申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2019-01-15

公开（公告）日：2021-06-08

公开（公告）号：CN109797139B

主分类号：C12N7/00(20060101)

分类号：C12N7/00(20060101);C12N7/08(20060101);A61K39/125(20060101);A61P31/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.08#授权;2019.06.18#实质审查的生效;2019.05.24#公开

摘要：本发明公开了一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH‑P60及其应用，该病毒株于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO：V201861。所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株对雏鸭安全，无致病力，且可保护同源强毒的攻毒，具有实际和广泛的应用价值。

主权项：1.一种3型鸭甲肝病毒（DuckhepatitisAvirus）弱毒株CH-P60，其特征在于，所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201861；所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60的VP1核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。

全文数据：一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60及其应用技术领域本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60及其应用。背景技术鸭病毒性肝炎Duckvirushepatitis，DVH是由鸭肝炎病毒Duckhepatitisvirus，DHV感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行性等特点，是危害养鸭业的主要疾病之一。该病主要侵害一月龄以内的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”；病理变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点。该病主要由属于小RNA病毒科Picornaviridae禽肝病毒属Avihepatovirus的鸭甲肝病毒DuckhepatitisAvirus，DHAV引起。DHAV具有三种血清型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。近年来，我国流行的DHAV主要是DHAV-1和DHAV-3。当前市场上对DHAV的防控主要是使用DHAV-1的弱毒疫苗，它们可以有效防控DHAV-1在我国的流行，但是不能完全阻止属于不同血清型的DHAV-3病毒的流行给养殖业造成了巨大的经济损失。因此，研制适合我国DHAV-3流行情况的疫苗迫在眉睫。发明内容为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种3型鸭甲肝病毒弱毒株，并对其在鸭病毒性肝炎预防方面的应用进行研究。本发明具体通过以下技术方案实现：本发明提供了一种3型鸭甲肝病毒CH-P60株DHAV-3CH-P60，该病毒株于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO：V201861。本发明所述3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60是由DHAV-3分离株作为种子病毒，经过多次传代致弱获得，具体是使用9日龄健康鸭胚对DHAV-3进行连续传代致弱，每个代次通过尿囊腔接种5枚鸭胚，每枚鸭胚接种0.2mL，置于37℃恒温培养箱内孵育36～48小时后无菌收集鸭胚尿囊液，然后将尿囊液使用灭菌生理盐水稀释100倍后，使用前述方法做同样处理，将病毒连续传至第60代，获得的病毒即为CH-P60株。对病毒株CH-P60进行VP1基因遗传进化分析，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，从GenBank上搜索下载已公布的37株具有代表意义的DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3毒株VP1基因序列，并应用MEGA7.0软件按ClustalW法对序列进行比对，然后并按Neighbor-Joining法，选bootstrapmethod1000参数，构建系统进化树进行病毒遗传进化分析，病毒株CH-P60在遗传进化树中与流行于中国地区3型鸭甲肝病毒属于同一分支，与流行于韩国地区的3型鸭甲肝病毒属于不同分支。进一步，本发明通过ELD50测定、雏鸭致病力试验、鸭胚中和实验和雏鸭攻毒保护试验来测定弱毒株生物学特性。试验结果表明CH-P60毒株对鸭胚适应性增强，对雏鸭不具有致死性，且免疫雏鸭后，雏鸭的攻毒保护率升高。在本发明的另一方面，所述的CH-P60毒株在制备预防3型鸭甲肝病毒疫苗中的应用也在本发明的保护范围内。在本发明的另一方面，一种预防3型鸭甲肝病毒疫苗，该疫苗有效成分为3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60。