申请/专利权人：温州医科大学

申请日：2019-05-19

公开（公告）日：2021-09-17

公开（公告）号：CN110074097B

主分类号：A01N1/02(20060101)

分类号：A01N1/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.09.17#授权;2019.08.27#实质审查的生效;2019.08.02#公开

摘要：本发明的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，是以浓度为10～100gL的甘油明胶复合物水溶液作为基础溶液，甘油明胶复合物中甘油：明胶的质量比为10∶1，基础溶液中添加香蜂草苷、生长因子、棕榈酰三肽‑1、肝素泊洛沙姆和维生素C，将卵巢置于该溶液体系中进行冻存，可以提高冻存卵巢复苏后的生物学活性。

主权项：1.一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其主要特征在于：所述的溶液体系是以浓度为10～100gL的甘油明胶复合物水溶液作为基础溶液，所述的甘油明胶复合物中甘油∶明胶的质量比为10∶1，所述的基础溶液中添加香蜂草苷、生长因子、棕榈酰三肽-1、肝素泊洛沙姆和维生素C，所述的生长因子为卵巢颗粒细胞激素、血管内皮生长因子、神经营养因子、转化生长因子中的一种，所述的基础溶液中香蜂草苷的浓度为0.001gL～0.5gL、生长因子的浓度为0.001gL～0.05gL、棕榈酰三肽-1的浓度为0.001gL～0.5gL、肝素泊洛沙姆的浓度10gL～60gL、维生素C的浓度0.001gL～0.5gL，

