申请/专利权人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所

申请日：2018-09-26

公开（公告）日：2021-06-08

公开（公告）号：CN109234193B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);A01N63/20(20200101);A01P1/00(20060101);A01P3/00(20060101);A01P21/00(20060101);C05F11/08(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.08#授权;2019.02.19#实质审查的生效;2019.01.18#公开

摘要：本发明公开了水生拉恩氏菌ZF7及其在植物促生防病中的应用。本发明提供了水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7，其保藏号为CGMCCNO.16014。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在抑菌中的应用也是本发明保护的范围。本试验结果为水生拉恩氏菌用于根癌病病害的防治提供了理论依据,今后将进一步研究该菌株抗菌物质的分离纯化、抗菌防病作用机理和田间防效,以期将该菌株更好地应用于生物防治。菌株ZF7具有较好的环境稳定性，其在向日葵及大白菜根际土壤的定殖能力强，表明菌株ZF7具有较好的生防应用前景。

主权项：1.水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7，其保藏号为CGMCCNO.16014。

全文数据：水生拉恩氏菌ZF7及其在植物促生防病中的应用技术领域本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种水生拉恩氏菌ZF7及其在植物促生防病中的应用。背景技术在植物根部，当植物根际促生菌Plant-Growth-PromotingRhizobacteria,PGPR与宿主互作时，PGPR以高密集群体定殖并促进植物生长。作为生存于作物根系周围的自生型植物有益细菌，PGPR不但能促进植物生长，而且具有控制病害发生的功能，可以为可持续农业发展提供新的途径。PGPR促进植物生长通常被分为直接促生和间接促生两种不同方式。直接促生菌能直接提供植物所短缺的营养物质来促进植物的生长和代谢，如产生植物激素生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯等、固氮、溶磷、维生素及铁载体产生等。间接促生菌则通过预防有害的植物病原微生物侵染，诱导植物的防卫反应，增强植物的健康，从而间接地促进植物生长。水生拉恩氏菌作为植物促生菌之一，在植物促生防病方面发挥了重要作用。李桂娥等从马尾松的根际土壤中分离获得1株根际促生细菌水生拉恩氏RahnellaaquatilisJZ-GX1，并发现该菌对松树和杨树表现出显著的促生作用。研究还发现菌株JZ-GX1及其诱变菌株JZ-GX1-2和JZ-GX1-10能够有效降解植酸盐，对马尾松苗具有促生作用。宋芳旭等发现水拉恩氏菌JZ－GX1菌体对杨树溃疡病菌金黄壳囊孢Cytosporachrysosperma和拟茎点霉Phomopsissp.具有明显的抑菌效果。HodaH.El-Hendawy等发现经水生拉恩氏菌处理过的番茄种子对野油菜黄单胞菌的敏感性降低，同时能起到促生的效果。焦子伟等发现水生拉恩氏菌HX2能合成吡咯喹啉醌PQQ和吲哚乙酸IAA，这些物质能促进玉米生物量的增加,提高玉米营养的摄入。梁志宏等发现土壤杆菌E26对葡萄根癌具有良好的防效，同时表明细菌素的产生是一个比较稳定的性状。水生拉恩氏菌HX2对根癌土壤杆菌Agrobacteriumtumefaciens，发根土壤杆菌A.rhizogenes，葡萄土壤杆菌A.vitis及水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae、棉花细菌性角斑病菌Xanthomonascampestrispv.malvacearum等21种病原菌具有广谱抑制效果，特别是对根癌病具有良好的防效。菌株HX2菌体和上清液对冠瘿瘤的形成均有不同程度的抑制作用，但发酵液上清液的防效优于菌体的防效。发明内容本发明的一个目的是提供水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7。本发明提供的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7，其保藏号为CGMCCNO.16014。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在抑菌中的应用也是本发明保护的范围。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备植物生防制剂中的应用也是本发明保护的范围。