申请/专利权人：马萨诸塞大学

申请日：2015-10-21

公开（公告）日：2021-08-24

公开（公告）号：CN107073051B

主分类号：C12N15/29(20060101)

分类号：C12N15/29(20060101)

优先权：["20141021 US 62/066,856"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.08.24#授权;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：在一些方面中，本公开内容涉及具有独特的组织靶向能力的重组腺相关病毒。在一些方面中，本公开内容涉及使用重组腺相关病毒的基因转移方法。在一些方面中，本公开内容涉及分离的AAV衣壳蛋白和编码其的分离的核酸。

主权项：1.重组表达载体，其由选自SEQIDNO：4至5和10至11的序列组成。

全文数据：重组AAV变体及其用途[0001]相关申请[0002]本申请根据35U.S.C.§119e要求于2014年10月21日提交的标题为“RecombinantAAVVariantsAndUsesThereof”的美国临时专利申请USSN62066,856的权益，其全部内容通过引用并入本文。技术领域[0003]在一些方面中，本公开内容涉及可用于鉴定细胞中的腺相关病毒（adeno-associatedvirus的分离核酸、组合物和试剂盒。在一些方面中，本公开内容提供了新的AAV和其使用方法以及相关试剂盒。背景技术[0004]腺相关病毒AAV是小的辅助病毒依赖性病毒。其在20世纪60年代作为腺病毒（弓丨起感冒的病毒）制备中的污染物被发现。其在细胞中的生长依赖于腺病毒的存在并因此被命名为腺相关病毒。AAV载体已成为用于体内基因转移的有效平台。然而，仍然需要用于基因递送的新的AAV载体。发明内容[0005]在一些方面中，本公开内容涉及用于基因治疗应用的新型AAV。在一些实施方案中，本文所述的AAV包含一种或更多种衣壳蛋白中的氨基酸变化，其赋予新的或增强的组织嗜性特性。根据一些实施方案，本文中鉴定并公开了AAV3B、AAV4和AAV5的变体，其具有有用的组织靶向特性。例如，提供了可用于转导细胞如人肝细胞（例如，存在于肝组织中）等的AAV3B的变体。提供了可用于革巴向中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS、心肺组织、眼组织和其他组织的细胞的AAV4和AAV5的变体。在一些实施方案中，本文所述的变体AAV靶向除了其相应的野生型AAV靶向的组织之外的组织。在一些实施方案中，AAV3B变体靶向中枢神经系统CNS或心脏的细胞。在一些实施方案中，AAV4变体靶向肝或肾的细胞。在一些实施方案中，AAV5变体靶向CNS、肝、脾或心脏的细胞。[0006]在一些方面中，本公开内容提供了分离的核酸，其包含编码AAV衣壳蛋白的选自SEQIDNO:1至47的序列。在一些实施方案中，提供了分离的核酸片段。在某些实施方案中，分离的核酸片段不编码与SEQIDNO:98至100中任一序列相同的肽。[0007]在一些方面中，本公开内容提供了分离的AAV衣壳蛋白，其包含选自SEQIDNO:51至61的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的AAV衣壳蛋白包含选自SEQIDN0:51至61的序列，其中所述序列中与SEQIDN0:98所示序列的对应氨基酸不同的氨基酸由保守替换所代替。在一些实施方案中，分离的AAV衣壳蛋白包含选自SEQIDN0:62至67的序列，其中所述序列中与SEQIDN0:99所示序列的对应氨基酸不同的氨基酸由保守替换所代替。在一些实施方案中，分离的AAV衣壳蛋白包含选自SEQIDN0:68至97的序列，其中所述序列中与SEQIDNO:100所示序列的对应氨基酸不同的氨基酸由保守替换所代替。[0008]在本公开内容的某些方面中，提供了包含任意前述分离AAV衣壳蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含可药用载体。在一些实施方案中，提供了这样的组合物，其包含一种或更多种本公开内容的分离AAV衣壳蛋白和生理相容性载体。[0009]在本公开内容的某些方面中，提供了包含任意前述分离AAV衣壳蛋白的重组AAVrAAV。在一些实施方案中，提供了包含rAAV的组合物。在某些实施方案中，所述包含rAAV的组合物还包含可药用载体。还提供了重组AAV，其中所述重组AAV包含一种或更多种本公开内容的分离AAV衣壳蛋白。[0010]在本公开内容的一些方面中，提供了宿主细胞，其含有包含与启动子有效连接的选自SEQIDNO:1至47的编码序列的核酸。在一些实施方案中，提供了包含宿主细胞和无菌细胞培养基的组合物。在一些实施方案中，提供了包含宿主细胞和冷冻保存剂的组合物。[0011]根据本公开内容的一些方面，提供了向对象递送转基因的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用任意前述rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因，并且其中所述rAAV感染所述对象靶组织的细胞。在一些实施方案中，对象选自小鼠、大鼠、兔、狗、猫、绵羊、猪和非人灵长类。在一个实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，所述至少一种转基因是蛋白质编码基因。在某些实施方案中，所述至少一种转基因编码小干扰核酸。在某些实施方案中，小干扰核酸是miRNA。在某些实施方案中，小干扰核酸是抑制对象中至少一种miRNA的活性的miRNA海绵或TuDRNA。在某些实施方案中，miRNA在靶组织的细胞中表达。在某些实施方案中，靶组织是骨骼肌、心、肝、胰、脑或肺。在一些实施方案中，转基因表达包含至少一个miRNA结合位点的转录物，其中所述miRNA通过与结合位点杂交而抑制除革El组织以外的组织中转基因的活性。在某些实施方案中，经静脉内、透皮、眼内、鞘内、脑内、经口、肌内、皮下、鼻内或通过吸入向对象施用rAAV。[0012]根据本公开内容的一些方面，提供了用于产生体细胞转基因动物模型的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向非人动物施用任一种前述rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因，并且其中所述rAAV感染所述非人动物靶组织的细胞。在一些实施方案中，所述至少一种转基因是蛋白质编码基因。在某些实施方案中，所述至少一种转基因编码小干扰核酸。在一些实施方案中，所述至少一种转基因编码报告分子。在某些实施方案中，小干扰核酸是miRNA。在某些实施方案中，小干扰核酸是抑制动物中至少一种miRNA的活性的miRNA海绵或TuDRNA。在某些实施方案中，miRNA在靶组织的细胞中表达。在某些实施方案中，靶组织是骨骼肌、心、肝、胰、脑或肺。在一些实施方案中，转基因表达包含至少一个miRNA结合位点的转录物，其中所述miRNA通过与结合位点杂交而抑制除靶组织以外的组织中转基因的活性。[0013]根据本公开内容的一些方面，提供了用于产生体细胞转基因动物模型的方法，其包括向非人动物施用任意前述rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因，其中所述转基因表达包含至少一个miRNA结合位点的转录物，其中所述miRNA通过与转录物的结合位点杂交而抑制除靶组织以外的组织中转基因的活性。在一些实施方案中，转基因包含组织特异性启动子或诱导型启动子。