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【发明公布】使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法_优牙生物科技(上海)有限公司_202110732975.3 

申请/专利权人:优牙生物科技(上海)有限公司

申请日:2021-06-30

公开(公告)日:2021-09-21

公开(公告)号:CN113416692A

主分类号:C12N5/0775(20100101)

分类号:C12N5/0775(20100101);A01K67/027(20060101);A61K35/28(20150101);A61P9/10(20060101)

优先权:

专利状态码:失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态:2022.01.11#发明专利申请公布后的撤回;2021.10.12#实质审查的生效;2021.09.21#公开

摘要:本发明涉及牙髓干细治疗技术领域,尤其为一种使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法,牙髓干细胞来源的外泌体获取,从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和和牙周病变的第三磨牙‑75%酒精消毒牙齿表面‑牙科钻头取出牙髓‑切成1mm3小块‑用含有2.5%抗生素的PBS冲洗3次‑将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mgml的I型胶原酶消化‑4mgmL的分散酶37℃放置30分钟‑细胞重悬‑37℃5%CO2温箱中培养。脑组织是机体对缺血缺氧最敏感的器官,血流供应中断数分钟即发生不可逆的脑损伤,本发明通过动物实验发现,牙髓干细胞来源的外泌体可减轻小鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死面积,为实现牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的临床应用提供了关键技术。

主权项:1.使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法,其特征在于:具体的步骤为S1:牙髓干细胞来源的外泌体获取,从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和和牙周病变的第三磨牙-75%酒精消毒牙齿表面-牙科钻头取出牙髓-切成1mm3小块-用含有2.5%抗生素的PBS冲洗3次-将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mgml的I型胶原酶消化-4mgmL的分散酶37℃放置30分钟-细胞重悬-37℃5%CO2温箱中培养培养基:DMEM+10%的胎牛血清+100UmL青霉素和100ugmL链霉素-5天之后换液,之后每三天更换一次;待细胞融合至80%左右后,消化离心,传至第三代;第三代细胞融合至80%左右,去除上层培养液,PBS清洗三次,换为无血清培养基,继续培养48小时后收集上层培养液;S2:将该培养液4℃,3000g,离心15min,去除细胞及细胞碎片,上清液转移到无菌容器中,添加适当体积的ExoQuick-TCSystemBiosciences,LLC每10ml样本加入2ml试剂倒转试管充分混,4℃过夜;后1500g离心30min,外泌体在试管底部呈米色或白色沉;去除上清4℃,1500g,5min,去除残留的试剂,抽吸去除上层液体;100μlPBS吹打沉淀重悬,即外泌体溶液;-80℃长期保存;S3:小鼠脑缺血再灌注损伤模型制作,小鼠用2%异氟醚N2O270%:30%混合物麻醉,并通过面罩用1%异氟醚维持;固定小鼠于手术台后,用镊子提起小鼠颈部皮肤,自胸骨柄到下颌骨间行1cm长的正中纵切口,暴露两个下颌下腺,将它们钝性分开,将右侧的腺体拉向旁侧,以暴露胸锁乳突肌,把小鼠移至解剖显微镜下,调节放大倍数至20倍,用拉钩拉开胸锁乳突肌肌腹,并固定,暴露肩胛舌骨肌,将肩胛舌骨肌钝性撕断,分离二腹肌下腹并用自制拉钩拉开固定,暴露颈动脉鞘,小心撕开颈动脉鞘,暴露颈总动脉并轻轻分离,小心不要损伤与之伴行的迷走神经,用6-0丝线结扎颈总动脉近心断,分离颈外动脉,结扎颈外动脉近心断,分离颈内动脉,用动脉瘤阻断夹临时阻断颈内动脉,在颈总动脉远端的动脉壁上用显微剪刀剪一个小口,用硅胶涂层6-0尼龙长丝线栓广州佳灵生物技术有限公司通过小口插向颈总动脉分叉处,松开临时阻断夹,推送线栓使其进入颈内动脉,遇到轻微阻力后丝线结扎固定丝线,此时线栓头端距颈动脉分叉约9-10mm,将下颌下腺归位,缝合皮肤,2h后实行再灌注,将线栓拔出后结扎颈总动脉远端并缝合皮肤;2h后模型组尾静脉注射100μlPBS,外泌体干预组尾静脉注射含10μg外泌体的PBS溶液100μl;S4:小鼠脑组织切片染色,造模后第7天处死小鼠,取出大脑,将大脑在-80℃下冷冻10分钟,并在冠状面上切成2毫米厚的切片;使用2,3,5-氯化三苯基四唑TTC染色TTC,Sigma-Aldrich,德国评估脑梗死体积大小;脑切片在2%TTC溶液中于37℃孵育15分钟,并用4%多聚甲醛固定;然后用数码相机拍摄染色切片;用AdobePhotoshop2020软件美国国立卫生研究院测量梗死体积;脑梗死面积计算方法如下:脑梗死面积%=白色脑组织总面积脑组织总面积×100%。

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权利要求:

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