全文数据：一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系技术领域本发明涉及一种冻存卵巢活性复苏的方法，特别涉及卵巢的冻存保存溶液及其使用方法。背景技术卵巢是雌性动物的生殖器官。卵巢微环境是指卵巢的发育成熟情况、卵巢的组织细胞结构是否完整、卵巢中含有的原始卵泡的数量、原始卵泡能否发育成熟并排卵、卵巢浆膜层的厚度及成熟卵子能否顺利排出、盆腔的炎症及粘连情况、卵巢激素分泌细胞功能、体内性激素的水平和比例、末梢神经功能及调节情况、微血管系统功能及血液供应供应氧气、营养物质，排除细胞代谢产物情况等的统称，这些因素共同构成卵巢微环境。卵巢微环境影响着排出卵泡是否成熟，调理卵巢微环境有助于提高排出卵泡质量，提高受孕机率。卵巢组织冻存技术是保证女性生育力的最有潜力和最受关注的技术之一。在冻存过程中，维护卵巢是微环境是最难攻克的瓶颈。已有报道的卵巢冷冻保存液常采用二甲基亚砜DMSO、丙二醇、蔗糖、海藻糖、甘油、动物血清等冷冻保护剂，但这类冷冻保护剂效果不理想且具有细胞毒性如DMSO或潜在安全性问题如动物血清。因此，研究一种无毒且细胞存活率高的冷冻保护剂，就成为卵巢冷冻领域亟待解决的一个问题。具有无毒性及保存细胞活性，已成为近年冷冻保护剂领域研究热点。冷冻保护剂在避免人卵巢组织冷冻过程中的冷冻损伤发挥重要作用，但其自身也存在组织细胞毒性，在冷冻预平衡的过程中，卵巢组织长时间30-90分钟地置于冷冻保护剂中，由于平衡的时间过长，冷冻保护剂往往会使卵巢组织受到细胞毒性损伤，导致卵母细胞发育能力下降。尽管通过冷冻保存卵巢进行胚胎体外生产已经成功，但是解冻后卵母细胞数量和质量大幅度下降，造成了卵母细胞的极大浪费，卵母细胞成熟率和胚胎发育能力较低。目前虽然开发出了多种冷冻保存溶液，但其保存时间和复苏活性均不理想，急需开发一种能长时间保持卵巢的生物学活性的保存溶液体系。为了满足临床治疗的需要，理想的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系需要符合以下要求：1有利于维护卵巢的微环境；2制剂组分安全性高，制备方便，配合冷冻保存方式应用，保存时间长；3容易被清洗去除，不会对机体产生副作用，且不影响卵巢的正常功能和生物活性；4冻存的卵巢活性复苏快，且解冻后卵母细胞数量和质量得到保证。目前尚未见到满足以上所有要求的卵巢冷冻保存溶液体系的报道。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺点即已有的冻存保护溶液不能保持卵巢长期冻存后的生物学活性，影响卵母细胞数量和质量的问题，提供保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，为长时间保持卵巢长期冻存后生物学活性提供最大的微环境保障，同时满足理想的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系的各项要求，为实现临床治疗的安全、有效、便捷、经济奠定基础。本发明的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系是以浓度为10～100gL的甘油明胶复合物水溶液作为基础溶液，甘油明胶复合物中甘油∶明胶的质量比为10∶1，基础溶液中添加香蜂草苷、生长因子、棕榈酰三肽-1、肝素泊洛沙姆和维生素C，所述的基础溶液中香蜂草苷的浓度为0.001gL～0.5gL、生长因子的浓度为0.001gL～0.05gL、棕榈酰三肽-1的浓度为0.001gL～0.5gL、肝素泊洛沙姆的浓度10gL～60gL、维生素C的浓度0.001gL～0.5gL。上述的溶液体系是以浓度为20～50gL的甘油明胶复合物水溶液作为基础溶液，所述的基础溶液中香蜂草苷的浓度为0.005gL～0.01gL、生长因子的浓度为0.005gL～0.01gL、棕榈酰三肽-1的浓度为0.01gL～0.2gL、肝素泊洛沙姆的浓度15gL～30gL、维生素C的浓度0.05gL～0.2gL。上述的基础溶液中可以进一步加入多元醇，包括：乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇。上述的基础溶液中可以进一步加入糖，包括：蔗糖、乳糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、山梨糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、淀粉、糊精。上述的生长因子，包括：卵巢颗粒细胞激素、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经营养因子、转化生长因子。上述的生长因子优选碱性成纤维细胞生长因子。上述的冻存是指采用0℃以下温度的冷冻过程。一种上述的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系制备方法为：1将明胶置于容器中，加入明胶质量2倍的水浸泡，充分溶胀后置100℃水浴中加热使溶解，充分溶解后加入甘油，搅拌均匀，温度降至15℃，形成甘油明胶复合物水溶液；2肝素泊洛沙姆溶解于4倍质量的水中，加入香蜂草苷、生长因子和棕榈酰三肽-1，搅拌均匀，加入甘油明胶复合物水溶液，混匀后加入维生素C，混匀即成保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系。上述的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系中可以进一步加入药学常用的渗透压调节剂、电解质、抗氧剂、抑菌剂。上述的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系在0～4℃避光环境中保存。本发明的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系与现有的卵巢保存溶液相比，具有以下优点：①不使用DMSO、动物血清等任何有潜在安全风险的试剂，不会产生因试剂残留导致的毒副反应；②有利于维护卵巢的微环境；③制剂组分安全性高，制备方便，配合冷冻保存方式应用，保存时间长；④容易被清洗去除，不会对机体产生副作用，且不影响卵巢的正常功能和生物活性；⑤冻存的卵巢活性复苏快，且解冻后卵母细胞数量和质量得到保证。具体实施方式下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合，从而达到更好的技术效果。实施例1保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系的制备按照表1的组分比例，配制保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系。保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系的制备方法如下：1称取规定量的明胶，置于适宜容器中，加入明胶质量2倍的水浸泡，充分溶胀后置100℃水浴中加热使溶解，充分溶解后加入甘油，搅拌均匀，温度降至15℃，形成甘油明胶复合物水溶液；2肝素泊洛沙姆溶解于4倍质量的水中，加入香蜂草苷、生长因子和棕榈酰三肽-1，搅拌均匀，加入甘油明胶复合物水溶液，混匀后加入维生素C，混匀即成保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系。各个实验组是根据本申请权利要求项保护范围内的组分和比例配置的，而各个对照组是某项组分缺失、替换或组分浓度超出本申请权利要求项保护范围的样品。表1保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系的实验组和对照组组成注：“”代表该项组分不存在，“*”代表该项组分列名组分被表格内的组分所替换。实施例2羊卵巢的冷冻复苏活性评价实施例1制备的各实验组和对照组溶液经过以下冻存和复苏过程，然后测定复苏后的羊卵巢活性，用于保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系的应用效果评价。冻存：分别将分离处理好的羊卵巢放入装有促进冻存卵巢活性复苏溶液的50mL冷冻袋中，程序化冷冻至-90℃，保持5min，随后将装有卵巢的冻存袋投入液氮中存放。复苏：一周后各组样本自液氮取出，置于37℃水浴融化至冰水混合物，时刻摇动直至完全融化。活性测定：依据文献【Fundamentalsofcryobiologyinreproductivemedicine.ReprodBiomedOnline.2004，96：680-691.和Wholesheepovarycryopreservation：evaluationofaslowfreezingprotocolwithdimethylsulphoxide.JAssistReprodGenet.2011，281：7-14.】，通过卵巢组织形态、原始卵泡计数、凋亡细胞染色等指标，评价保存卵巢活性的冻存复苏溶液应用效果。以正常卵巢为对照各项指标满分，给各组评分，效果越高评分越高，满分10分。实验组和对照组的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系的对于羊卵巢的应用效果评价结果见表2。表2实验组和对照组的羊卵巢应用效果评价结果组织形态观察结果表明，实验组的羊卵巢中卵母细胞呈球形，内含完整圆形的细胞核，周围被均匀分布的单层颗粒细胞包绕。而对照组的羊卵巢中卵泡表现为细胞核固缩，基底膜不完整，周围颗粒细胞排列紊乱。原始卵泡计数结果表明，实验组的羊卵巢中原始卵泡数目多，正常形态原始卵泡比率高于90％，接近正常组的94％的比率。而对照组的羊卵巢中原始卵泡数目少，正常形态原始卵泡比率低于80％，明显有别于实验组。凋亡细胞染色结果也进一步表明，实验组的羊卵巢皮质部分的细胞凋亡率明显低于对照组，表明本发明的组分组合有利于维护卵巢微环境。从综合评分看，实验组中2组和8组的效果较好，其次是7组、6组和1组。而对照组明显劣于实验组，其中4组的效果最差，其次是9、10、12、17、18组，其余对照组结果接近。上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