在某些实施方案中，组织特异性启动子是肝特异性甲状腺素结合球蛋白（thyroxinbindingglobulin，TBG启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽pancreaticpolypeptide，PPY启动子、突触蛋白-ISyn启动子、肌酸激酶MCK启动子、哺乳动物结蛋白（DES启动子、α-肌球蛋白重链a-MHC启动子或心肌肌f丐蛋白TcardiacTroponinT，cTnT启动子。在某些实施方案中，经静脉内、透皮、眼内、鞘内、经口、肌内、皮下、鼻内或通过吸入向动物施用rAAV。根据本公开内容的一些方面，提供了通过任意前述方法产生的体细胞转基因动物模型。[0014]在本公开内容的另一些方面中，提供了用于产生rAAV的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含容纳有具有SEQIDNO:1至47中任一序列的分离核酸的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于产生rAAV的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一个容纳有重组AAV载体的容器，其中所述重组AAV载体包含转基因。[0015]在本公开内容的另一些方面中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有具有任意前述分离AAV衣壳蛋白的重组AAV的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒的容器是注射器。[0016]在另一些方面中，本公开内容涉及将基于AAV的载体作为载剂用于递送基因、治疗、预防和研究目的以及体细胞转基因动物模型开发的用途。在一些方面中，本公开内容涉及这样的AAV血清型，其已经显示出独特的组织细胞型嗜性，并且可以在不存在载体相关毒理学的情况下以与腺病毒载体类似的水平在动物组织中实现稳定的体细胞基因转移例如，取决于靶组织和载体剂量的高达100%的体内组织转导）。在另一些方面中，本公开内容涉及具有肝、心、骨骼肌、脑和胰组织靶向能力的AAV血清型。这些组织与广泛的人类疾病包括多种代谢、心血管和糖尿病有关。在一些实施方案中，所述rAAV包含至少一种转基因。所述转基因可以是导致病理状态的转基因。在一些实施方案中，所述转基因编码治疗病理状态的蛋白质。[0017]在另一个方面中，本公开内容的新型AAV可用于用于将转基因递送至对象的方法。所述方法通过将本公开内容的rAAV施用于对象来进行，其中所述rAAV包含至少一种转基因。在一些实施方案中，所述rAAV靶向对象的预定组织。[0018]在另一个方面中，本公开内容的AAV可用于用于产生体细胞转基因动物模型的方法。所述方法通过将本公开内容的rAAV施用于动物来进行，其中所述rAAV包含至少一种转基因，其中所述转基因导致病理状态，并且其中所述rAAV靶向动物的预定组织。[0019]在一个实施方案中，所述rAAV含有具有选自SEQIDN0:51至97的氨基酸序列的AAV衣壳。[0020]所述转基因可表达许多基因，包括癌相关基因、促凋亡基因和凋亡相关基因。在一些实施方案中，所述转基因表达能够抑制癌相关基因表达的小干扰核酸。在另一些实施方案中，所述转基因表达能够抑制凋亡相关基因表达的小干扰核酸。在另一些实施方案中，所述小干扰核酸是miRNA或shRNA。根据另一些实施方案，所述转基因表达毒素，任选地其中所述毒素是DTA。在另一些实施方案中，所述转基因表达报告基因，所述报告基因任选地是报告酶如β-半乳糖苷酶或荧光蛋白（如GFP。[0021]所述转基因可表达miRNA。在另一些实施方案中，所述转基因表达miRNA海绵，其中miRNA海绵抑制动物中一种或更多种miRNA的活性。在一些实施方案中，miRNA可以是内源性miRNA，或者其可以在心、肝、骨骼肌、脑或胰组织的细胞中表达。[0022]在一个实施方案中，AAV的靶组织是生殖腺、隔膜、心、胃、肝、脾、胰或肾。所述rAAV可转导许多不同类型的组织，例如肌纤维、鳞状上皮细胞、肾近曲或远曲小管细胞、粘膜腺细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞。[0023]在一些实施方案中，所述rAAV以每个对象101、1011、1012、1013、IO14或IO15个基因组拷贝的剂量施用。在一些实施方案中，所述rAAV以每千克1011^、88加1、51〇60;与亨廷顿病有关的11'15、？1«^、开!13、丁8?、ATXNl、ATXN2、ATXN3、Atrophin1、？11、1^?-1;与弗里德赖希共济失调有关的?乂化与卡纳万病有关的ASPA;与肌营养不良有关的DMD;以及与脊髓性肌萎缩有关的SMNl、UBE1、DYNC1H1。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种前述基因或其片段的核酸的重组AAV。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种功能性RNA的核酸的重组AAV，所述功能性RNA抑制一种或更多种前述基因的表达。[0099]在一些实施方案中，本公开内容涉及编码可用于治疗与心血管系统有关的病症、疾病或病患之蛋白质或功能性RNA的核酸。以下是与心血管疾病有关的基因的非限制性列表:VEGF、FGF、SDF-1、连接蛋白40、连接蛋白43、SCMa、HIFIa、SERCa2a、ADCY1和ADCY6。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种前述基因或其片段的核酸的重组AAV。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种功能性RNA的核酸的重组AAV，所述功能性RNA抑制一种或更多种前述基因的表达。[0100]在一些实施方案中，本公开内容涉及包含编码可用于治疗与肺系统有关的病症、疾病或病患之蛋白质或功能性RNA之核酸的AAV。以下是与肺部疾病有关的基因的非限制性列表：TNFcuTGFm、SFTPA1、SFTPA2、SFTPB、SFTPC、HPS1、HPS3、HPS4、ADTB3A、IL1A、IL1B、1^八、11^6工乂〇?1和0乂〇?2。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种前述基因或其片段的核酸的重组AAV。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种功能性RNA的核酸的重组AAV，所述功能性RNA抑制一种或更多种前述基因的表达。[0101]在一些实施方案中，本公开内容涉及包含编码可用于治疗与肝有关的病症、疾病或病患之蛋白质或功能性RNA的核酸的AAV。以下是与肝疾病有关的基因的非限制性列表:αI-AT、HFE、ΑΤΡ7Β、延胡索酰乙酰乙酸水解酶FAH、葡萄糖-6-磷酸酶、NCAN、GCKR、LYPLALI和PNPLA3。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种前述基因或其片段的核酸的重组AAV。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种功能性RNA的核酸的重组AAV，所述功能性RNA抑制一种或更多种前述基因的表达。[0102]在一些实施方案中，本公开内容涉及包含编码可用于治疗与肾有关的病症、疾病或病患之蛋白质或功能性RNA的核酸的AAV。以下是与肾疾病有关的基因的非限制性列表：[0103]PKDl，PKD2，PKHD1，NPHS1，NPHS2，PLCE1，CD2AP，LAMB2，TRPC6，WT1，LMX1B，SMARCAL1，C0Q2，PDSS2，SCARB3，FNl，C0L4A5，C0L4A6，C0L4A3，C0L4A4，FOXlC，RET，UPK3A，BMP4，SIX2，CDC5L，USF2，R0B02，SLIT2，EYAl，MYOG，SIXl，SIX5，FRASl，FREM2，GATA3，KALI，PAX2，TCF2，和SALLl。