申请/专利权人：清华大学

申请日：2017-08-31

公开（公告）日：2021-09-21

公开（公告）号：CN109419789B

主分类号：A61K31/164(20060101)

分类号：A61K31/164(20060101);A61K31/16(20060101);A61P37/02(20060101);A61P1/00(20060101);A61P29/00(20060101);A61P19/08(20060101);A61P19/00(20060101);A61P37/04(20060101);A61P43/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.09.21#授权;2019.03.29#实质审查的生效;2019.03.05#公开

摘要：本发明公开了一种治疗和或预防免疫紊乱疾病的化合物及其应用。本发明所提供的应用具体为式I或式II或式III所示化合物或其可药用盐在如下任一中的应用：A制备用于预防和或治疗免疫紊乱相关疾病的产品；B制备用于调节外周免疫系统功能的产品；C预防和或治疗免疫紊乱相关疾病；D调节外周免疫系统功能所示。实验证明，三个化合物均能够驱动肠道来源的树突状细胞表达CD103、CD11b以及视黄醛脱氢酶向淋巴结转移。本发明对于预防和或治疗免疫紊乱相关疾病如风湿，红斑狼疮，肠炎，多发性硬化，并增强机体免疫功能具有重要意义。

主权项：1.式III所示化合物或其可药用盐在如下任一中的应用：E制备用于在正常机体驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移的产品；F制备用于在正常机体促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能的产品；