权利要求：1.一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其主要特征在于：所述的溶液体系是以浓度为10～100gL的甘油明胶复合物水溶液作为基础溶液，所述的甘油明胶复合物中甘油：明胶的质量比为10∶1，所述的基础溶液中添加香蜂草苷、生长因子、棕榈酰三肽-1、肝素泊洛沙姆和维生素C，所述的基础溶液中香蜂草苷的浓度为0.001gL～0.5gL、生长因子的浓度为0.001gL～0.05gL、棕榈酰三肽-1的浓度为0.001gL～0.5gL、肝素泊洛沙姆的浓度10gL～60gL、维生素C的浓度0.001gL～0.5gL。2.根据权利要求1的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其主要特征在于：所述的溶液体系是以浓度为20～50gL的甘油明胶复合物水溶液作为基础溶液，所述的基础溶液中香蜂草苷的浓度为0.005gL～0.01gL、生长因子的浓度为0.005gL～0.01gL、棕榈酰三肽-1的浓度为0.01gL～0.2gL、肝素泊洛沙姆的浓度15gL～30gL、维生素C的浓度0.05gL～0.2gL。3.根据权利要求1的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其特征是：所述的基础溶液中可以进一步加入多元醇，包括：乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇。4.根据权利要求1的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其特征是：所述的基础溶液中可以进一步加入糖，包括：蔗糖、乳糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、山梨糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、淀粉、糊精。5.根据权利要求1的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其特征是：所述的生长因子，包括：卵巢颗粒细胞激素、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经营养因子、转化生长因子。6.根据权利要求5的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其特征是：所述的生长因子优选碱性成纤维细胞生长因子。7.根据权利要求1～6的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系，其特征是：所述的冻存是指采用0℃以下温度的冷冻过程。8.一种权利要求1～6的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系制备方法，其特征是：制备方法为：1将明胶置于容器中，加入明胶质量2倍的水浸泡，充分溶胀后置100℃水浴中加热使溶解，充分溶解后加入甘油，搅拌均匀，温度降至15℃，形成甘油明胶复合物水溶液；2肝素泊洛沙姆溶解于4倍质量的水中，加入香蜂草苷、生长因子和棕榈酰三肽-1，搅拌均匀，加入甘油明胶复合物水溶液，混匀后加入维生素C，混匀即成保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系。9.根据权利要求8的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系制备方法，其特征是：所述的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系中可以进一步加入药学常用的渗透压调节剂、电解质、抗氧剂、抑菌剂。10.根据权利要求8的一种保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系制备方法，其特征是：所述的保存卵巢活性的冻存复苏溶液体系在0～4℃避光环境中保存。

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