申请/专利权人：大连理工大学

申请日：2018-04-19

公开（公告）日：2021-09-21

公开（公告）号：CN108546681B

主分类号：C12N5/09(20100101)

分类号：C12N5/09(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.09.21#授权;2018.10.16#实质审查的生效;2018.09.18#公开

摘要：本发明提供了一种细胞复刻表面及其应用，是可以用于血液中稀有细胞高纯度捕获的与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，在其表面还可以修饰有稀有细胞特异性识别抗体，在两者的协同作用下可实现稀有细胞的高效特异性捕获。本发明所述细胞复刻表面的制作工艺简单、制备成本低廉、其对稀有细胞有很高的捕获效率，并且特异性能优越，还具有不同稀有细胞类型的广谱捕获性。特别适用于捕获富集病人体内的稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞，对癌症预后、早期诊断、疗效评估、复发预测以及个体化治疗等都有着重要的指导作用。

主权项：1.一种细胞复刻表面，其特征在于，具有与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞；所述的微纳拓扑结构表面还修饰有待捕获的稀有细胞特异性识别抗体，是通过化学偶联法或生物亲和法连接修饰在微纳拓扑结构表面上，所述的待捕获的稀有细胞选自干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞；所述的微纳拓扑结构表面的制备方法包括以下步骤：通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养面上，并使模板细胞脱水收缩，将高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，高分子预聚物热固交联固化后，将其剥离得到微纳拓扑结构表面；所述的微纳拓扑结构表面的材料选自聚二甲基硅烷、过氧化聚吡咯和聚氨酯；所述模板细胞选自癌细胞、白细胞和吞噬细胞。

