,在上述实施例1~4中分离红细胞凝集物沉淀后的上清液,将该分离的上清液滴加至免疫层析试剂盒QuickNavi注册商标-Ebola,观察膜上的移动时,膜未着色为红色。根据该结果也可证明上述分离后的上清液实质上不含有红细胞,适合作为生物化学检查用的分析用试样。

权利要求:1.红细胞的凝集方法,所述方法包括在血液试样中添加含有胆酸系表面活性剂和酸的溶液。2.权利要求1所述的方法,其中,上述溶液的pH值为2.5~4.0。3.权利要求1或2所述的方法,其中,上述胆酸系表面活性剂为牛磺脱氧胆酸钠水合物。4.从血液试样分离红细胞的方法,所述方法包括分离通过权利要求1~3中任一项所述的方法凝集的红细胞。5.红细胞凝集用试剂,所述试剂含有胆酸系表面活性剂和酸。6.权利要求5所述的试剂,其中,上述试剂的pH值为2.5~4.0。7.权利要求5或6所述的试剂,其中,上述胆酸系表面活性剂为牛磺脱氧胆酸钠水合物。8.权利要求5~7中任一项所述的试剂作为用于使红细胞凝集的试剂的应用。

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