全文数据：治疗和或预防免疫紊乱疾病的化合物及其应用技术领域本发明属于生物技术领域，涉及一种治疗和或预防免疫紊乱疾病的化合物及其应用。背景技术微生物从皮肤，口腔，呼吸道等部位进入动物体内，它们和宿主一同进化，互相影响，抑制和调节对方的功能。研究这些共生菌和宿主之间的调控机制对人类健康有重要意义。其中免疫工作者们最为关注的是肠道共生菌对宿主代谢和抗感染作用的影响。其中一个课题是共生菌如何调控宿主免疫功能。大部分文献的研究重点是肠道局部的免疫调控。这可能只是冰山一角，共生菌对免疫系统的作用也许并不止步于肠道。例如无菌动物有明显的外周免疫缺陷，主要表现为全身二级淋巴器官也就是淋巴结的发育不全。因为淋巴结是免疫反应的起源地，共生菌如何远距离调控这些广泛分布的免疫器官也就成了一个重要课题。然而到目前为止，这些共生菌与外周免疫系统发育的联系尚不明确。淋巴结的发育是一个精密而复杂的过程。在胚胎时，淋巴结的原基出现在上皮细胞簇中。在受到附近神经末梢发出的视黄酸刺激后，淋巴组织诱导细胞LTi开始启动原始淋巴结构的发育。小鼠出生之后，LTi细胞不再停留，然而外周淋巴结持续变大，含有的细胞数也继续增加。出生后一到两周，渗滤过来的淋巴细胞形成清晰的T和B细胞区，几乎和成年小鼠淋巴结一样。与此相反，出生后无菌动物淋巴结的发育完全停止。上述发育上的问题带来了免疫反应的缺陷。无菌小鼠在被肠道致病菌弗氏志贺菌感染后，免疫反应不强。沙门氏杆菌感染在无菌小鼠中的症状也更严重。作为免疫应答的主要场所，可以想象淋巴结结构上的缺陷会导致免疫反应的紊乱。那么肠道菌落是如何在出生后启动淋巴结的发育呢？是肠道中的哪类菌，哪种活性成分发挥作用呢？发明内容本发明的目的是提供一种治疗和或预防免疫紊乱疾病的化合物及其应用。本发明所提供的应用具体可为式I或式II或式III所示化合物或其可药用盐在如下A-D任一中的应用也属于本发明的保护范围：A制备用于预防和或治疗免疫紊乱相关疾病的产品；B制备用于调节外周免疫系统功能的产品；C预防和或治疗免疫紊乱相关疾病；D调节外周免疫系统功能；本发明所提供的应用也可为式I或式II或式III所示化合物同上或其可药用盐在如下E-H任一中的应用：E制备用于驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移的产品；F制备用于促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能的产品；G驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移；H促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能。本发明还请求保护具有如下a-d所示功能中至少一种的产品，其活性成分为式I或式II或式III所示化合物同上或其可药用盐；a预防和或治疗免疫紊乱相关疾病；b调节外周免疫系统功能；c驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移；d促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能。在本发明中，前文所有所述免疫紊乱相关疾病均具体可为风湿、红斑狼疮、肠炎、多发性硬化，强直性脊柱炎等自体免疫疾病和过度免疫炎症反应。在本发明中，前文所有所述肠道来源的树突状细胞均具体为表达CD103、CD11b以及视黄醛脱氢酶的肠道来源的树突状细胞。在本发明的一个实施例中，前文所有所述驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移均具体为驱动所述肠道来源的树突状细胞向肠系膜淋巴结和或非肠系外周淋巴结转移。实验证明，本发明从热带假丝酵母菌脂类提取物中进一步提取所得的式I和式II所示化合物，与内源性大麻素AEA式III结构相似，三者均能够驱动肠道来源的树突状细胞表达CD103、CD11b以及视黄醛脱氢酶向淋巴结转移。因此，在实际应用中，有望可以通过口腔摄入和注射这些化合物可化学方法合成或使用肠道真菌来源的内源性大麻素，来调节机体免疫反应的强度、类型，以及各免疫细胞亚型的数量和功能，从而达到治疗和或预防免疫紊乱相关疾病，如风湿，红斑狼疮，肠炎，多发性硬化，并增强免疫功能如免疫治疗和疫苗接种的目的。附图说明图1为从成年正常小鼠的淋巴结中分离出的淋巴细胞，标记后，通过尾静脉注入正常SPF或无菌GF小鼠。图2为成年无菌小鼠淋巴结缺失RALDH阳性DC细胞。图3为肠道微生物是通过视黄醛脱氢酶RALDH+树突状细胞调节淋巴结发育。图4为CD103+CD11b+RALDH+DC样细胞来源的分析。图5为热带假丝酵母菌驱动肠道CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞向淋巴结转移。图中，纵坐标处的RALDH+CD103+即表示CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞。图6为热带假丝酵母菌的脂类提取物能够驱动BMDC向淋巴结转移。图7为热带假丝酵母菌的脂类提取物液相色谱分离所得第九段的液相色谱-串联质谱LC-MSMS分析结果。图8为第九段中某些分子结构上，中与内源性大麻素非常接近下，AEA。图9为相较于其他内源性大麻素，AEA和真菌脂肪萃取物能够较强地驱动CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞迁移。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、来自于热带假丝酵母菌的内源性大麻素AEA类似物可驱动肠道DC细胞向淋巴结转移一、淋巴细胞向淋巴结的回流在无菌小鼠中有缺陷从成年正常C57BL6小鼠的淋巴结中分离出的淋巴细胞，用CFSE标记后，通过尾静脉注入正常SPF或无菌GFC57BL6小鼠剂量是每个小鼠2×106细胞24小时后分离各类淋巴结，进行切片后荧光成像，或取得细胞悬浮液后通过流式细胞仪进行分析。