全文数据：细胞复刻表面及其应用技术领域[0001]本发明属于生物功能材料、分析检测技术领域，特别涉及在材料表面形成细胞复刻表面，并用于捕获血液中稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞的技术。背景技术[0002]血液中一些细胞的含量非常少，但是对于理解疾病很重要，比如干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。准确检测和分析这些稀有细胞，对理解疾病进程和发病机制非常关键，尤其是循环肿瘤细胞与癌症早期诊断密切相关。研宄表明90%的癌症死亡是由癌症转移引起的，循环肿瘤细胞CTCs是指从实体肿瘤病灶脱落，发生上皮-间质转化EMT后具有流动特性而进入外周血的肿瘤细胞。CTCs与癌症转移密切相关，因此直接从血液中捕获CTCs是一种微创性的检测手段，可以对化疗效果深入了解并能实现癌症的早期诊断。近年来，CTCs捕获技术主要分为物理法和生物化学法。物理法主要是利用癌细胞与正常血细胞在尺寸、密度等方面的差异对癌细胞进行分离。生物化学法基于免疫识别分离的原理，目前主要以上皮细胞粘附分子抗体Anti-EpCAM或核酸适配体为识别分子，磁性纳米颗粒或微流控芯片为载体实现对CTCs的捕获。虽然这些方法都具有一定的CTCs捕获效果，但也存在着各种不足。文献Small2015,ll，3850、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55，1252、Chem•Soc•Rev•，2017，46，4245综述了近年来CTCs捕获的方法和技术，也提出了一些存在的问题。如物理法分离纯度低;磁珠法操作复杂、不具备广谱性;微流控芯片制备成本高、细胞富集时间较长等。此外，中国专利CN201610760765.4、CN201380075303.3、CN2〇1580022705•6中报道的CTCs捕获技术也很难克服上述的问题。[0003]微纳米结构具有高比表面积和生物相容性，在不同的微纳米拓扑结构中，细胞表面形态作为多尺度、复杂且自然的微纳米结构，具有纳米尺度的丝状伪足和微米尺度的表面微凸体。因此，我们提出选用高分子材料，通过软刻的方法制备与模板细胞互补的微纳拓扑结构的细胞复刻表面，并将其应用于血液中稀有细胞的捕获。目前尚未有报道此种细胞复刻表面的制备方法及其应用。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种操作简便快捷，成本低廉并且具备高效捕获率及捕获纯度的细胞复刻表面。所述的细胞复刻表面，具有与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。[0005]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，其除了含有微纳拓扑结构表面之外，还具有修饰在此表面的稀有细胞特异性识别抗体，所述的稀有细胞特异性识别抗体为待捕获稀有细胞的特异性识别抗体，所述的待捕获稀有细胞选自干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。[0006]本发明上文所述的微纳拓扑结构表面是与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，其中，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。使得细胞复刻表面具有丰富的模板细胞丝状伪足的微纳米结构，通过微纳米结构与模板细胞的拓扑结构产生增强粘附效应，同时，辅以在其表面修饰稀有细胞特异性识别抗体，抗体特异性识别提高了待捕获细胞的捕获率并降低了血细胞的粘附。[0007]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的待捕获稀有细胞特异性识别抗体，是通过化学偶联法或生物亲和法连接修饰在微纳拓扑结构表面上的。所述的化学偶联法或生物亲和法为生物技术领域的常规技术。[0008]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的微纳拓扑结构表面的制备方法包括以下步骤:将上文所述的模板细胞接种在细胞培养面进行增殖培养其中，所述的细胞培养面通常为细胞培养基形成的平面）；所得的模板细胞通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养面上，并使模板细胞脱水收缩，再将高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，高分子预聚物热固交联固化后，将其剥离得到微纳拓扑结构表面;将所的微纳拓扑结构表面通过化学偶联法或生物亲和法连接上稀有细胞特异性识别的抗体获得终产品一一细胞复刻表面，可以广泛用于从血液中高效捕获目标的稀有细胞。[0009]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的制备方法中通过无水乙醇、无水结晶盐、多羟基化合物等脱水使模板细胞脱水收缩，从而得到更加坚硬、粗糙的表面结构。[0010]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的微纳拓扑结构表面是通过软刻的方法或细胞印记的方法得到与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构。所述软刻的方法是通过高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，热固交联固化后，剥离得到细胞复刻表面。[0011]所述传统软刻技术中的模板材料通常选用光刻法制备的人造图案化模板，而很少使用天然生物表面例如哺乳动物细胞，微生物等材料）的原因在于:天然生物表面不够坚硬，且含水量丰富的表面在软刻法制备过程中不易得到与模板材料互补的精细结构。为了克服上述技术问题，本发明创新的提出通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养皿或类似其他的细胞培养面上，并通过无水乙醇、无水结晶盐、多羟基化合物等脱水使细胞收缩，从而得到坚硬粗糙的模板细胞表面，这样就可以使用高分子材料软刻制备模板细胞复刻表面。