申请/专利权人：中国科学院上海药物研究所;上高县协和生物科技有限公司

申请日：2019-04-11

公开（公告）日：2021-06-08

公开（公告）号：CN110133119B

主分类号：G01N30/02(20060101)

分类号：G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.08#授权;2019.09.10#实质审查的生效;2019.08.16#公开

摘要：本发明涉及一种液相色谱法检测化学合成的L‑α‑甘油磷酰胆碱中有关物质检查方法。其中所使用的色谱柱为极性硅胶柱或其他等效色谱柱；流动相为甲醇‑缓冲盐溶液、乙腈‑缓冲盐溶液或者甲醇‑乙腈‑缓冲盐溶液，并包含了添加剂。该方法操作简便，专属性、精密度和准确度较好，方法的耐用性良好，适用于化学合成的L‑α‑甘油磷酰胆碱中有关物质的检查和质量控制。

主权项：1.一种液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所使用的色谱柱为极性硅胶柱；流动相为甲醇-甲酸铵水溶液体系，甲醇占流动相的体积比为65%；甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为20mM，所述流动相包含占缓冲盐溶液质量分数为0.1%的磷酸二氢钠。

全文数据：一种L-α-甘油磷酰胆碱有关物质的检测方法技术领域本发明属于分析检测领域，具体涉及一种液相色谱法检测L-α-甘油磷酰胆碱以下简称甘油磷酰胆碱、GPC中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱等的方法。背景技术甘油磷酰胆碱Glycerophosphorylcholine,GPC，结构如下式是磷脂酰胆碱Phosphatidylcholine,PC分子上的两个脂肪酰基完全被水解的产物，是人机体内源性的水溶性小分子物质，也是重要的神经传递介质乙酰胆碱Acetylcholine的生物合成前体。目前产业化的GPC常用制备方法有磷脂酰胆碱水解法、全化学合成法等。采用全化学合成法生产的GPC会产生一些相关的杂质如磷酸甘油酯降解产物、胆碱初始原料、降解产物及磷酰胆碱初始原料在产物中的存在形式、降解产物及可能未知的杂质。为保证GPC产品的纯度与质量安全性，需对GPC中的有关物质，包括磷酸甘油酯、胆碱、磷酰胆碱及其他杂质进行检测。发明内容解决的技术问题GPC及其有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱均为极性较大的水溶性化合物，且无紫外吸收，也不能激发荧光，所以对检测方法的开发具有较大难度。目前尚无关于全化学合成GPC中有关物质的检测方法报道。为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种高效液相色谱方法，具有较好的保留特性，相邻峰之间的分离度满足要求，峰形对称性良好，能够较好地用于GPC中有关物质磷酸甘油酯代号：a、胆碱代号：b及磷酰胆碱代号：c定量测定，由此可以确保GPC产品的质量。技术方案为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其中所使用的色谱柱为极性硅胶柱或其他等效色谱柱；流动相为甲醇-缓冲盐溶液、乙腈-缓冲盐溶液或者甲醇-乙腈-缓冲盐溶液，并包含了添加剂。本发方法使用的检测器为示差折光检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器。所述液相色谱法包括常规液相色谱法或者超高效液相色谱法。优选地，所述色谱柱为以硅胶或键合硅胶为填料的极性柱。优选地，所述色谱柱柱温为25-50℃，更优选为40℃。优选地，所述缓冲盐为正离子对试剂如四正丁基溴化铵等、负离子对试剂如庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、己烷磺酸钠等、甲酸盐如甲酸铵、醋酸盐如醋酸铵、磷酸盐如磷酸二氢钠等中的一种或几种。优选地，所述流动相为甲醇-甲酸铵水溶液体系，其中甲醇占流动相的体积比为50-80％，更优选为65％；甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为10-100mM，更优选为20mM。优选地，所述添加剂为甲酸、甲酸盐、醋酸、醋酸盐、磷酸、磷酸盐中的一种或多种，更优选为磷酸或磷酸盐，添加剂占流动相中水相即缓冲盐溶液的质量分数为0.05％-2％。更优选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的一种或多种。优选地，所述流动相流速为0.1-2.0mLmin。