上述所预防3型鸭甲肝病毒疫苗通过以下步骤制备：将3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60作为种毒用灭菌生理盐水稀释后，尿囊腔接种9日龄鸭胚，收集24-72小时死亡鸭胚尿囊液，按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌和支原体检验，并测定病毒含量ELD50；将经无菌和支原体检验合格的鸭胚尿囊液病毒用无菌PBS或生理盐水稀释为所需的ELD50，直接作为3型鸭甲肝病毒弱毒CH-P60疫苗；或者向病毒液中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃处理24小时后获得灭活的病毒液，然后使用灭菌磷酸盐缓冲溶液将其稀释至适当浓度后与弗氏不完全佐剂按照1:1体积比混合，乳化后即制成3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60灭活疫苗。本发明的有益效果为：本发明所述3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60是经过连续传代致弱手段获得的，并且对雏鸭无毒力，将所述弱毒株制成疫苗安全有效，可保护同源强毒的攻毒，具有实际和广泛的应用价值。附图说明图1为病毒分离株接种鸭胚后死亡鸭胚胚体；图2为RT-PCR方法检测3型鸭甲肝病毒的琼脂糖凝胶电泳结果；图3为3型鸭甲肝病毒分离株和弱毒株CH-P60与其他37株鸭甲肝病毒参考毒株VP1蛋白氨基酸序列的遗传进化树。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，不是对本发明的进一步限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例13型鸭甲肝病毒分离鉴定1.病毒分离DHAV-3CH分离株于2013年从四川省成都市周边鸭场9日龄发病北京鸭中分离，具体过程如下：无菌采集病死雏鸭肝脏，按体积比1:5的比例加入灭菌磷酸盐缓冲溶液，研磨，反复冻融3次，12000g离心10min，上清液经0.22μm滤器过滤除菌后经尿囊腔途径接种9日龄鸭胚10枚，每胚接种0.2mL，接种后的鸭胚置于37℃恒温培养箱内孵育，每8小时照胚1次，记录接种7天内鸭胚死亡情况，弃去24小时之内的死亡鸭胚，收集其余死亡鸭胚尿囊液，如此盲传5代，死亡鸭胚均呈现典型的鸭肝炎病毒病变，如图1所示，表现为鸭胚发育不良、胚体四肢水肿严重，充血等，接种鸭胚死亡时间集中在在接种后36～56小时之间，收获的病毒CH-P5存于-80℃。2.病毒含量测定用无菌生理盐水溶液倍比稀释3型鸭甲肝病毒分离株CH-P5，选择10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8这6个稀释度，分别以每胚0.2mL的量经尿囊腔途径接种5枚9日龄的鸭胚，另设灭菌生理盐水对照5个，接种后置于37℃恒温培养箱内孵育，24小时内死亡鸭胚不计，观察并记录7天内接种鸭胚的死亡和存活情况，按Reed-Muech法计算ELD50，结果显示每0.2mL鸭胚尿囊液中3型鸭甲肝病毒含量为10-5.50ELD50。3.病毒鉴定3.1血清中和试验采用固定病毒稀释血清法测定兔抗3型鸭甲肝病毒血清对病毒分离株的中和效价，首先将发明人所在实验室前期制备的兔抗DHAV-3标准血清效价≥1:128用灭菌生理盐水作倍比稀释从2-1到2-9这9个稀释度，同时将经毒价滴定的病毒稀释成每个单位剂量0.2mL含200ELD50，然后两者等量混合并加入5％的青、链霉素双抗37℃水浴l小时，然后以每胚0.2mL的计量接种9日龄健康鸭胚尿囊腔内，每个稀释度接种5枚鸭胚。另设病毒对照3型鸭甲肝病毒CH1株、阳性血清对照兔抗CH1株血清、阴性血清对照健康兔血清和空白对照组灭菌生理盐水，弃去24小时内死亡的鸭胚，观察并记录7天内的鸭胚死亡和存活的情况，然后计算病毒的中和效价。结果病毒对照组和阴性血清对照组鸭胚全部死亡，阳性血清对照组和生理盐水对照组鸭胚全部健活，当血清稀释度在2-1～2-6之间时，鸭胚全部健活，当稀释度在2-7时鸭胚开始失去保护，此时开始，随稀释度越高，鸭胚保护率越低，直到稀释度为2-9时鸭胚彻底失去保护。3.2RT-PCR鉴定参照TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtraction试剂盒的使用说明书操作，分别从鸭胚尿囊液、肌肉组织和肝脏组织中抽提总RNA，并使用核酸蛋白检测仪BioRad,Smartspec3000测定其的核酸浓度和纯度后，-70℃保存备用。然后使用专利《1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法》中的试剂盒以及特异性引物表1对抽提的RNA样品进行一步法双重RT-PCR检测。反应结束后取PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检查结果，电泳结束后于凝胶成像系统中观察并记录结果，如图2所示，获得预期大小的目的条带。表1鉴定DHAV-1和DHAV-3的引物序列3.3VP1基因测序与分析扩增的目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用凝胶回收试剂盒Omega切胶回收目的片段。然后将回收的DNA片段送至上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测序，结果显示扩增的目的基因序列具体为SEQIDNO：5所示的单链DNA，其与其他3型鸭甲肝病毒VP1基因序列相似性为92～100％。