[0012]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的微纳拓扑结构表面的材料为高分子材料，一般选自聚二甲基硅烷、过氧化聚吡咯和聚氨酯。[0013]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述模板细胞选自癌细胞、组织细胞、白细胞和吞嗟细胞。[0014]对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的与模板细胞互补的微纳拓扑结构所占面积不低于总面积的65%。[0015]本发明的另一方面在于保护上文所述的细胞复刻表面在高效捕获血液中稀有细胞中的应用。本发明通过选用高分子材料，由软刻技术来制备不同基底形貌的细胞复刻表面，在细胞复刻表面上连接待捕获的稀有细胞实施例中主要以癌细胞为例表面特异性识别的抗体。在细胞复刻表面拓扑作用与抗体特异性识别作用的协同下实现了对稀有细胞的高效特异性捕获。并且在全血中也达到较高的捕获率及捕获纯度，为之后的临床应用提供了可能。[0016]实验结果表明，本发明的细胞复刻表面对待捕获的稀有细胞能实现较高的捕获率，尤其是实施例中以癌细胞为例，其捕获率能达到73%，修饰特异性的抗体后，对抗体阳性癌细胞的捕获率可达到90%，对抗体阴性癌细胞的捕获率亦可达到72%，具有癌细胞广谱捕获能力。抗体修饰的细胞复刻表面对癌细胞的粘附性及特异性能优越，痕量CTCs人造血样的捕获效率可达85%，捕获纯度可达90%以上。[0017]有益效果:本发明公开一种用于血液中稀有细胞捕获的细胞复刻表面，其制备方法简单、制备成本低廉，在具体的应用实例中也表现出对稀有细胞的高捕获率，并且特异性能优越，在全血中也表现出稀有细胞高效捕获率及捕获纯度。本发明特别适用于捕获富集病人体内的稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞，对癌症预后、早期诊断、疗效评估、复发预测以及个体化治疗等都有着重要的指导作用。附图说明[0018]图1为本发明实施例1制备的细胞复刻表面的扫描电镜照片，比例尺为1M1。[0019]图2为本发明实施例1的细胞复刻表面和平面表面共聚焦显微镜的照片。其中A为平面表面的三维形貌图片;B为细胞复刻表面的三维形貌图片。[0020]图3为本发明实施例1的细胞复刻表面和平面表面对癌细胞的捕获效率柱状图。[0021]图4为本发明实施例2的抗体修饰后的细胞复刻表面对不同癌细胞系的捕获效率柱状图。[0022]图5为本发明实施例3的抗体修饰后的细胞复刻表面对不同数量CTCs人造血样的捕获效率及捕获纯度点状图。其中A为捕获效率点状图;B为捕获纯度点状图。[0023]图6为本发明实施例3的抗体修饰后的细胞复刻表面分别捕获癌细胞与白细胞后的扫描电镜照片，比例尺为5wii。其中A为被捕获的癌细胞扫描电镜照片;B为被捕获的白细胞扫描电镜照片。具体实施方式[0024]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。[0025]实施例1[0026]本实施例选用的模板细胞为人乳腺癌MCF-7细胞广州赛库生物技术有限公司），软刻材料为多聚物聚二甲基硅烷PDMS;通过考察细胞复刻PDMS表面与平面表面对癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：[0027]1细胞复刻PDMS表面的制备：[0028]将模板细胞MCF-7细胞以25000cellscm2的密度接种在培养皿中，并放置在37°C的C〇2细胞培养箱中，24小时之后用4%质量浓度的多聚甲醛溶液固定2〇分钟，固定后的细胞在无水乙醇中脱水30分钟并千燥，得到模板细胞表面。然后将PDMS预聚物浇筑在模板细胞表面，在80°C热固交联6小时后，剥离得到细胞复刻PDMS表面并通过扫描电镜观察（图1，复刻PDMS表面细胞的覆盖率为90%。[0029]此外，将细胞复刻PDMS表面与平面PDMS表面分别用白光共聚焦显微镜观察拍照，从三维形貌表面观测到细胞复刻PDMS表面粗糙度为12.3wn，而平面PDMS表面粗糙度仅为0.04um〇[0030]2准备待测的循环肿瘤细胞样品：[0031]人乳腺癌细胞MCF-7细胞在DMEM细胞培养基中培养。取细胞悬浮液100UL，用细胞计数器计数并计算其浓度;吸取一定量的上述细胞悬浮液，用DMEM培养基稀释至IX1〇5个细胞mL。[OO32]3捕获待测样品中的循环肿瘤细胞：[0033]将步骤D中的细胞复刻叩批表面放入细胞培养板中，然后将步骤2混合均匀的细胞悬浮液0•5mL滴加到PDMS表面，然后置于37°c的C02细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。[0034]4捕获效果的评价：[0035]60分钟后，将捕获的循环肿瘤细胞用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定20分钟，用磷酸盐缓冲液PBS清洗三次;然后用lOugmL的荧光染料DAPI溶液染色30分钟;最后在Olympus倒置荧光显微镜1〇倍下分别拍照，在不同视野下随机拍取20张荧光照片，利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。[0036]实验结果表明，使用软刻技术制备细胞复刻PDMS表面价格低廉、操作简单，可以得到微纳米尺度的细胞复刻表面图1。相比于平面PDMS表面图2A，细胞复刻PDMS表面具有更加粗糙的结构（图2B，并且对癌细胞的捕获率从平面表面的15%提高到了73%图3，表明该方法制备的细胞复刻PDMS表面具备粗糙的微纳米拓扑结构，可以用于循环肿瘤细胞的捕获。[0037]实施例2[0038]本实施例选用细胞复刻PDMS表面，利用生物素生物亲和素相互作用使基底材料连接上anti-EpCAM特异性抗体;通过考察细胞复刻pDMS表面对不同种类癌细胞的捕获效率，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：[0039]1细胞复亥表面的制备与实施例1相同：[0040]2生物亲和法连接anti-EpCAM特异性抗体：[0041]紫外臭氧处理细胞复刻PDMS表面10分钟使其亲水化，再将其放在细胞培养板中，加入质量浓度4%的正十八烷基三乙氧基硅烷溶液C18，乙醇稀释），室温反应45分钟后，分别用乙醇、水各清洗一次，磷酸盐缓冲液PBS清洗3次。