结果如图1所示。左：注入的淋巴细胞向腹股沟淋巴结iLN，肠系膜淋巴结mLN和脾脏spl的回流，以及淋巴细胞亚型向iLN回流的分析左下。右：GF，SPF，和与SPF合笼后GF小鼠converted中iLN内高内皮微静脉HEV上MAdCAM-1和PNAd的表达。这个实验表明淋巴细胞向淋巴结的回流在无菌小鼠中有缺陷，其原因是没有PNAd的表达。二、成年无菌小鼠淋巴结缺失RALDH阳性DC细胞取5周正常SPF和无菌GFC57BL6小鼠的淋巴结进行染色对比，观察两者中RALDH阳性DC细胞的有无。结果如图2所示。上：与正常小鼠相比，成年的无菌小鼠的淋巴结里缺失一类视黄醛脱氢酶RALDH的树突状细胞。与SPF小鼠合笼饲养后，无菌小鼠外周淋巴结内又出现了RALDH阳性的细胞。下：综合数据分析。三、肠道微生物是通过RALDH+树突状细胞调节淋巴结发育从SPF级C57BL6小鼠淋巴结中分离RALDH+树突状细胞和RALDH-树突状细胞，通过尾静脉注入无菌GFC57BL6小鼠注入剂量为2×105细胞，七天后取淋巴结进行切片和流式细胞仪分析。结果如图3所示。上：SPF小鼠淋巴结中分离出的RALDH+树突状细胞或RALDH-树突状细胞，通过尾静脉注入无菌小鼠后，引起淋巴结体积的变化和出现成熟T，B区的成像。下：淋巴结大小，以及B区和T区面积的统计结果。这个实验证明肠道微生物是通过RALDH+这一类树突状细胞调节淋巴结发育。四、CD103+CD11b+RALDH+DC样细胞来源的分析肠道共生菌对免疫器官发育的作用可能不是直接的。肠道固有层内有一类非常规的树突状细胞，它们能够表达CD103、CD11b以及视黄醛脱氢酶RALDH。它们能与淋巴细胞产生接触，而这一过程对这些淋巴细胞的命运产生了很大的影响。从表面上看，淋巴结发育和上述过程似乎没有什么联系。我们实验室的前期工作发现，在新生小鼠淋巴组织诱导细胞消失的同时，如果肠道菌落及时出现，淋巴结里会出现一种CD103+CD11b+DC样的细胞。用正常小鼠中分离出来的这些细胞通过尾静脉注射进入无菌小鼠后，会促进后者淋巴结的发育和大量淋巴细胞进入淋巴结。这些树突状细胞高度表达视黄醛脱氢酶，并能够使淋巴结入口处血管上皮上表达一种叫外周淋巴递质素的物质，也可以看成是一个地址定位的标志。T和B细胞就是通过识别外周淋巴递质素进入淋巴结，形成淋巴结发育的。这个过程在小鼠出生时特别明显。然而在成年鼠中，淋巴结仍然有少量的这类树突状细胞，这些细胞维持了淋巴结长期的稳态。在维生素A缺乏的小鼠中，淋巴结这类树突状细胞消失，造成了结构的破坏。我们通过标记的方法证明这类树突状细胞来源于肠道，和我们上面说的肠道固有层内非常规的树突状细胞表达CD103，CD11b以及视黄醛脱氢酶是同一类型。具体方法如下：新生C57BL6小鼠用FITCDextran灌胃FITC-dextran2000KDSigma0.3毫克每克体重，6小时后通过流式细胞法检测外周淋巴结中CD11b和CD103单阳性，双阴性DN和双阳性DP树突状细胞的比例。结果如图4所示，由图可见CD11b和CD103双阳性树突状细胞的FITC信号最强，可见它们来源于肠道。五、热带假丝酵母菌驱动肠道CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞向淋巴结转移成年SPF级C57BL6小鼠在饮用水中混入混合抗生素仅抗细菌不抗真菌，1gL的氨苄青霉素，1gL的新霉素，1gL的甲硝唑和0.5gL的万古霉素，浓度表示在饮用水中的终浓度，Sigma或抗真菌药氟康唑fluconazole在饮用水中的终浓度为0.5gL，Sigma，三周以后取淋巴结进行流式细胞仪分析小鼠肠系膜淋巴结mLN和派伊尔淋巴集结PP内CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞的百分比。成年正常C57BL6小鼠分别用培养的三种肠道主要真菌——热带假丝酵母菌Candidatropicalis、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae和毛孢子菌Trichosporon灌胃每个小鼠每种菌108CFU24小时后，取淋巴结进行流式细胞仪分析小鼠腹股沟淋巴结iLN和肠系膜淋巴结mLN中CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞的百分比。同样的方法，对新生C57BL6小鼠和无菌C57BL6小鼠进行了该实验。结果如图5所示。左上：成年SPF小鼠在饮用水中混入混合抗生素或抗真菌药氟康唑fluconazole，三周以后肠系膜淋巴结mLN和派伊尔淋巴集结PP内CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞的百分比。右上：成年正常小鼠在用培养的热带假丝酵母菌Candidatropicalis、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae和毛孢子菌Trichosporon灌胃24小时后腹股沟淋巴结iLN和肠系膜淋巴结mLN中CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞的百分比。左下：类似右上，新生小鼠的结果。右下：类似右上和左下，成年无菌小鼠的结果。可见肠道微生物中的念珠菌热带假丝酵母菌，Ctropicalis驱动了CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞向淋巴结的转移。