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在防治植物病害中的应用也是本发明保护的范围。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在防治植物根癌病中的应用也是本发明保护的范围。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在促进植物生长中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述病害为病原菌引发的病；所述病原菌或所述抑菌的菌为真菌或细菌；和或，所述真菌为番茄早疫病Alternariasolani、番茄灰叶斑病菌StemphyliumsolaniWeber、辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici、黄瓜棒孢叶斑病菌Corynesporacassiicola和立枯丝核菌Rhizoctoniasolani中至少一种；和或，所述细菌为番茄溃疡病菌Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis、番茄斑点病菌Pseudomonassyringaepv.tomato、花椰菜黑腐病菌Xanthomonascampestrispv.campestris、黄瓜角斑病菌Pseudomonassyringaepv.lachrymans、黄瓜茎软腐病菌Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliense、葡萄根癌病菌Agrobacteriumvitis中至少一种。上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在降解磷无机磷中的应用也是本发明保护的范围；或，上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备IAA中的应用也是本发明保护的范围。本发明另一个目的是提供一种防治植物根癌病的方法。本发明提供的方法，为将上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用植物，实现防治植物根癌病。本发明第3个目的是提供一种促进植物生长的方法。本发明提供的方法，为将上述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用植物，实现促进植物生长。本发明的实验证明，水生拉恩氏菌ZF7是从樱花根际土壤分离得到的一株对根癌病具有良好拮抗效果，同时对植物具有促生作用的生防菌株。该菌株能够溶磷、产激素，从而表现出对大白菜的促生效果。同时对葡萄根癌病具有良好的防效。植物根际促生菌通过矿物质溶解、植物生长素释放、固氮作用等途径发挥促生效果。有研究表明溶磷菌溶解矿质磷的主要机制是经在细胞质膜外部发生直接氧化反应产生有机酸，并且伴随pH值的下降，导致磷的溶解。本研究通过试验发现菌株ZF7具有良好的溶磷效果，溶磷直径达28.21。同时检测了40h内菌株ZF7的PH值变化，随着时间增加，菌株ZF7的PH值逐渐降低，在16h时，达到最低值：3.59。IAA刺激植物细胞增生并扩大面积，分泌出促进细菌生长的营养物质。本研究发现，菌株对幼苗地上部的长度和根长的促生率分别达56.47％、54.74％、对大白菜地上部的重量及根重的促生率达233.84％和164.71％，具有良好的促生效果，这与已报道的水生拉恩氏菌的促生研究结果基本一致。本研究还发现菌株ZF7对葡萄根癌病具有良好的防效，对向日葵根癌病的的防治效果为94.52％，与菌株HX2没有显著性差异。同时，菌株ZF7对黄瓜细菌性角斑病等10种设施蔬菜病害表现出很强的抑制作用，表明菌株ZF7也能够产生某些高效的抑菌物质。但是，关于抑菌物质及种类还需进一步分析。本试验结果为水生拉恩氏菌用于根癌病病害的防治提供了理论依据,今后将进一步研究该菌株抗菌物质的分离纯化、抗菌防病作用机理和田间防效,以期将该菌株更好地应用于生物防治。菌株ZF7具有较好的环境稳定性，其在向日葵及大白菜根际土壤的定殖能力强，表明菌株ZF7具有较好的生防应用前景。保藏说明菌种名称：水生拉恩氏菌拉丁名：Rahnellaaquatilis菌株编号：ZF7保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2018年6月28日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.16014附图说明图1为菌株ZF7基于16srDNA序列的系统进化树。图2为菌株ZF7的生长速率A和pH变化B。图3为菌株ZF7对不同病原菌抑菌情况。图4为菌株ZF7A、HX2B在NBRIP培养基上的溶磷圈。图5为菌株ZF7、HX2在DF+、DF培养基中与溶液SolutionⅠ、SolutionⅡ反应现象。图6为菌株ZF7、HX2及IAA不同量对大白菜的促生效果。图7为菌株ZF7、HX2及IAA对大白菜的促生效果。图8为菌株ZF、HX2温室防治葡萄根癌病效果检测。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。