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种前述基因或其片段的核酸的重组AAV。在一些实施方案中，本公开涉及包含表达一种或更多种功能性RNA的核酸的重组AAV，所述功能性RNA抑制一种或更多种前述基因的表达。[0104]在一些实施方案中，本公开内容涉及包含编码可用于治疗与眼有关的病症、疾病或病患之蛋白质或功能性RNA的核酸的AAV。以下是与眼部疾病有关的基因的非限制性列表：CFH、C3、MT-ND2、ARMS2、TIMP3、CAMK4、FMNI、RHO、USH2A、RPGR、RP2、TMCO、SIXI、SIX6、LRP12、ZFPM2、TBKl、GALC、肌纤蛋白、CYPIBl、CAVl、CAV2、optineurin和CDKN2B。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种前述基因或其片段的核酸的重组AAV。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含表达一种或更多种功能性RNA的核酸的重组AAV，所述功能性RNA抑制一种或更多种前述基因的表达。[0105]本公开内容的rAAV可用于恢复在对象中表达减少、沉默或其他功能障碍的基因例如，在患有癌症的对象中沉默的肿瘤抑制基因）的表达。本公开内容的rAAV也可以用于敲低在对象中异常表达的基因（例如，在患有癌症的对象中表达的致癌基因）的表达。在一些实施方案中，包含编码与癌症有关基因产物例如，肿瘤抑制基因）的核酸的rAAV载体可用于通过将所述具有rAAV载体的rAAV施用于患有癌症的对象来治疗癌症。在一些实施方案中，包含编码抑制与癌症有关的基因产物（例如，致癌基因）表达的小干扰核酸（例如，shRNA、miRNA的核酸的rAAV载体可用于通过将所述具有rAAV载体的rAAV施用于患有癌症的对象来治疗癌症。在一些实施方案中，包含编码与癌症有关的基因产物的核酸或者抑制与癌症有关的基因表达的功能性RNA的rAAV载体可用于研究目的，例如，用于研究癌症或用于鉴定治疗癌症的疗法。以下是已知与癌症发生有关的示例性基因（例如，致癌基因和肿瘤抑制基因）的非限制性列表：[0106]AARS，ABCBI，ABCC4，AB12，ABLI，ABL2，ACKI，ACP2，ACYI，ADSL，AKI，AKRIC2，AKT1，ALB，ANPEP，ANXA5，ANXA7，AP2M1，APC，ARHGAP5，ARHGEF5，ARID4A，ASNS，ATF4，ATM，ATP5B，ATP50，AXL，BARDl，BAX，BCL2，BHLHB2，BLMH，BRAF，BRCAl，BRCA2，BTK，CANX，CAPl，CAPNl，CAPNSl，CAVl，CBFB，CBLB，CCL2，CCNDl，CCND2，CCND3，CCNEI，CCT5，CCYR61，CD24，CD44，CD59，CDC20，CDC25，CDC25A，CDC25B，CDC2L5，CDKlO，CDK4，CDK5，CDK9，CDKLl，CDKNlA，CDKNIB，CDKNIC，CDKN2A，CDKN2B，CDKN2D，CEBPG，CENPCI，CGRRFI，CHAFIA，CIBI，CKMT1，CLKI，CLK2，CLK3，CLNSIA，CLTC，COLIAl，⑶L6A3，C0X6C，C0X7A2，CRAT，CRHRl，CSFlR，CSK，CSNK1G2，CTNNAl，CTNNBI，CTPS，CTSC，CTSD，CULI，CYR61，DCC，DCN，DDXl0，DEK，DHCR7，DHRS2，DHX8，DLG3，DVLl，DVL3，E2F1，E2F3，E2F5，EGFR，EGRl，EIF5，EPHA2，ERBB2，ERBB3，ERBB4，ERCC3，ETVl，ETV3，ETV6，F2R，FASTK，FBNl，FBN2，FES，FGFRl，FGR，FKBP8，FNl，FOS，FOSLl，F0SL2，FOXGlA，F0X01A，FRAPl，FRZB，FTL，FZD2，FZD5，FZD9，G22PI，GAS6，GCN5L2，GDFl5，GNAl3，GNAS，GNB2，GNB2L1，GPR39，GRB2，GSK3A，GSPTI，GTF2I，HDACl，HDGF，HMMR，HPRTl，HRB，HSPA4，HSPA5,HSPA8,HSPBl，HSPHl，HYALl，HY0U1，ICAMl，IDl，ID2,IDUA，IER3，IFITMl，IGFlR，IGF2R，IGFBP3，IGFBP4，IGFBP5，ILlB，ILK，INGl，IRF3，ITGA3，ITGA6，ITGB4，JAKI，JARIDIA，JUN，JUNB，JUND，K-ALPHA-1，KIT，KITLG，KLK10，KPNA2，KRAS2，KRT18，KRT2A，KRT9，LAMBl，LAMP2，LCK，LCN2，LEP，LITAF，LRPAPl，LTF，LYN，LZTRl，MADHl，MAP2K2，MAP3K8，MAPK12，MAPK13，MAPKAPK3，MAPREI，MARS，MASI，MCC，MCM2，MCM4，MDM2，MDM4，MET，MGSTI，MICB，MLLT3，MME，MMPI，MMP14，MMP17，MMP2，MNDA，MSH2，MSH6，MT3，MYB，MYBLI，MYBL2，MYC，MYCLI，MYCN，MYD88，MYL9，MYLK，NEOl，NFl，NF2，NFKBI，NFKB2，NFSF7，NID，NINJl，NMBR，NMEl，NME2，NME3，NOTCHl，N0TCH2，N0TCH4，NPMl，NQOl，NRlDl，NR2FI，NR2F6，NRAS，NRGl，NSEPI，OSM，PA2G4，PABPCI，PCNA，PCTKI，PCTK2，PCTK3，PDGFA，PDGFB，PDGFRA，PDPKI，PEAl5，PFDM，PFDN5，PGAMl，PHB，PIK3CA，PIK3CB，PIK3CG，PIMl，PKM2，PKMYTl，PLK2，PPARD，PPARG，PPIH，PPPICA，PPP2R5A，PRDX2，PRDX4，PRKARIA，PRKCBPI，PRNP，PRSS15，PSMAI，PTCH，PTEN，PTGSl，PTMA，PTN，PTPRN，RAB5A，RACl，RAD50，RAFl，RALBPI，RAPIA，RARA，RARB，RASGRF1，RBl，RBBP4，RBL2，REA，REL，RELA，RELB，RET，RFC2，RGSl9，RHOA，RHOB，RHOC，RHOD，RIPKl，RPN2，RPS6KBI，RRMl，SARS，SELENBPI，SEMA3C，SEMA4D，SEPPl，SERPINHl，SFN，SFPQ，SFRS7，SHB，SHH，SIAH2，SIVA，SIVATP53，SKI，SKIL，SLC16A1，SLC1A4，SLC20A1，SMO，SMPDl，SNAI2，SNDl，SNRPB2，SOCSl，S0CS3，SODl，SORTl，SPINT2，SPRY2，SRC，SRPX，STATl，STAT2，STAT3，STAT5B，STCl，TAFl，TBL3，TBRG4，TCFl，TCF7L2，TFAP2C，TFDPl，TFDP2，TGFA，TGFBl，TGFBI，TGFBR2，TGFBR3，THBSl，TIE，TIMPl，ΊΊΜΡ3，TJPl，TKl，TLEl，TNF，TNFRSF1OA，TNFRSF10B，TNFRSF1A，TNFRSF1B，TNFRSF6，TNFSF7，TNKl，TOBl，TP53，TP53BP2，TP53I3，TP73，TPBG，TPTl，TRADD，TRAMl，TRRAP，TSGlOI，TUFM，TXNRDl，TYR03，UBC，UBE2L6，UCHLl，USP7，VDACl，VEGF，VHL，VIL2，WEEI，WNTI，WNT2，WNT2B，WNT3，WNT5A，WTI，XRCCI，YESI，YWHAB，YWHAZ，ZAP70,和ZNF9。