加入〇.5mgmL的生物素化白蛋白biotin-BSA溶液PB__，3代浸泡％后，PBS清洗3次。加入10ugmL的亲和素溶液PBS稀释），37°C浸泡30分钟后，PBS清洗3次。最后加入含10ugmL的生物素化的anti-EpCAMPBS稀释），室温反应30分钟后PBS清洗3次，得到anti-EpCAM特异性抗体修饰的细胞复刻PDMS表面。[0042]3准备待测的循环肿瘤细胞样品：[0043]人乳腺癌细胞MCF-7细胞及人宫颈癌细胞Hela细胞均在DMEM细胞培养基中培养，另外人肺癌细胞AM9细胞及人肝癌细胞HepG2细胞均在RPMI-1640细胞培养基中培养二分别取各细胞悬浮液100UL，用细胞计数器计数并计算其浓度;吸取一定量的上述细胞悬浮液，用各自细胞培养基稀释至1X1〇5个细胞mL。[OO44]4捕获待测样品中的循环肿瘤细胞：[0045]将步骤2中修饰有anti-EpCAM特异性抗体的细胞复刻PDMS表面放入细胞培养板中，然后将步骤2混合均匀的各细胞悬浮液〇.5mL滴加到PDMS表面，然后置于37。〇的〇2细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。[0046]5捕获效果的评价：[0047]60分钟后，将捕获的循环肿瘤细胞用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定20分钟，用磷酸盐缓冲液PBS清洗三次;然后用i〇ygmL的荧光染料DAPI溶液染色30分钟;最后在Olympus倒置荧光显微镜1〇倍下分别拍照，在不同视野下随机拍取2〇张荧光照片，利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。[0048]实验结果表明，细胞复刻PDMS表面对anti-EpCAM阳性癌细胞MCF-7细胞和H印G2细胞）的捕获率可达到9〇%，对anti-EpCAM阴性癌细胞Hela细胞及A549细胞）的捕获率亦可达到72%图4。表明该方法制备的细胞复刻nMS表面可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获并且具有广谱性。[0049]实施例3[0050]本实施例选用化学偶联法修饰的anti-EpCAM特异性抗体细胞复刻PDMS表面为捕获体系，向全血中加入不同数量的MCF-7细胞为待捕获的CTCs人造血样模型;并对被捕获的癌细胞及白细胞进行扫描电镜观察，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：[0051]1细胞复刻PDMS表面制备方法与实施例1相同。[0052]2化学偶联法连接anti-EpCAM特异性抗体：[0053]细胞复刻PDMS表面紫外臭氧处理5分钟，放入细胞培养板中，加入质量浓度为4%的正十八烷基三乙氧基硅烷乙醇溶液，室温浸泡45分钟后，无水乙醇清洗一次、水清洗一次，并用氮气吹干。加入lmmolL的4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯GMBS，二甲基亚砜稀释），室温浸泡45分钟后，分别用二甲基亚砜DMS0、无水乙醇、水及PBS溶液各清洗一次。加入10ugmL的亲和素PBS稀释），室温浸泡30min后，PBS清洗3次。最后加入含10ugmL的生物素化的anti-EpCAMPBS稀释），室温反应30分钟后PBS清洗3次，得到anti-EpCAM特异性抗体修饰的细胞复刻PDMS表面。[0054]3准备待测的循环肿瘤细胞样品：[0055]取MCF-7细胞悬浮液1〇〇此，用细胞计数器计数，用DMEM细胞培养基稀释至1X103个细胞mL的浓度待用;取9mL新鲜抗凝血，平均分为9份，分别向其中加入癌细胞数量为10、20、50、100、200、400、600、800和1000的如?-7细胞，混合均匀。向：1^人造血样中加入红细胞裂解液北京索莱宝生物科技），并通过离心法分离杂质，最后得到含有MCF-7细胞的外周血单核细胞悬浮液，白细胞浓度约为0.8X1〇6个细胞mL。[0056]4捕获待测样品中的循环肿瘤细胞：[0057]将步骤2中anti-EpCAM特异性抗体修饰的细胞复刻PDMS表面放入细胞培养板中，然后将步骤2混合均匀的细胞悬浮液0.5mL滴加至l」PDMS表面，然后置于37°C的C02细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。[0058]5捕获效果的评价：[0059]捕获时间结束后，将捕获的细胞用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定20分钟，用磷酸盐缓冲液PBS清洗三次；用l〇ygmL的荧光染料DAPI溶液染色30分钟DAPI染料可以使被捕获的癌细胞与白细胞均带有蓝色焚光），然后用lOwgmL的Cytokeratin-FITC磷酸盐缓冲液染色6〇分钟Cytokeratin-FHC染料仅可以使被捕获的癌细胞带有绿色荧光）；最后在Olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照，在不同视野下随机拍取20张荧光照片，利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率及捕获纯度。[0060]6形态学分析：[0061]将捕获的细胞用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定20分钟，然后用体积浓度分别为10、30、50、70、90、100%的乙醇溶液梯度脱水。在扫描电镜下分别观察捕获的癌细胞与白细胞的形态。[0062]实验结果表明，anti-EpCAM特异性抗体修饰的细胞复刻PDMS表面对CTCs人造血样中癌细胞的捕获效率较高，平均能达到85%图5A;背景细胞粘附少，癌细胞的捕获纯度能达到92%图5B。扫描电镜图片显示，癌细胞在材料表面铺展面积较大，伪足伸展较长，增加了其在材料表面的粘附效果（图6A;而白细胞相对较圆，伪足几乎无伸出，铺展面积小，因此粘附在材料表面的白细胞很少（图⑽）。表明该方法可以实现从CTCs人造血样中高效特异性地捕获循环肿瘤细胞。[0063]对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