水生拉恩氏菌HX2由中国农业大学资源与环境学院郭岩彬副教授提供。水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisHX2菌株已在文献“焦子伟、位婉、李磊、张相锋、郭岩彬.PQQ和IAA促生因子对RahnellaaquatilisHX2菌株促生机理.新疆农业科学2017，545:907-917.”中公开，公众可从中国农业大学资源与环境学院获得；也可从申请人获得。向日葵品种巴葵118购自甘肃先农国际农业发展有限公司、白菜北京新3号由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。下述实施例中供试培养基如下：胰蛋白胨液体培养基LB：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，蒸馏水1000mL。胰蛋白胨固体培养基LB：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。马铃薯葡萄糖培养基PDA：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。水琼脂培养基WA：琼脂5g，蒸馏水1000mL。分装5mL试管。蛋白胨牛肉粉液体培养基NB：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。蛋白胨牛肉粉培养基NA：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0。土壤杆菌选择性培养基MW：甘露醇10g，生物素100ug，0.1％结晶紫2mL，0.1％Fe-EDTA2mL，硝酸钠NaNO35g，磷酸氢二钾K2HPO40.3g，NaCl0.2g，硫酸镁MgSO4·7H2O0.1g，琼脂12g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。DFDworkinandFoster基本培养基1L：蛋白胨5.0g，酵母提取物1.5g，牛肉膏1.5g，NaCl5.0g，pH7.0。NBRIP固体培养基：葡萄糖10g，磷酸三钙Ca3PO425g,，氯化镁MgCl2·7H2O5g，硫酸镁MgSO4·7H2O0.25g，氯化钾KCl0.2g，硫酸铵NH42SO40.1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0。实施例1、菌株ZF7分离、纯化和鉴定1、菌株ZF7分离该菌株分离自樱花根际土壤，采集土样后，采用平板稀释法，将1g土壤加入99mL,蒸馏水中，制备土壤悬浊液，涂布于MW培养基上，28℃培养24h。挑取单菌落于MW平板划线纯化，28℃培养48h，4℃冰箱保存备用。2、菌株ZF7的鉴定将上述筛选的菌株ZF7进行如下鉴定：1菌株ZF7形态观察和生理特性测定将分离菌株划线接种于LB培养基，28℃培养48h，观察该菌株的菌落形态。依据《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌系统鉴定手册》，28℃培养24～48h后，对生理生化特征按进行鉴定。2Biolog微生物自动鉴定系统鉴定使用BIOLOGGENIII试剂盒按照试剂盒说明书操作测定唯一碳源利用。所有仪器耗材皆为Biolog公司产品。菌株ZF7在LB培养基上呈乳白色、半透明，菌落周围湿润，较老的菌落10d以后中心呈浅红色。革兰氏染色后菌体呈红色，为阴性菌，长杆状，长径约为4μm，短径约为1μm，两端呈圆形。根据《常见细菌系统鉴定手册》检测菌株ZF7的生理生化反应表1。菌株ZF7为革兰氏阴性杆菌，发酵葡萄糖产酸产气，氧化酶阴性，接触酶阳性，为典型的肠杆菌科菌株。菌株ZF7菌株能利用N-乙酰基-D-葡萄糖胺、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-纤维二糖等45种碳源，不能利用N-乙酰基-D半乳糖胺、赤藻糖醇、木糖醇等44种碳源。表1菌株ZF7的生理生化特征3、分子鉴定采用细菌DNA试剂盒提取菌株ZF7的DNA，将其作为PCR反应的模板DNA，引物采用细菌16SrDNA通用引物:上游引物PrimerA:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物PrimerB:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应条件:95℃预变性10min；95℃变性30s、55℃引物复性30s、72℃延伸45s，34个循环；最后72℃延伸8min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以DNAMarkerBM5000为对照检测产物分子量。得到了1条1376bp的16SrDNA目的条带，经过测序，16SrDNA的核苷酸序列为序列1。采用MEGA6.0软件中的最大似然法构建菌株ZF7与其他相近菌株之间的进化树，16SrDNA鉴定特征及系统发育树图1，发现菌株ZF7与水生拉恩氏菌Rahnellaaquatilis亲缘性达到100％。