3.4动物回归试验将收获的鸭胚尿囊液通过腿部肌肉注射10只1日龄雏鸭，0.2mL只，室内饲养，观察7天，剖解24～96小时内死亡雏鸭。然后取有典型DVH病变的肝脏制成匀浆并加入双抗溶液青霉素、链霉素终浓度均为100IUmL，8000g离心10min，取上清液经腿部肌肉再次注射10只1日龄雏鸭，0.2mL只，室内饲养，观察7天。结果显示雏鸭发病率为100％，死亡率为80％。4.病毒纯化将含3型鸭甲肝病毒分离株CH-P5的鸭胚尿囊液经鸭胚有限稀释法纯化5次后，获得分离株CH-P10株，具体过程如下：含有病毒的鸭胚尿囊液做10-4～10-9倍的10倍倍比稀释，取各稀释度的鸭胚尿囊液经尿囊腔途径分别接种5枚9日龄鸭胚，每胚接种0.2mL，接种后的鸭胚置于37℃恒温培养箱内孵育，每8小时照胚1次，弃去24小时之内的死亡鸭胚，分别收集其余鸭胚尿囊液，收获的病毒通过RT-PCR方法检测是否含有DHAV-3病毒。然后取稀释倍数最低的含毒尿囊液用相同方法连续传代5次进行纯化，最终收获的含毒尿囊液再次通过病毒含量测定、血清中和试验和动物回归试验，鉴定纯化效果，结果表明获得纯化的3型鸭甲肝病毒分离株CH-P10。实施例23型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60的培育1.毒株连续传代致弱使用9日龄鸭胚对3型鸭甲肝病毒分离株CH-P10进行连续传代致弱，每代次通过尿囊腔接种5枚鸭胚，0.2mL枚，接种后置于37℃恒温培养箱内继续孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，收获24～48小时内死亡的鸭胚的鸭胚尿囊液混匀，然后使用灭菌生理盐水将胚液进行100倍稀释后进行下一次传代，如此连续传代50代获得CH-P60，最后进行病毒含量、无菌和支原体检测、外源病毒检测和对易感雏鸭的安全性试验以确定毒力是否致弱。2.病毒含量测定用无菌生理盐水溶液倍比稀释CH-P60，选择10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8这6个稀释度，分别以每胚0.2mL的量接种于9日龄的鸭胚，每个稀释度接种5枚鸭胚，另设灭菌生理盐水对照5个，接种后置于37℃恒温培养箱内孵育，24小时内死亡鸭胚不计，观察并记录7天内接种鸭胚的死亡和存活情况，按Reed-Muech法计算ELD50，每0.2mL病毒含量为10-8.37ELD50，表明CH-P60毒株对鸭胚适应性增强。3.无菌和支原体检测将CH-P60按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌和支原体检验，检测结果均为阴性。4.外源病毒检测将CH-P60按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行外源病毒检测，检测结果均为阴性。5.对易感雏鸭的安全性试验使用亲本毒CH-P10和CH-P60进行安全性试验，1日龄健康雏鸭30只随机分为3组，试验组经肌肉注射途径接种亲本毒CH-P10和CH-P60，每只接种105.0ELD500.2mL，另一组作为对照接种0.2mL灭菌生理盐水，在不同动物房内隔离饲养，自由饮水采食，接种后每日观察，记录雏鸭的发病、死亡情况，及时剖检死亡雏鸭，观察7天后剖检存活雏鸭，记录雏鸭肝脏、肾脏等器官的病变情况。亲本毒CH-P10接种后雏鸭发病率100％，死亡率为80％，而CH-P60致病力已明显下降，雏鸭在接种后同注射灭菌生理盐水的对照组雏鸭一样，精神采食完全正常，无神经症状，无死亡，剖检肝脏和肾脏无病变，结果表明表明该减毒毒株毒力已明显下降。6.VP1基因遗传进化分析参照TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtraction试剂盒的使用说明书操作，分别从亲本毒CH-P10和CH-P60的尿囊液中抽提总RNA，并使用核酸蛋白检测仪BioRad,Smartspec3000测定其的核酸浓度和纯度后，使用专利《1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法》中的试剂盒以及特异性引物表1对抽提的RNA样品进行一步法双重RT-PCR检测。反应结束后取PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用凝胶回收试剂盒Omega切胶回收目的片段。然后将回收的DNA片段送至上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测序，结果显示扩增的目的基因序列具体为SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的单链DNA，它们与分离株CH-P5的VP1基因序列相似性为100％，显示病毒在传代过程中其主要结构蛋白VP1未发生突变。另外，从GenBank上搜索下载已公布的37株具有代表意义的DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3毒株VP1基因序列，并应用MEGA7.0软件按ClustalW法对序列进行比对，然后并按Neighbor-Joining法，选bootstrapmethod1000参数，构建系统进化树进行病毒遗传进化分析，结果如图3所示，本发明中的3型鸭甲肝病毒强毒株CH-P5和CH-P10和弱毒株CH-P60在遗传进化树中与流行于中国地区3型鸭甲肝病毒属于同一分支，与流行于韩国地区的3型鸭甲肝病毒属于不同分支。实施例33型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60的应用1.