[0107]在一些实施方案中，本公开内容涉及包含编码与CNS相关病症有关之基因产物的核酸的rAAV载体。以下是与CNS相关病症有关的基因的非限制性列表:与阿尔茨海默病有关的DRD2、GRIA1、GRIA2、GRIN1、SLClAl、SYP、SYTl、CHRNA7、3Rtau4rTUS、APP、BAX、BCL-2、GRIKl、GFAP、IL-I、AGER;与帕金森病有关的UCH-Ll、SKPl、EGLN1、Nurr-l、BDNF、TrkB、FTL、TITF-1;与弗里德赖希共济失调有关的FXN;与卡纳万病有关的ASPA;与肌营养不良有关的DMD;以及与脊髓性肌萎缩有关的SMNl、UBE1、DYNC1H1。[0108]rAAV载体可以包含编码调节细胞凋亡的蛋白质或功能性RNA的核酸作为转基因。以下是与细胞凋亡有关的基因的非限制性列表，编码这些基因及其同源物产物的核酸和编码抑制这些基因及其同源物表达的小干扰核酸例如，shRNA、miRNA的核酸在本公开内容的某些实施方案中可用作转基因：[0109]RPS27A，ABLI，AKTI，APAFI，BAD，BAGI，BAG3，BAG4，BAKI，BAX，BCL10，BCL2，BCL2A1，BCL2L1，BCL2L10，BCL2L11，BCL2L12，BCL2L13，BCL2L2，BCLAFl，BFAR，BID，BIK，NAIP，BIRC2，BIRC3，XIAP，BIRC5，BIRC6，BIRC7，BIRC8，BNIPl，BNIP2，BNTP3，BNIP3L，BOK，BRAF，CARDlO，CARDlI，NLRC4，CARD14，N0D2，NODl，CARD6，CARD8，CARD9，CASPl，CASPlO，CASP14，CASP2，CASP3，CASP4，CASP5，CASP6，CASP7，CASP8，CASP9，CFLAR，CIDEA，CIDEB，CRADD，DAPKl，DAPK2，DFFA，DFFB，FADD，GADD45A，⑶NF，HRK，IGFIR，LTA，LTBR，MCLI，N0L3，PYCARD，RIPKI，RIPK2，TNF，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF1IB，TNFRSF12A，TNFRSF14，TNFRSF19，TNFRSF1A，TNFRSF1B，TNFRSF21，TNFRSF25，CD40，FAS，TNFRSF6B，CD27，TNFRSF9，TNFSFl0，TNFSF14，TNFSFl8，CD40LG，FASLG，CD70，TNFSF8，TNFSF9，TP53，TP53BP2，TP73，TP63，TRADD，TRAFl，TRAF2，TRAF3，TRAF4，TRAF5DRD2，GRIAl，GRIA2，GRINl，SLClAl，SYP，SYTl，CHRNA7，3Rtau4rTUS，APP，BAX，BCL-2，GRIKl，GFAP，IL-I，AGER，UCH-Ll，SKPI，EGLNl，Nurr-1，BDNF，TrkB，gstml，S106β，ITl5，PRNP，JPH3，TBP，ATXNl，ATXN2，ATXN3，AtrophinI，FTL，TITF-I，FXN，ASPA，DMD，和SMNl，UBEl，DYNC1H1。[0110]技术人员还将认识到，在编码蛋白质或多肽的转基因的情况下，可以在转基因中进行导致保守氨基酸替换的突变以提供蛋白质或多肽的功能上等同的变体或同源物。在一些方面，本公开内容包括导致转基因的保守氨基酸替换的序列改变。在一些实施方案中，转基因包含具有显性负效突变的基因。例如，转基因可以表达突变蛋白质，其与和野生型蛋白质相互作用的相同元件相互作用，从而阻断野生型蛋白质的一些方面的功能。[0111]有用的转基因产物还包括HiiRNAt3IIiiRNA和其他小干扰核酸通过靶RNA转录物切割降解或靶信使RNAmRNA的翻译抑制来调节基因表达。miRNA是天然表达的，通常作为最终的19至25个非翻译的RNA产物。miRNA通过与祀mRNA的3’非翻译区（UTR的序列特异性相互作用表现出其活性。这些内源性表达的miRNA形成发夹前体，其随后被加工成miRNA双链体，并进一步被加工成“成熟”单链miRNA分子。这种成熟miRNA引导多蛋白复合物miRISC，所述miRISC根据它们与成熟miRNA的互补性来确定革EmRNA的例如在3’UTR区中的靶位点。[0112]在所述方法的某些实施方案中，miRNA基因及其同源物的以下非限制性列表可用作转基因或用作由转基因编码的小干扰核酸例如，miRNA海绵、反义寡核苷酸、TuDRNA的靶标：[0113]hsa_let_7a，hsa_let_7a氺，hsa_let_7b，hsa_let_7b氺，hsa_let_7c，hsa_let_7c氺，hsa_let_7d，hsa_let_7d^，hsa_let_7e，hsa_let_7e^，hsa_let_7f，hsa_let_7f_l^，hsa_let-7f-2*，hsa-let-7g，hsa-let-7g*，hsa-let_7i，hsa-let-7i*，hsa_miR-l，hsa_miR-100，hsa-miR-100*，hsa_miR-101，hsa-miR-101*，hsa-miR-103，hsa_miR-105，hsa_miR-105*，hsa-miR-106a，hsa-miR-106a*，hsa-miR-106b，hsa-miR-106b*，hsa-miR-107，hsa_miR-lOa^hsa-miR-lOa^^hsa-miR-lOb^hsa-miR-lOb^^hsa-miR-llTS^hsa-miR-llTg^hsa-miR-1180，hsa_miR-1181，hsa-miR-1182，hsa-miR-1183，hsa-miR-1184，hsa-miR-1185，hsa-miR-1197，hsa_miR-1200，hsa_miR-1201，hsa_miR-1202，hsa_miR-1203，hsa_miR-1204，hsa-miR-1205，hsa-miR-1206，hsa-miR-1207-3p，hsa-miR-1207-5p，hsa-miR-1208，hsa-miR-122，hsa-miR-122*，hsa-miR-1224-3p，hsa-miR-1224-5p，hsa-miR-1225-3p，hsa-miR-1225-5p，hsa_miR-1226，hsa-miR-1226*，hsa_miR-1227，hsa_miR-1228，hsa_miR-1228*，hsa-miR-1229，hsa_miR-1231，hsa_miR-1233,hsa-miR-1234,hsa-miR-1236,hsa-miR-1237?hsa-miR-1238?hsa-miR-124?hsa-miR-124!!!!!!!!!!!!!!!!!!?hsa-miR-758?hsa-miR-760?hsa-miR-765?hsa-miR-766?hsa-miR-767-3p，hsa-miR-767-5p，hsa-miR-768-3p，hsa-miR-768-5p，hsa-miR-769-3p，hsa-miR-769-5p，hsa-miR-770-5p，hsa-miR-802，hsa-miR-873，hsa-miR-874，hsa-miR-875-3p，hsa-miR-STS-Sp^hsa-miR-STB-Sp^hsa-miR-STB-Sp^hsa-miR-STT^hsa-miR-STT^^hsa-miR-885-3p，hsa-miR-885-5p，hsa-miR-886-3p，hsa-miR-886-5p，hsa-miR-887，hsa-miR-888，hsa-miR-888*，hsa-miR-889，hsa-miR-890，hsa-miR-891a，hsa-miR-891b，hsa-miR-892a，hsa-miR-892b，hsa_miR-9，hsa-miR-9*，hsa_miR-920，hsa_miR-921，hsa_miR-922，hsa_miR-923，hsa-miR-924，hsa-miR-92a，hsa-miR-92a-l*，hsa-miR-92a-2*，hsa-miR-92b，hsa-miR-92b*，hsa-miR-93，hsa-miR-93*，hsa-miR-933，hsa-miR-934，hsa_miR-935，hsa-miR-936，hsa_miR-937，hsa_miR-938，hsa_miR-939，hsa_miR-940，hsa_miR-941，hsa_miR-942，hsa_miR-943，hsa-miR-944，hsa-miR-95，hsa_miR-96，hsa-miR-96*，hsa_miR-98，hsa_miR_99a，hsa_miR-99a*，hsa_miR-99b，和hsa_miR-99b*〇[0114]miRNA抑制其靶向的mRNA的功能，其结果是抑制由mRNA编码的多肽的表达。