六、热带假丝酵母菌的脂类提取物能够驱动肠道CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞向淋巴结转移通过分离萃取方法取得各真菌和细菌真菌有热带假丝酵母菌、酿酒酵母和毛孢子菌，细菌为大肠杆菌的核糖核酸，蛋白质和脂类。这些分离物回注小鼠后，只有热带假丝酵母菌脂类能够驱动树突状细胞向淋巴结的转移。具体如下：氯仿-甲醇提取法提取真菌和细菌的脂类，其中真菌有热带假丝酵母菌Candidatropicalis、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae和毛孢子菌Trichosporon，细菌为大肠杆菌Ecoli。真菌或细菌在氯仿-甲醇体积比2:1中超声破碎，离心后用水洗去甲醇，利用氮气吹干氯仿后获得脂类提取物。将以上所得真菌和细菌的脂类提取物分别进行液相色谱分析，具体如下：层析柱：直径1.5cm，长度30cm；填料为硅胶200-300目，粒度45-75μm，孔径40-70A，比表面积400-600m2g，孔体积0.60-0.85mlg，常压充填。从5g湿重真菌或细菌萃取的脂类用100％氯仿30ml上样，然后用氯仿：甲醇体积比为10:0，8:2，6:4，5:5，3:7，0:10洗脱，前5个梯度每个洗脱30ml，每个平分成前后两个段落，最后一个梯度即第6个梯度洗脱45ml，平分成三个段落。以此形成1到13个段落。常温，自由落体，所有样本都用氮气吹干。脂类提取物经液相分离后，得到分段成分，液相分析得到的每一段与未分段的总脂类溶解在同样体积的DMSO中，进行Transwell实验脂类加入下层小室，脂质和培养液的比例1:1000测定各段吸引小鼠骨髓来源树突状细胞BMDC迁移的活性本领域技术人员明了BMDC的趋化和CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞相似，此处实验采用BMDC代替CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞的原因在于：后者很难取得足够的细胞数进行大量分析，再者，后者在培养液中的活性不好，不宜用于长期实验。结果如图6所示，A：各类真菌脂类的液相层析光谱；B：热带酵母菌中数个段落能诱导树突状细胞在体外的迁移，其中第九段最强。可见真菌中的脂类中相关活性可以通过液相进行浓缩和提纯。七、来自于热带假丝酵母菌的内源性大麻素AEA类似物的结构确定将Ctropicalis脂类提取物液相分离第九段，进行液相色谱-串联质谱LC-MSMS分析，ThermalX-caliber软件对WatersQTOF质谱仪的数据进行自动分析FullScanmode，得到脂质的分子构成。结果如图7和图8所示。图7中，上：Ctropicalis脂类提取物液相分离第九段液相色谱分析；N-花生四烯酸氨基乙醇AEA标准品液相色谱结果。下：AEA质谱结果；Ctropicalis脂类提取物液相分离第九段中LC-MSMS结果中提取的AEA同源物。图8中，上，中：第九段中某些分子结构分别如式I和式II所示。下：内源性大麻素AEA如式III所示分子结构。结果表明：Ctropicalis脂类提取物液相分离第九段含有内源性大麻素AEA同源物。根据LC-MSMS结果，其中的AEA同源物最接近于花生四烯酸正丙胺N-propylarachidonoylamine或花生四烯酸异丙胺N-isopropylarachidonoylamine。八、来自于热带假丝酵母菌的内源性大麻素AEA类似物能够驱动肠道CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞向淋巴结转移不同的内源性大麻素和Ctropicalis脂类提取物通过腹腔注射到4周大SPF级C57BL6小鼠。Ctropicalis脂类和大麻素的DMSO储液溶于PBS缓冲液用于注射。同样剂量的DMSO作为空白对照。处理时间一小时。流式细胞仪检测肠系膜淋巴结mLN中迁移性DC即CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞比例。Ctropicalis脂类用量每只小鼠250μg脂类对应的溶解于DMSO部分。结果如图9所示，可见：相较于其他内源性大麻素，AEA和Ctropicalis脂类提取物能够较强地驱动CD103+CD11b+RALDH+树突状细胞迁移。

权利要求：1.式I或式II或式III所示化合物或其可药用盐在如下A-D任一中的应用：A制备用于预防和或治疗免疫紊乱相关疾病的产品；B制备用于调节外周免疫系统功能的产品；C预防和或治疗免疫紊乱相关疾病；D调节外周免疫系统功能；2.式I或式II或式III所示化合物或其可药用盐在如下E-H任一中的应用：E制备用于驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移的产品；F制备用于促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能的产品；G驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移；H促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能；3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肠道来源的树突状细胞表达CD103、CD11b以及视黄醛脱氢酶。4.具有如下a-d所示功能中至少一种的产品，其活性成分为式I或式II或式III所示化合物或其可药用盐；a预防和或治疗免疫紊乱相关疾病；b调节外周免疫系统功能；c驱动肠道来源的树突状细胞向淋巴结转移；d促进淋巴结发育和或促进淋巴结发挥功能；5.化合物，如式I或式II所示：

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