结合形态特征观察以及生理生态特征分析，基本确定菌株ZF7为肠杆菌科拉恩氏菌属水生拉恩氏菌R.aquatilis。将菌种ZF7于2018年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.16014，分类命名为水生拉恩氏菌。4、菌株ZF7生长速率及pH值测定将菌株ZF7接种在液体PD培养基中，28℃下振荡培养16h。将培养16h的菌悬液加入PD培养基中，统一初始OD值为0.8OD600，共设置3个重复，放置28℃摇床培养。每隔4小时测1次，共测11个点，记录每次测得OD值及pH值。菌株ZF7生长曲线及pH变化曲线如图2所示。菌株ZF7在12h前处于指数增长期，12h时吸光度到达0.64，24h后进入稳定增长期。PH值随着时间增加逐渐降低，在16h时pH值达到3.58，并保持稳定。5、菌株Z7抗生素测定1不同抗生素耐药性测定将氨苄青霉素Ampicillin、羧苄青霉素Carbenicillin、万古霉素Vancomycin、氯霉素Chloramphenicol、庆大霉素Gentamicin、四环素Tetracycline、壮观霉素Spectinomycin、卡那霉素Kanamycin、链霉素Streptomycin9种抗生素以0.1％比例接入4mL的液体LB培养基中。挑取菌株ZF7单菌落，接种到4mL加有不同抗生素的液体LB培养基中，28℃摇荡培养24h。2不同浓度氨苄青霉素耐药性测定将浓度为50、100、150、200、250、300、350、400μg·ml-1的氨苄青霉素以0.1％比例接入4mL的液体LB培养基中。挑取菌株ZF7单菌落，接种到4mL加有不同浓度的氨苄青霉素的液体LB培养基中，28℃摇荡培养24h。菌株ZF7可以耐受氨苄青霉素、羧苄青霉素以及万古霉素；最高可以耐受250μg·ml-1的氨苄青霉素。将测定结果进行拟合曲线，并计算得出致死终浓度EC50为238.58μg·ml-1。实施例2、菌株ZF7的功能研究一、菌株ZF7在抑菌中的应用1、菌株ZF7真菌抑菌谱的测定采用平板对峙法，在90mmPDA平板中心分别接种5mm所选取的真菌靶标菌片，25℃下培养2d。将菌株ZF7接种在液体LB培养基中，28℃下振荡培养16h。在距离培养皿边缘10mm处相对的4点用10μL打孔，在其中加入5μLZF7菌悬液，以接种液体LB培养基为空白对照，25℃下培养5d。待空白对照即将长满整个培养皿时，测量靶标菌的对照生长量菌落半径和处理生长量接种细菌后的生长半径，用抑菌率表示。抑菌率％＝对照生长量-处理生长量对照生长量×100％病原真菌出处如下：辣椒疫病菌Phytophthoracapsici已在文献“江厚春、李宝聚、石延霞、谢学文、吕国华.辣椒疫病土壤和种子带菌的初步研究.华北农学报2011,26增刊：233-237.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。黄瓜棒孢叶斑病菌Corynesporacassiicola已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011,383：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。番茄早疫病菌Alternariasolani已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30增刊：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。番茄灰叶斑病菌StemphyliumsolaniWeber已在文献“李宝聚、周艳芳、李金萍、谢学文.番茄匍柄霉叶斑病灰叶斑病的诊断与防治.中国蔬菜2010，23：24-26.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。立枯丝核菌Rhizoctoniasolani已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜2008，6：9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。茄病镰刀菌Fusariumsolani已在文献“贲海燕、石延霞、谢学文、柴阿丽、李宝聚.氰氨化钙土壤消毒对黄瓜根腐病及土壤病原菌的控制效果.园艺学报2016，4311：2173-2181.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。2、细菌抑菌谱测定采用Stonie双层培养法，将菌株ZF7接种在液体LB培养基中，25℃下振荡培养16h。在90mmPDA平板中心，用10μL枪头打孔，在其中加入5μLZF7菌悬液，以接种液体LB培养基为空白对照，25℃下培养24h。将培养皿倒置，在通风橱中将每个培养皿里加入3mL氯仿，静置12h以蒸干氯仿并灭活ZF7菌株。将选取的病原细菌在25℃下NB培养基中振荡培养36h，在4mL5％mvWA培养基中加入100μL菌悬液，混匀后倒入PDA平板，作为上层。