因此，部分或全部阻断miRNA的活性例如，使miRNA沉默可以有效诱导或恢复表达受到抑制的多肽的表达使多肽去阻抑）。在一个实施方案中，经由多种方法中的任一种通过抑制细胞中的miRNA活性来实现miRNA对mRNA靶标编码的多肽的去阻抑。例如，可以通过与和miRNA互补或基本上互补的小干扰核酸例如，反义寡核苷酸、miRNA海绵、TuDRNA杂交来实现阻断miRNA的活性，从而阻断miRNA与其革EmRNA的相互作用。如本文使用的与miRNA基本上互补的小干扰核酸是能够与miRNA杂交并阻断miRNA活性的核酸。在一些实施方案中，与miRNA基本上互补的小干扰核酸是在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碱基处与miRNA互补的小干扰核酸。在一些实施方案中，与miRNA基本上互补的小干扰核酸序列是在至少一个碱基处与miRNA互补的小干扰核酸序列。[0115]“miRNA抑制剂”是阻断miRNA功能、表达和或加工的试剂。例如，这些分子包括但不限于抑制miRNA与Drosha复合物相互作用的microRNA特异性反义、microRNA海绵、toughdecoyRNATuDRNA和microRNA寡核苷酸双链、发夹、短寡核苷酸）。如上所述，microRNA抑制剂可以由rAAV载体的转基因在细胞中表达。microRNA海绵通过互补的七聚体种子序列特异性抑制miRNAEbert，M.S.NatureMethods，Epub，2007年8月12日；）。在一些实施方案中，可以使用单个海绵序列使整个miRNA家族沉默。TuDRNA在哺乳动物细胞中实现特定miRNA的有效和长期抑制（参见例如TakeshiHaraguchi等，NucleicAcidsResearch，2009,第37卷，第6期，e43,其涉及TuDRNA的内容通过引用并入本文）。用于使细胞中miRNA功能沉默miRNA靶标的去阻抑的其他方法对于本领域普通技术人员将是显然的。[0116]在一些实施方案中，重组RNA载体的克隆能力可能受到限制，并且所期望的编码序列可能需要完全替换病毒的4.8千碱基基因组。因此，在某些情况下，大基因可能不适合用于标准重组AAV载体。技术人员将理解，在本领域中一些选择可用于克服有限的编码能力。例如，两个基因组的AAVITR可以退火以形成头尾多联体，几乎使载体的能力加倍。插入剪接位点允许从转录物中移除ITR。用于克服有限的克隆能力的其他选择对于技术人员将是显然的。[0117]使用基于rAAV的基因转移产生的体细胞转基因动物模型[0118]本公开内容还涉及使用基于重组腺相关病毒rAAV的方法产生疾病的体细胞转基因动物模型。该方法至少部分地基于如下观察:AAV血清型及其变体在成年动物中以组织特异性方式介导有效且稳定的基因转移。将rAAV元件衣壳、启动子、转基因产物组合从而实现以时间和组织特异性方式表达稳定转基因的体细胞转基因动物模型。通过本公开内容的方法产生的体细胞转基因动物可用作人疾病、病理状态的有用模型和或用于表征功能例如，组织特异性、疾病作用未知或未完全理解的基因的作用。例如，可用包含具有特定组织靶向能力例如，肝、心、胰的衣壳和具有驱动疾病涉及的基因表达的组织特异性启动子的转基因的rAAV，使动物例如，小鼠）在不同发育阶段例如，年龄感染。感染后，rAAV感染靶组织的不同细胞并产生转基因的产物。[0119]在一些实施方案中，对转基因编码区的序列进行修饰。该修饰可以改变由转基因编码的产物的功能。然后可使用本文公开的方法通过产生体细胞转基因动物模型在体内研究修饰的作用。在一些实施方案中，编码区序列的修饰是得到片段例如，截短形式的无义突变。在另一些情况下，修饰是导致氨基酸替换的错义突变。其他修饰是可能的并且对于技术人员将是显然的。[0120]在一些实施方案中，转基因导致病理状态。导致病理状态的转基因是其产物在疾病或病症中发挥作用例如，引起疾病或病症、使动物易患疾病或病症和或可在动物中诱导疾病或病症的基因。然后可以观察动物以评估疾病的许多方面例如，进展、对治疗的应答等）。这些实例并不意在限制，本文公开了其他一些方面和实例并且在以下对其进行更详细地描述。[0121]在一些方面，本公开内容提供了用于通过靶向破坏特定细胞类型来产生体细胞转基因动物模型的方法。例如，1型糖尿病模型可通过靶向破坏胰β岛来产生。在另一些实例中，靶向破坏特定细胞类型可用于评估特定细胞类型对人疾病的作用。在这方面，编码细胞毒素例如，白喉毒素AdiphtheriatoxinA，DTA的转基因或促凋亡基因（NTR、Box等可用作特定细胞类型的功能性消融的转基因。其他示例性转基因（其产物杀伤细胞包括在本文公开的方法中并且对于本领域普通技术人员将是显而易见的。[0122]在一些方面，本公开内容提供了用于产生体细胞转基因动物模型的方法，以研究基因过表达或敲低的长期影响。特定靶组织中基因的长期过表达或敲低例如，通过shRNA、miRNA、miRNA抑制剂等可干扰正常的代谢平衡并建立病理状态，从而产生疾病如癌症）的动物模型。在一些方面，本公开内容提供了用于产生体细胞转基因动物模型的方法，以研究潜在致癌基因和其他基因的基因过表达或敲低的长期影响，从而研究靶组织中的肿瘤发生和基因功能。有用的转基因广物包括已知与癌症有关的蛋白质和抑制这样的蛋白质的表达小干扰核酸。本领域技术人员可以容易地选择其他合适的转基因，只要它们可用于产生组织特异性病理状态和或疾病的动物模型。[0123]重组AAV施用方法[0124]可以根据本领域已知的任何合适的方法将rAAV以组合物递送至对象。可以将rAAV优选悬浮于生理相容的载体中（例如，以组合物）施用于对象，例如，宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类例如，猕猴）。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。[0125]将rAAV递送至哺乳动物对象的操作可以通过例如肌内注射或通过施用到哺乳动物对象的血流中来进行。可以通过注射到静脉、动脉或任何其他血管导管中来施用到血流中。在一些实施方案中，将rAAV通过分离肢体灌注外科手术领域中公知的一种技术施用到血流中，该方法基本上使得技术人员能够在施用rAAV病毒体之前将肢体与体循环分离。技术人员也可以使用分离肢体灌注技术的变体描述于美国专利No.6,177,403中）将病毒体施用到分离肢体的脉管系统中以潜在地增强向肌肉细胞或组织中的转导。此外，在某些情况下，可能期望将病毒体递送至对象的CNS。“CNS”意指脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊液CSF、胞间隙、骨、软骨等。