具体地，所述液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，包括如下步骤：步骤1：空白溶液的制备：取甲醇水溶液作为空白溶液；步骤2：流动相体系制备：制备含20mM甲酸铵的水溶液作为水相，并加入占水相质量分数0.1％的磷酸盐，量取甲醇作为有机相，有机相与水相体积为65:35，将有机相和水相混合均匀；步骤3：有关物质对照品溶液的制备：分别取有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱，精密称定，加甲醇水溶液溶解，分别制成每1mL约含0.4mg±0.02mg的有关物质对照品溶液；步骤4：供试品溶液配制：精密称取待测定的甘油磷酰胆碱样品约0.4g±0.05g，加甲醇水溶液溶解，制成每1mL约含待测定的甘油磷酰胆碱样品80mg和未知含量的各有关物质的供试品溶液；分别精密量取步骤1制备的空白溶液、步骤3制备的有关物质对照品溶液和步骤4制备的供试品溶液各10μL，使用液相色谱法检测，记录色谱图，按照外标法计算待测定的甘油磷酰胆碱样品中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的含量。计算公式为：其中，CR为有关物质对照溶液中待测物的浓度，mgmL；Cs为供试品溶液中甘油磷酰胆碱样品浓度，mgmL；AR，AX分别为有关物质对照溶液和供试品溶液中待测物的峰面积，mV；优选地，步骤1、步骤3和步骤4中所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为65:35。有益效果经专属性试验、线性试验、精密度试验和准确度试验对本发明的方法进行了方法学验证，证明本发明提供的一种GPC有关物质的检测方法具有下述优点：1主成分GPC与有关物质、各有关物质之间均能达到良好分离。2本方法具有良好的专属性和耐用性。3本方法精密度良好。4GPC和有关物质在一定浓度范围内，均呈现良好的线性关系。5本方法准确度良好。6同时实现了GPC和有关物质a，b，c较好的峰形。附图说明图1为采用本发明方法的检测图谱曲线1为空白溶液色谱图；曲线2为GPC及其有关物质典型分离色谱图：a峰：磷酸甘油酯；b峰：胆碱；c峰：磷酰胆碱；d峰：GPC；*峰：未知杂质。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在实施例中采用的试剂均为市场上可获得。实施例：本实施例提供了采用本发明方法进行GPC有关物质的检测。仪器与色谱条件：ShimazuLC-20高效液相色谱仪；色谱柱为极性硅胶柱；柱温为40℃；以甲醇：含0.1％磷酸盐的20mM甲酸铵溶液65:35，v:v为流动相；用高效色谱液相系统进行检测，进样体积10μL；流速1.0mLmin；采用示差折光检测器；检测器温度为40℃。实验步骤步骤1：空白溶液的制备：取甲醇：水65:35，v:v混合溶液作为空白溶液。步骤2：流动相体系制备：量取去离子水适量，加入精密称定的甲酸铵适量制得含20mM甲酸铵的水溶液作为水相，并加入0.1％的磷酸二氢钠磷酸二氢钠占水相的质量分数为0.1％，量取适量甲醇作为有机相，有机相与水相比例为65:35v:v，混合均匀后，过滤并超声。步骤3：单个有关物质对照品储备液的制备：分别取有关物质磷酸甘油酯a、胆碱b和磷酰胆碱c，精密称定，加甲醇：水65:35，v:v溶解，分别制成每1mL约含2mg的单个有关物质对照品储备液。步骤4：有关物质对照品溶液的制备：取步骤3制得的单个有关物质对照品储备液各1mL，置于同一5mL容量瓶中，加甲醇：水65:35，v:v溶解，制成每1mL约含各有关物质0.4mg的对照品溶液。步骤5：混合溶液配制：取步骤3制得的单个有关物质对照品储备液各1mL，置于同一5mL容量瓶中，精密称取约0.4gGPC样品不含a、b、c杂质，加甲醇：水65:35，v:v溶解，制成每1mL约含主成分80mg和各有关物质0.4mg的混合溶液各有关物质约占主成分的0.5％。分别精密量取步骤1制备的空白溶液、步骤5制备的混合溶液各10μL，进样测定，记录色谱图，见图1。色谱出峰顺序依次为磷酸甘油酯、胆碱、GPC和磷酰胆碱。按GPC的保留时间进行计算，磷酸甘油酯的相对保留时间为0.4；胆碱的相对保留时间为0.9；磷酰胆碱的相对保留时间为1.3。另外，在胆碱峰之前至少有一个未知杂质出现，相对保留时间为0.6。试验结果表明，空白溶剂峰对GPC及其有关物质检测无干扰，GPC与各有关物质之间，各有关物质之间分离度均大于1.5，各有关物质峰形良好。精密量取步骤4制备的有关物质对照品溶液10μL，分别于第一天平行进样6针、第二天和第三天平行进样3次，依法测定。各有关物质峰面积相对标准偏差RSD的如下表。结果显示各有关物质峰面积的RSD均小于2％，表明本法精密度良好。有关物质abc峰面积RSD％1.670.991.76将步骤5所制备的混合溶液测定结果与步骤4所制备的对照品溶液测定结果比较，考察各有关物质的回收率。结果各有关物质回收率均在95～108％之间，表明本法准确度良好。回收率计算公式：其中Ax、AR分别为混合溶液中待测物峰面积和有关物质对照品溶液中相应的待测物峰面积，mV；Cx、CR分别为混合溶液中待测物浓度和有关物质对照品溶液中相应的待测物浓度，mgmL。将步骤4制备的对照品溶液逐级稀释并进样测定，以信噪比为2～3作为检测限，计算各有关物质的检测限如下表。表明此法具有较高的灵敏度，可以满足检测要求。综上所述，本发明所提供的一种液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱等的方法，具有操作简便，专属性好，精密度和准确度强，灵敏度高的优点，适用于甘油磷酰胆碱中有关物质的检查和质量控制。