权利要求：1.一种细胞复刻表面，其特征在于，具有与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。2.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的微纳拓扑结构表面还修饰有待捕获的稀有细胞特异性识别抗体，所述的待捕获的稀有细胞选自干细胞、循环内^细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。3.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的待捕获的稀有细胞特异性识别抗体，是通过化学偶联法或生物亲和法连接修饰在微纳拓扑结构表面上。4.根据权利要求1或2所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的微纳拓扑结构表面的制备方法包括以下步骤:通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养面上，并使模板细胞脱水收缩，将高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，高分子预聚物热固交联固化后，将其剥离得到微纳拓扑结构表面。5.根据权利要求4所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的制备方法中通过无水乙醇、无水结晶盐、多羟基化合物脱水使模板细胞脱水收缩。6.根据权利要求4所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的微纳拓扑结构表面是通过软刻的方法或细胞印记的方法得到。7.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的微纳拓扑结构表面的材料选自聚二甲基硅烷、过氧化聚吡咯和聚氨酯。8.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于;所述模板细胞选自癌细胞、组织细胞、白细胞和吞噬细胞。9.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的与模板细胞互补的微纳拓扑结构所占面积不低于总面积的65%。10.利用权利要求1-9中任意一项所述的细胞复刻表面在高效捕获血液中稀有细胞中的应用。

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