可以使用本领域已知的神经外科技术例如，通过立体定向注射通过用针、导管或相关装置注射到例如心室区域以及注射到纹状体例如，纹状体的尾状核或壳核）、脊髓和神经肌肉接头或小脑小叶中，从而将重组AAV直接递送至CNS或脑（参见例如Stein等，JVirol73:3424-3429，1999;Davidson等，PNAS97:3428-3432,2000;Davidson等，Nat·Genet·3:219-223，1993;以及Alisky和Davidson，Hum.GeneTher·11:2315-2329,2000〇[0126]本公开内容的组合物可以仅包含rAAV或者与一种或更多种其他病毒组合例如，编码具有一种或更多种不同转基因的第二rAAV。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的rAAV，其各自具有一种或更多种不同的转基因。[0127]考虑到rAAV所针对的目标，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以用多种缓冲溶液例如，磷酸盐缓冲盐水进行配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载体的选择不是本公开内容的限制。[0128]任选地，本公开内容的组合物除rAAV和载体之外还可以包含其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。[0129]以足够的量施用rAAV以转染期望组织的细胞，并提供足够的基因转移和表达水平而没有过度的不良作用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至选定器官例如，经门静脉递送至肝）、经口、吸入包括鼻内和气管内递送）、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其他亲本施用途径。如果需要的话，则可以组合施用途径。[0130]实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量（例如，基因组拷贝每千克体重GCkg的剂量单位将根据多个因素而变化，包括但不限于:rAAV病毒体施用途径、达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平、被治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及本领域公知的其他因素容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒体剂量范围。[0131]rAAV的有效量是足以靶向感染动物、靶向期望组织的量。在一些实施方案中，rAAV的有效量是足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量将主要取决于例如对象的物种、年龄、重量、健康和待靶向的组织的因素，因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量一般是包含约IO9至IO16个基因组拷贝的约Iml至约IOOml的溶液。在一些实施方案中，以每个对象l〇13、l〇n、l〇12、IO13UO14或1〇15个基因组拷贝的剂量施用rAAV。在一些实施方案中，以每kg1013、10n、1012、IO13或IO14个基因组拷贝的剂量施用rAAV。在一些情况下，约IO11至1〇12个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在某些实施方案中，IO12个rAAV基因组拷贝对靶向心脏、肝和胰组织是有效的。在一些情况下，通过多剂量的rAAV产生稳定的转基因动物。[0132]在一些实施方案中，特别是在存在高rAAV浓度例如，约1013GCml或更高）的情况下，将rAAV组合物配制成减少组合物中AAV颗粒的聚集。用于减少rAAV聚集的方法是本领域公知的，并且包括例如添加表面活性剂、调节pH、调节盐浓度等（参见例如WrightFR等，MolecularTherapy200512,171-178,其内容通过引用并入本文）。[0133]可药用赋形剂和载体溶液的制剂是本领域技术人员公知的，用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适给药和治疗方案的开发也是如此。[0134]通常，这些制剂可以包含至少约0.1%或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地为总制剂的重量或体积的约1%或2%至约70%或80%或更高。自然地，每种治疗上有用的组合物中的活性化合物的量可以以这样的方式准备，以使得在任何给定单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。制备这样的药物制剂的技术人员将考虑例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。[0135]在某些情况下，期望经皮下、胰内、鼻内、肠外、静脉内、肌内、鞘内或经口、腹膜内或通过吸入递送本文公开的经适当配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗性构建体。在一些实施方案中，如美国专利No.5，543，158、5，641，515和5，399，363各自明确地通过引用整体并入本文）中所述的施用形式可用于递送rAAV。在一些实施方案中，一种优选的施用方式是通过门静脉注射。[0136]适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。分散体也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，所述形式为无菌的并且流动性达到容易注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须被保藏以免受微生物（例如细菌和真菌）的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和或植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。预防微生物的作用可通过多种抗菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。[0137]对于施用可注射水溶液，例如，如果需要的话，溶液可以适当地进行缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，可使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在Iml等渗NaCl溶液中，并且被添加到IOOOml的皮下灌注流体中或者在建议的输注部位处注射参见例如，“RemingtorsPharmaceuticalSciences”第15版，第1035至1038页和第1570至1580页）。一些剂量变化必然会根据宿主的情况而发生。无论如何，负责施用的人将确定单个宿主的合适剂量。[0138]无菌可注射溶液通过如下制备:将所需量的活性rAAV与本文列举的多种其他成分根据需要并入合适的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将多种无菌活性成分并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分与任何另外的所期望成分的粉末。[0139]本文公开的rAAV组合物也可以被配制成中性或盐形式。可药用盐包括与无机酸例如，盐酸或磷酸或者如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等这样的有机酸形成的酸加成盐与蛋白质的游离氨基形成）。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物，以及例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。配制后，将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用溶液。