培养箱中培养48h，观察并测量抑菌圈大小。病原细菌出处如下：黄瓜细菌性茎软腐病菌Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliense已在文献“冯志琴.胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliense引起的黄瓜细菌性软腐病在中国发生.中国植保导刊2017,377：58-62.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。黄瓜细菌性角斑病菌Pseudomonassyringaepv.lachrymans已在文献“石延霞、张楠、李宝聚.细菌性角斑病病菌诱导黄瓜产生系统抗病性机理的研究.园艺学报2008，352：221-226.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。番茄细菌性叶斑病菌Pseudomonassyringaepv.tomato已在文献“李宝聚、朱辉、石延霞.番茄细菌性斑点病的识别与防治.长江蔬菜2008,9:23-24.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。葡萄根癌病菌Agrobacteriumvitis已在文献“李金云、王慧敏、王建辉.根癌病生防菌E26菌株产生细菌素的初步研究.中国农业科学2004，3712：1860-1865.”中公开，公众可从中国农业大学资源与环境学院获得。花椰菜黑腐病菌Xanthomonascampestrispv.campestris已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011，17:23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。番茄溃疡病菌Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23:24-27.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。上述菌株也可从申请人获得。结果如表2和图3所示，A:番茄溃疡病菌B:番茄细菌性斑点病菌C:花椰菜黑腐病菌D:黄瓜细菌性角斑病菌E:黄瓜细菌性软腐病菌F:葡萄根癌病菌G:番茄早疫病菌H:灰叶斑病菌I:辣椒疫霉病菌J:黄瓜棒孢叶斑病菌K:立枯丝核菌L:茄病镰刀菌；表明菌株ZF7能够显著抑制番茄溃疡病菌、番茄细菌性斑点病菌、花椰菜黑腐病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、黄瓜茎软腐病菌以及葡萄根癌病菌，同时，也能够抑制番茄早疫病菌、灰叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、多主棒孢病菌，但是对立枯丝核菌和茄病镰刀菌抑制效果较差，说明ZF7具有较广的抑菌谱。表2菌株ZF7对12种植物病原菌的抑菌效果注：+++表示细菌抑菌直径大于等于5.0cm或真菌抑菌率大于等于60％；++表示细菌抑菌直径大于等于4.0cm小于5.0cm或真菌抑菌率大于等于40％小于60％；+表示细菌抑菌直径小于4.0cm或真菌抑菌率小于40％；-表示无抑制作用。二、菌株ZF7促生效果检测1、溶磷平板定性检测将水生拉恩氏菌ZF7和水生拉恩氏菌HX2分别在PDA培养基中，28℃培养48h后进行活化，然后接种于装有5mL液体LB培养基的试管中，28℃，170rmin摇培24h后，制备成108CFUml-1的菌悬液；将灭菌的定性滤纸片直径D＝0.5cm放于NBRIP固体培养基平板中央，用移液枪吸取10μL各菌株处理的菌悬液点接于滤纸片上，无菌条件下吹干。培养7d，然后观测每个处理的溶磷圈，并测量其直径。每个处理重复3次。结果如表3和图4所示，可以看出，水生拉恩氏菌ZF7、HX2在NBRIP培养基培养7d，其溶磷圈直径分别为28.2mm、27.83；表明，水生拉恩氏菌ZF7具有解磷能力，与水生拉恩氏菌HX2无显著差异。表3菌株ZF7、HX2溶磷圈直径及IAA产量注：IAA产量一列中括号外为DF+培养基中菌株的IAA产量，括号内为DF培养基中菌株的IAA产量。2、IAA吲哚乙酸测定将菌株ZF7经PDA固体培养基活化，LB培养基摇培1-2d，并以0.1％接种量菌液量培养基量，vv分别接种于DF、DF+培养基中，于28℃培养7d，12000rmin离心5min，取1mL上清液于试管中，并分别从配制好的IAA水溶液5、10、15、20、25和30μgmL中吸取1mL标准液置于试管中，分别加入50μLSolutionⅠ10mmolL磷酸及2mlSolutionⅡ1mL0.5molLFeCl3溶于50mL35％HClO4反应液，混匀后于室温中反应25min，检测530nm处吸光度，以去离子水做空白对照，绘制IAA含量标准曲线并计算其产IAA的量表3。每个处理设置3个重复。菌株ZF7及HX2菌株接种于不含或含有500μgmL色氨酸的DF培养基中，在第7d检测了两株菌的IAA产量。