病毒液的制备将实施例二获得的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60作为种毒用灭菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种20枚9日龄鸭胚，每胚0.2mL，置37℃恒温培养箱内继续孵育，接种后24小时后照蛋1次，弃去死胚，以后每隔8小时照蛋1次，将死亡的鸭胚随时取出，至48小时，鸭胚全部死亡，将收集的鸭胚气室向上直立，置于4℃冷却8小时，将冷却后的无菌收集鸭胚尿囊液，置于-20℃保存备用。2.毒液的检验收获的病毒液按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌和支原体检验，并抽样一份测定病毒含量ELD50，结果收获的病毒液无菌生长，每0.2mL病毒含量为107.91ELD50。3.疫苗的制备方法将上述经无菌和支原体检验合格的鸭胚尿囊液病毒用无菌PBS或生理盐水稀释为所需的ELD50，直接作为3型鸭甲肝病毒弱毒CH-P60疫苗；同时采用终浓度为0.1％的甲醛溶液处理检验合格的病毒液，37℃灭活24小时，然后使用灭菌磷酸盐缓冲溶液将病毒含量稀释至106ELD500.1mL后与弗氏不完全佐剂等体积乳化混匀，即制成3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60灭活疫苗。4.疫苗的安全性试验以10倍免疫剂量免疫1日龄雏鸭，检验疫苗的安全性，疫苗免疫1日龄雏鸭10只，每只经腿部肌肉接种途径接种3型鸭甲肝病毒弱毒CH-P60活疫苗0.2mL106ELD50或10羽份灭活疫苗，同时取10只雏鸭注射灭菌生理盐水作为对照组，隔离饲养，自由饮水采食，每日观察记录雏鸭的健康情况，观察7天后剖解雏鸭，结果3型鸭甲肝病毒弱毒CH-P60活疫苗和灭活疫苗免疫组与对照组雏鸭在接种7天内均无发病，且肝脏、肾脏等器官无病变，表明疫苗对1日龄雏鸭没有致病性。5.疫苗的效力试验1日龄雏鸭30只随机分为3组，第一组10只免疫一羽份上述制备得到的3型鸭甲肝病毒弱毒CH-P60活疫苗，腿部肌肉注射途径每只105ELD500.2mL；第二组10只免疫一羽份上述制备得到的3型鸭甲肝病毒弱毒CH-P60灭活疫苗；第三组注射等量灭菌生理盐水作为对照，隔离饲养，自由饮水采食，接种后每日观察记录雏鸭的情况，5天后用10倍LD50剂量亲本毒CH-P10株进行攻毒，攻毒后每日观察记录雏鸭的发病、死亡情况，及时剖检死亡雏鸭，持续观察1周，剖检存活雏鸭，记录肝脏、肾脏等器官的病变情况。免疫后5天内实验组和对照组雏鸭均正常，攻毒后对照组第2天有雏鸭精神不振，出现神经症状，至第7天，共5只死亡，存活雏鸭有不同程度的肝脏出血等病变，发病率80％810，死亡率60％610，而免疫组雏鸭无发病死亡，雏鸭健康无异常，表明用致弱的CH-P60病毒制备的疫苗安全有效，可以保护同源强毒的攻毒。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。序列表四川农业大学一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60及其应用7SIPOSequenceListing1.0121DNA人工序列ArtificialSequence1tctgccatttacatcaaccac21221DNA人工序列ArtificialSequence2tgccaacaactaagataggtc21322DNA人工序列ArtificialSequence3gctatataacctggcatgttgt22419DNA人工序列ArtificialSequence4cctctccattgagtgcaga195720DNA病毒CH-P55ggtgattccaatcagcttggcgatgatgaaccagtgtgttttctcaattttgagactgca60aatgtgccaatacaaggggagtcacacactttggtgaaacatctttttggtcgtcaatgg120ctggttcgtactgttcaacatactagtgaggtacaagagttggatttgccagtacctgac180cagggtcacgcatctctattgcgcttctttgcctacttctctggagaagtgattttgacc240attgtcaataatggaacaacaccatgcatggttgcacactcttacacaatggacaatctc300acttctgaatatgctgtcacagccatggggggtattcttatcccagcaaactctgccaag360aatattaatattccattctattctgttacacctttacgccccacacgacccatgccagca420tttcaggggggtggtttgacttttggcaggttgtacatttggacacaatcaggaagtgtt480tctgtttttatgggtctccacaagccagctttgttttttccactgcctgcaccaacttac540acaacacatacacagttgaataatattgaaaccatgaatctgcataatcaatcagatcag600ccagattgccacctgtgtaagatttgtaagaaaatgaagaaatggtctcgcaaccatcgc660ccatttcgcttctgtttgagacttaaaacacttgcctttgagctccatctagaaattgaa7206720DNA病毒CH-P106ggtgattccaatcagcttggcgatgatgaaccagtgtgttttctcaattttgagactgca60aatgtgccaatacaaggggagtcacacactttggtgaaacatctttttggtcgtcaatgg120ctggttcgtactgttcaacatactagtgaggtacaagagttggatttgccagtacctgac180cagggtcacgcatctctattgcgcttctttgcctacttctctggagaagtgattttgacc240attgtcaataatggaacaacaccatgcatggttgcacactcttacacaatggacaatctc300acttctgaatatgctgtcacagccatggggggtattcttatcccagcaaactctgccaag360aatattaatattccattctattctgttacacctttacgccccacacgacccatgccagca420tttcaggggggtggtttgacttttggcaggttgtacatttggacacaatcaggaagtgtt480tctgtttttatgggtctccacaagccagctttgttttttccactgcctgcaccaacttac540acaacacatacacagttgaataatattgaaaccatgaatctgcataatcaatcagatcag600ccagattgccacctgtgtaagatttgtaagaaaatgaagaaatggtctcgcaaccatcgc660ccatttcgcttctgtttgagacttaaaacacttgcctttgagctccatctagaaattgaa7207720DNA病毒CH-P607ggtgattccaatcagcttggcgatgatgaaccagtgtgttttctcaattttgagactgca60aatgtgccaatacaaggggagtcacacactttggtgaaacatctttttggtcgtcaatgg120ctggttcgtactgttcaacatactagtgaggtacaagagttggatttgccagtacctgac180cagggtcacgcatctctattgcgcttctttgcctacttctctggagaagtgattttgacc240attgtcaataatggaacaacaccatgcatggttgcacactcttacacaatggacaatctc300acttctgaatatgctgtcacagccatggggggtattcttatcccagcaaactctgccaag360aatattaatattccattctattctgttacacctttacgccccacacgacccatgccagca420tttcaggggggtggtttgacttttggcaggttgtacatttggacacaatcaggaagtgtt480tctgtttttatgggtctccacaagccagctttgttttttccactgcctgcaccaacttac540acaacacatacacagttgaataatattgaaaccatgaatctgcataatcaatcagatcag600ccagattgccacctgtgtaagatttgtaagaaaatgaagaaatggtctcgcaaccatcgc660ccatttcgcttctgtttgagacttaaaacacttgcctttgagctccatctagaaattgaa720

权利要求：1.一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60，其特征在于，所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201861。2.根据权利要求1所述的一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60，其特征在于，所述3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60是由DHAV-3分离株作为种子病毒，经过多次传代致弱获得。3.根据权利要求2所述的一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60，其特征在于，使用9日龄健康鸭胚对DHAV-3进行连续传代致弱，每个代次通过尿囊腔接种5枚鸭胚，每枚鸭胚接种0.2mL，置于37℃恒温培养箱内孵育36～48小时后无菌收集鸭胚尿囊液，然后将尿囊液使用灭菌生理盐水稀释100倍后，使用前述方法做同样处理，将病毒连续传至第60代，获得的病毒即为CH-P60株。4.根据权利要求1～3中任一项所述的一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60，其特征在于，所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60的VP1核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。5.权利要求1所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60在制备预防3型鸭甲肝病毒疫苗中的应用。6.一种预防3型鸭甲肝病毒疫苗，其特征在于，该疫苗有效成分为3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60。

百度查询： 四川农业大学 一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60及其应用

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