所述制剂易于以多种剂型（例如可注射溶液、药物释放胶囊等施用。[0140]如本文使用的“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。也可以将补充的活性成分并入组合物中。术语“可药用”是指当施用于宿主时不产生变应或类似不良反应的分子实体和组合物。[0141]递送载剂例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本公开内容的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以被配制成用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中递送。[0142]这样的制剂对于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的可药用制剂可以是优选的。脂质体的形成和使用是本领域技术人员公知的。近来，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体美国专利No.5,741，516。此外，已经描述了将脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的多种方法美国专利No.5，567，434;5，552，157;5，565，213;5，738，868和5,795,587。[0143]已成功地将脂质体用于许多细胞类型，所述细胞类型通常对通过其他方法的转染具有抵抗力。此外，脂质体不受DNA长度限制（其是基于病毒的递送系统的特征）。已将脂质体有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种经培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了检查脂质体介导药物递送的有效性的若干次成功的临床试验。[0144]脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡（也称为多层囊泡MLV的磷脂形成。MLV的直径一般为25nm至Aym13MLV的超声处理导致形成直径为200至500.ANG.的在核心中包含水溶液的小单层囊泡smallunilamellarvesicle，SUV。[0145]或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定和可重复的方式捕获物质。为了避免由于细胞内聚合物过载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计这样的超微颗粒尺寸约〇.Ιμπι。预期使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。[0146]除了上述递送方法之外，还预期将以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。在美国专利如.5,656,016中已使用和描述了将超声促渗（8〇11^11〇^8丨8即，超声）作为用于提高药物渗入并通过循环系统的速率和功效的装置。预期其他药物递送替代方案是骨内注射（美国专利如.5,779,708、微芯片装置（美国专利如.5,797,898、眼用制剂Bourlais等，1998、透皮基质（美国专利No.5，770，219和5，783，208和反馈控制递送美国专利No.5,697,899。[0147]试剂盒和相关组合物[0148]在一些实施方案中，本文所述的药剂可被组装成药物或诊断或研究试剂盒以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可以包含容纳有本公开内容的组分的一个或更多个容器和使用说明书。具体地，这样的试剂盒可以包含本文所述的一种或更多种药剂以及描述这些药剂的预期应用和适当用途的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的药剂可以是适用于特定应用和适用于药剂施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含适当浓度或量的组分以用于进行多种实验。[0149]试剂盒可以被设计成辅助研究人员使用本文所述的方法并且可以采取许多形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式例如，以溶液或固体形式例如，干粉末提供。在某些情况下，一些组合物可以是可组成的或以其他方式可加工的（例如，加工为活性形式），例如通过添加合适的溶剂或其他物质（例如，水或细胞培养基），其可以与或可以不与试剂盒一起提供。如本文使用的“说明书”可以确定说明和或推广的组分，并且通常包括在本公开内容的包装上或与其有关的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，以使得使用者将清楚地认识到说明书与该试剂盒有关，例如音像例如，录像带、DVD等）、因特网和或基于网络的通信等。书面说明书可以是由管理药品或生物制品制造、使用或销售的政府机构所规定的形式，该说明书还可反映所述机构对用于动物施用的制造、使用或销售的许可。[0150]试剂盒可以包含一个或更多个容器中的本文所述的任一种或更多种组分。作为一个实例，在一个实施方案中，试剂盒可以包含用于混合试剂盒中的一种或更多种组分和或分离和混合样品并施用于对象的说明书。试剂盒可以包含容纳有本文所述的药剂的容器。所述药剂可以是液体、凝胶或固体粉末形式。所述药剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷藏运送。或者，其可以被放置在小瓶或其他容器中用于储存。第二容器可以具有无菌制备的其他药剂。或者，试剂盒可以包含预先混合并在注射器、小瓶、管或其他容器中运送的活性剂。试剂盒可以具有将药剂施用于动物所需的一种或更多种或全部组件，例如注射器、局部施用装置或iv针管和包，特别是在用于产生特定体细胞动物模型的试剂盒的情况下。[0151]试剂盒可以具有多种形式，例如泡罩袋、收缩包装袋、真空可密封袋、可密封的热成型盘或类似的袋或盘形式，其中附件松散地包装在袋、一个或更多个管、容器、箱或包中。在增加附件后，可以对试剂盒进行灭菌，从而使容器中的各个附件不会散开。可以使用任何合适的灭菌技术例如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法将试剂盒灭菌。根据具体应用，试剂盒还可以包含其他组件，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲剂、试剂、注射器、针、用于施用或去除消毒剂的织物如纱布、一次性手套、施用前的药剂支架等。[0152]试剂盒中包含的说明书可以包括用于检测细胞中的潜在AAV的方法。此外，本公开内容的试剂盒可以包含说明书、阴性和或阳性对照、容器、用于样品的稀释剂和缓冲剂、样品制备管和用于序列比较的参照AAV序列的印刷或电子表。实施例[0153]实施例1:从黑猩猩组织中分离转录活性新型AAV衣壳序列以用于载体开发[0154]为了寻找倾向于感染灵长类的新型AAV，分析了多个黑猩猩组织中AAV前病毒基因组和capRNA的存在，其中首先使用一组引物和探针通过qPCR和qRT-PCR来靶向短保守cap序列段。评估了来自两只黑猩猩的六个组织脑、心脏、肾、肝、肺和脾的AAVcap序列。数据表明，所有组织均具有可变丰度的AAV，其中肝中的拷贝数最高。随后，进行PCR和RT-PCR克隆来挽救来自黑猩猩DNA和RNA两者的全长衣壳序列。通过测序分析cDNA克隆（例如，VPl的克隆）。通过RT-PCR和PCR分离VPl的总计24个DNA和23个RNA克隆并进行完全测序。有趣的是，这47个克隆中有30个是AAV5样的，其中14个克隆是RT-PCR的产物。