权利要求：1.一种液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所使用的色谱柱为极性硅胶柱或等效色谱柱；流动相为甲醇-缓冲盐溶液、乙腈-缓冲盐溶液或者甲醇-乙腈-缓冲盐溶液，并包含了添加剂。2.如权利要求1所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：使用的检测器为示差折光检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器。3.如权利要求1所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所述缓冲盐为正离子对试剂、负离子对试剂、甲酸盐、醋酸盐、磷酸盐中的一种或几种。4.如权利要求3所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所述正离子对试剂为四正丁基溴化铵；所述负离子对试剂选自庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、己烷磺酸钠；所述甲酸盐为甲酸铵；所述醋酸盐为醋酸铵；所述磷酸盐为磷酸二氢钠。5.如权利要求1所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所述流动相为甲醇-甲酸铵水溶液体系，其中甲醇占流动相的体积比为50-80％；甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为10-100mM。6.如权利要求5所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所述流动相为甲醇-甲酸铵水溶液体系，其中甲醇占流动相的体积比为65％；甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为20mM。7.如权利要求1所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所述添加剂为甲酸、甲酸盐、醋酸、醋酸盐、磷酸、磷酸盐中的一种或多种；添加剂占流动相中缓冲盐溶液的质量分数为0.05％-2％。8.如权利要求7所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：所述添加剂为磷酸、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的一种或多种。9.如权利要求1所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：空白溶液的制备：取甲醇水溶液作为空白溶液；步骤2：流动相体系制备：制备含20mM甲酸铵的水溶液作为水相，并加入占水相质量分数0.1％的磷酸盐，量取甲醇作为有机相，有机相与水相体积为65:35，将有机相和水相混合均匀；步骤3：有关物质对照品溶液的制备：分别取有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱，精密称定，加甲醇水溶液溶解，分别制成每1mL约含0.4mg±0.02mg的有关物质对照品溶液；步骤4：供试品溶液配制：精密称取待测定的甘油磷酰胆碱样品约0.4g±0.05g，加甲醇水溶液溶解，制成每1mL约含待测定的甘油磷酰胆碱样品80mg和未知含量的各有关物质的供试品溶液；分别精密量取步骤1制备的空白溶液、步骤3制备的有关物质对照品溶液和步骤4制备的供试品溶液各10μL，使用液相色谱法检测，记录色谱图，按照外标法计算待测定的甘油磷酰胆碱样品中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的含量；计算公式为：其中，CR为有关物质对照溶液中待测物的浓度，mgmL；Cs为供试品溶液中甘油磷酰胆碱样品浓度，mgmL；AR，AX分别为有关物质对照溶液和供试品溶液中待测物的峰面积，mV。10.如权利要求9所述的液相色谱法检测甘油磷酰胆碱中有关物质磷酸甘油酯、胆碱和磷酰胆碱的方法，其特征在于：步骤1、步骤3和步骤4中所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为65:35。

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