结果如图5所示，A:菌株ZF7在DF+培养基中；B:菌株HX2在DF+培养基中；C:DF+培养基；D:菌株ZF7在DF培养基中；E：菌株HX2在DF培养基中；F：DF培养基；菌株ZF7、HX2在DF+、DF培养基中与溶液SolutionⅠ、SolutionⅡ反应现象；表明，菌株ZF7在含有500μgmL色氨酸的DF培养基中摇培7d可大量产生IAA，浓度达到31.032μgmL。而在不含有色氨酸的DF培养基中，第7d时，菌株ZF7产生的IAA浓度均不足4μgmL。结果说明色氨酸有利于菌株ZF7产生IAA。同时发现菌株ZF7产IAA能力强于菌株HX2。3、大白菜促生试验在温室条件下,随机选择颗粒饱满程度一致、健康的大白菜种子进行播种，待幼苗长出2-4片真叶进行灌根处理。试验设置4个处理：空白处理，清水灌根，每株苗灌20mL；配置浓度为1×10-7μgmL的IAA溶液，灌根量分别为10、20、30mL；菌株ZF7菌液处理：每株苗以浓度为108cfumL的菌株ZF7菌悬液灌根，灌根菌液量分别为10、20、30mL。每个处理10个重复。HX2菌液处理：方法同菌株ZF7处理。7天后测量大白菜植株地上及地下部长度及鲜重，并计算促生率。促生率＝处理株地上及地下部长度及鲜重-对照株地上及地下部长度及鲜重对照株地上及地下部长度及鲜重×100％菌株ZF7、HX2及IAA不同量对大白菜的促生效果结果如图6所示，A:菌株ZF7、HX2及IAA不同用量对大白菜地上部长度的促生效果B:菌株ZF7、HX2及IAA不同用量对大白菜根长的促生效果C:菌株ZF7、HX2及IAA不同用量对大白菜地上部重量的促生效果D:菌株ZF7、HX2及IAA不同用量对大白菜根重的促生效果；菌株ZF7、HX2及IAA对大白菜的促生效果结果如图7所示，A：灌根10mL；B:灌根20mL；C:灌根30mL每张图从左到右依次为清水对照、IAA、HX2、ZF7。上述结果表明，菌株ZF7对大白菜具有良好的促生效果，菌株ZF7对大白菜幼苗的地上部长度和根长的促生率分别达56.47％、54.74％；对大白菜地上部重量及根重的促生率分别达233.84％和164.71％。三、菌株ZF7防治根癌病效果检测菌株ZF7接种于LB液体培养基中，28℃，150rmin震荡培养28h，制成浓度为108CFUmL的菌悬液OD600为0.6。供试的葡萄根癌菌K308葡萄根癌病菌Agrobacteriumvitis已在文献“李金云、王慧敏、王建辉.根癌病生防菌E26菌株产生细菌素的初步研究.中国农业科学2004，3712：1860-1865.”中公开，公众可从中国农业大学资源与环境学院获得亦配制成浓度为108CFUmL的菌悬液OD600为0.6备用，与菌株ZF7菌体悬浮液1:1体积比混合，同时以菌株ZF7菌体悬浮液单独接种和无菌水接种作对照。用灭菌接种针在向日葵茎段上针刺造成伤口，吸取10μL待测液接种于伤口中，以灭菌脱脂棉包裹伤口，24h后除去脱脂棉，温室内培养15-20d后观察结瘤情况并称瘤重。每种处理设10个重复，试验重复三次。防效＝对照根癌瘤鲜重－处理根癌瘤鲜重对照根癌瘤鲜重×100％同时，与已报道水生拉恩氏菌菌株HX2对病原菌K308防效进行对比。结果如表4和图8A:清水对照；B:单独接种K308；C:单独接种ZF7；D:菌株HX2菌悬液与K308以1∶1的比例混合接种；E:菌株ZF7菌悬液与K308以1∶1的比例混合接种所示，菌株ZF7对葡萄根癌病菌K308的防效达到94.52％，菌株HX2对根癌病病菌K308的防效达到94.59％。菌株ZF7对葡萄根癌病的防效与菌株HX2没有显著差异。表4菌株ZF7和HX2对根癌病防效结果序列表110中国农业科学院蔬菜花卉研究所120水生拉恩氏菌ZF7及其在植物促生防病中的应用1601170PatentInversion3.521012111376212DNA213Rahnellaaquatilis4001gcggaaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaa60ctgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaag120agcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctag180taggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagc240cacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgca300caatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaa360agcactttcagcgaggaggaaggcatcacacttaatacgtgtggtgattgacgttactcg420cagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgt480taatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatc540cccgcgcttaacgtgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagagggggg600tagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaagg660cggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattag720ataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtg780gcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaact840caaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacg900cgaagaaccttacctactcttgacatccacggaattcgccagagatggcttagtgccttc960gggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggtt1020aagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtaatggtgggaactca1080aaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccc1140ttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgag1200agcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccat1260gaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggcct1320tgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagctta1376

权利要求：1.水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7，其保藏号为CGMCCNO.16014。2.权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在抑菌中的应用。3.权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备植物生防制剂中的应用。4.权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在防治植物病害中的应用。5.权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在防治植物根癌病中的应用。6.权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在促进植物生长中的应用。7.根据权利要求2-6中任一所述的应用，其特征在于：所述病害为病原菌引发的病；所述病原菌或所述抑菌的菌为真菌或细菌；和或，所述真菌为番茄早疫病Alternariasolani、番茄灰叶斑病菌StemphyliumsolaniWeber、辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici、黄瓜棒孢叶斑病菌Corynesporacassiicola和立枯丝核菌Rhizoctoniasolani中至少一种；和或，所述细菌为番茄溃疡病菌Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis、番茄斑点病菌Pseudomonassyringaepv.tomato、花椰菜黑腐病菌Xanthomonascampestrispv.campestris、黄瓜角斑病菌Pseudomonassyringaepv.lachrymans、黄瓜茎软腐病菌Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliense、葡萄根癌病菌Agrobacteriumvitis中至少一种。8.权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在降解磷中的应用；或，权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备IAA中的应用。9.一种防治植物根癌病的方法，为将权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用植物，实现防治植物根癌病。10.一种促进植物生长的方法，为将权利要求1所述的水生拉恩氏菌RahnellaaquatilisZF7或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用植物，实现促进植物生长。

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