[0155]系统进化分析将衣壳克隆分为与AAV3B、AAV4和AAV5密切相关的三个主要组，其可用于基因递送至多种组织（例如，CNS、肾、脾、肝和心脏靶标）。表1列出了所鉴定的AAV衣壳变体。表2提供了与鉴定的变体序列有关的野生型AAV血清型的NCBI登录号。[0156]通过BLAST分析和多重序列比对选择具有与AAV3B、AAV4或AAV5及其自身内部的氨基酸差异的变体capcDNA克隆，以用于进行进一步表征表3。变体衣壳蛋白与野生型AAV血清型之间的氨基酸替换总结在表4-6中。[0157]构建包含示例衣壳（S卩，CBr-7.4、CBr-7.5和CBr-7.8衣壳）的重组AAV并包装成包含萤光素酶表达载体基因组。对于CBr-7.4、CBr-7.5和CBr-7.8，产生的rAAV的滴度分别为1.3父101、1.2\101和1.2\101个基因组拷贝1111。用重组厶厶¥转导!11111-7.5肝瘤细胞并检查萤光素酶表达以确认转导和表达图4。检查作为对照的AAV9和AAV3B。[0158]表1:新型AAV的序列[0161][0162]表2:AAVCAPSID序列变体[0164]表3:AAV3B变体之间的氨基酸变化[0166]表4:AAV4变体之间的氨基酸变化[0168][0169]表5:AAV5变体之间的氨基酸变化[0171][0172]本公开内容并不将其应用限于本说明书中阐述或附图中所示的构造细节和组件布置。本公开内容能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。另外，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的并且不应被认为是限制。本文使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变体意指涵盖此后列出的项目及其等同物以及另外的项目。[0173]至此已描述了本公开内容的至少一个实施方案的若干方面，应当理解，本领域技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在成为本公开内容的一部分并且旨在包含在本公开内容的精神和范围内。因此，上述说明书和附图仅作为示例。

权利要求：1.重组表达载体，其包含选自SEQIDNO:1至47的序列或其片段，其不编码与SEQIDNO:98至100中任一序列相同的肽。2.分离的AAV衣壳蛋白，其包含选自SEQIDN0:51至97的氨基酸序列。3.分离的AAV衣壳蛋白，其包含选自SEQIDN0:51至61的序列，其中所述序列中与SEQIDN0:98所示序列的对应氨基酸不同的氨基酸由保守替换所代替。4.分离的AAV衣壳蛋白，其包含选自SEQIDN0:62至67的序列，其中所述序列中与SEQIDN0:99所示序列的对应氨基酸不同的氨基酸由保守替换所代替。5.分离的AAV衣壳蛋白，其包含选自SEQIDN0:68至97的序列，其中所述序列中与SEQIDNO:100所示序列的对应氨基酸不同的氨基酸由保守替换所代替。6.权利要求2至5中任一项所述的分离的AAV衣壳蛋白的肽片段，其不与SEQIDN0:98至100中任一序列相同。7.分离的AAV衣壳蛋白，其包含权利要求6所述的肽片段。8.重组表达载体，其包含编码权利要求2至5中任一项所述的分离的AAV衣壳蛋白之核酸序列。9.组合物，其包含权利要求2至5中任一项所述的分离的AAV衣壳蛋白。10.组合物，其包含权利要求2至5中任一项所述的分离的AAV衣壳蛋白和可药用载体。11.重组AAVrAAV，其包含权利要求2至5中任一项所述的分离的AAV衣壳蛋白。12.组合物，其包含权利要求11所述的重组rAAV。13.权利要求12所述的组合物，其还包含可药用载体。14.含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQIDNO:1至47的编码序列。15.组合物，其包含权利要求14所述的宿主细胞和无菌细胞培养基。16.组合物，其包含权利要求15所述的宿主细胞和冷冻保存剂。17.用于将转基因递送至对象的方法，其包括：将权利要求11所述的rAAV施用于对象，其中所述rAAV包含至少一种转基因，并且其中所述rAAV感染所述对象靶组织的细胞。18.用于产生体细胞转基因动物模型的方法，其包括向非人动物施用权利要求11的重组rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因，并且其中所述rAAV感染所述非人动物靶组织的细胞。19.权利要求17所述的方法，其中所述至少一种转基因是蛋白质编码基因。20.权利要求17所述的方法，其中所述至少一种转基因编码小干扰核酸。21.权利要求20所述的方法，其中所述小干扰核酸是miRNA。22.权利要求20所述的方法，其中所述小干扰核酸是抑制所述对象或动物中至少一种miRNA之活性的miRNA海绵或TuDRNA。23.权利要求22所述的方法，其中所述miRNA在所述靶组织的细胞中表达。24.权利要求17所述的方法，其中所述靶组织是骨骼肌、心、肝、胰、脑或肺。25.权利要求18所述的方法，其中所述转基因表达包含至少一个miRNA结合位点的转录物，其中所述miRNA通过与所述结合位点杂交来抑制所述靶组织以外的组织中所述转基因的活性。26.用于产生体细胞转基因动物模型的方法，其包括向非人动物施用权利要求23所述的rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因，其中所述转基因表达包含至少一个miRNA结合位点的转录物，其中所述miRNA通过与所述转录物的结合位点杂交来抑制革El组织以外的组织中所述转基因的活性。27.权利要求26所述的方法，其中所述转基因包含组织特异性启动子或诱导型启动子。28.权利要求27所述的方法，其中所述组织特异性启动子是肝特异性甲状腺素结合球蛋白（TBG启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽PPY启动子、突触蛋白-ISyn启动子、肌酸激酶MCK启动子、哺乳动物结蛋白（DES启动子、α-肌球蛋白重链a-MHC启动子或心肌肌钙蛋白TcTnT启动子。29.权利要求17所述的方法，其中经静脉内、透皮、眼内、鞘内、经口、肌内、皮下、鼻内或通过吸入来施用所述rAAV。30.权利要求17所述的方法，其中所述对象选自小鼠、大鼠、兔、狗、猫、绵羊、猪和非人灵长类。31.权利要求17所述的方法，其中所述对象是人。32.通过权利要求18所述的方法产生的体细胞转基因动物模型。33.用于产生rAAV的试剂盒，所述试剂盒包含：容纳有具有SEQIDNO:1至47中任一序列之分离核酸的容器。34.权利要求33所述的试剂盒，其还包含用于产生所述rAAV的说明书。35.权利要求34所述的试剂盒，其还包含至少一个容纳有重组AAV载体的容器，其中所述重组AAV载体包含转基因。36.试剂盒，其包含：容纳有具有权利要求2至5中任一项所述的分离AAV衣壳蛋白的重组AAV的容器。37.权利要求36所述的试剂盒，其中所述容器是注射器。38.分离的AAV衣壳蛋白，其由选自SEQIDNO:1至47的核酸编码。39.权利要求38所述的分离的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白是VPl衣壳蛋白。40.权利要求38所述的分离的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白是VP2衣壳蛋白。41.权利要求38所述的分离的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白是VP3衣壳蛋白。42.包含权利要求38至41中任一项所述的衣壳蛋白的假型AAV。

百度查询： 马萨诸塞大学 重组AAV变体及其用途

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